（微生物学专业论文）纳豆芽孢杆菌分离及纳豆激酶活性的研究.pdf

摘要 纳豆是日本的一种传统食品，具有很高的营养价值，其主要的活性成分纳豆 激酶具有显著的溶解血栓的功能。纳豆激酶作为一种新型的溶栓药物，与目前临床上 常用的治疗血栓的药物链激酶、尿激酶比较，克服副作用大、体内半衰期比较短、价 格昂贵等局限性，具有安全性高、可口服、溶栓效率高、药效时间长等突出优点，具 有广阔的开发应用前景。本文主要是对筛选出的纳豆芽孢杆菌菌株展开生理学的相关 研究，探讨纳豆芽孢杆菌的蛋白酶特性、纳豆芽孢杆菌中纳豆激酶的分离及不同理化 因子对液体发酵产纳豆激酶的影响，为进一步的研究提供理论依据。 本文首先分离纳豆芽孢杆菌。因待分离菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，而纳豆枯草芽 孢杆菌具有耐盐耐热的特性，故将经高温处理的纳豆菌菌悬液稀释涂布于高盐培养基 上进行目的菌株的初筛，选择具有芽孢杆菌特征的革兰氏阳性菌株，将初筛菌株点种 于脱脂牛奶培养基进行复筛。最终由纳豆茵粉中获得1 株菌株，命名为b n ；由自制 纳豆中获得5 株菌株，分别命名为b n 1 、b n 2 、b n 3 、b n - 4 、b n 5 。对这6 株菌 株进一步进行生理生化鉴定试验，鉴定出这6 株纳豆菌均分属于枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 种。 对纳豆芽孢杆菌蛋白酶的特性进行了一系列的研究。筛选得到的6 株菌株均具有 产蛋白酶的能力。在p h 值、温度、金属离子等理化条件对b n - 4 菌株蛋白酶活性影 响的试验中发现：纳豆芽孢杆菌b n 4 菌株蛋白酶活力在p h 6 o 1 0 0 范围内变化不大， p h 低于5 o 和高于1 0 0 时酶活力显著下降；纳豆芽孢杆菌b n - 4 菌株蛋白酶作用的 最适温度为4 0 ，温度对蛋白酶活力的影响显著；5 m m o l l 终浓度的金属离子f 一+ 、 m n z + 、c u 2 + 、z n 2 + 对纳豆芽孢杆菌b n - 4 蛋白酶活力有明显的抑制作用，抑制率分别 为9 7 、8 3 、8 7 、9 9 ，而终浓度为5 m m o 儿的c 对蛋白酶活力有激活作用， 含k + s m m o l l 的b n - 4 菌株粗酶液蛋白酶活力是空白粗酶液蛋白酶活力的1 2 5 。 硫酸铵饱和沉淀法分离纳豆芽孢杆菌b n - 5 菌株粗酶液中的纳豆激酶，可先向粗 酶液中加适量的硫酸铵至3 0 硫酸铵饱和度，4 0 8 0 0 0 r r a i n 离心2 0 r a i n ，弃沉淀；向 上清液中继续加适量硫酸铵至7 0 的硫酸铵饱和度，4 c 8 0 0 0 r r n i n 离心2 0 r a i n ，弃上 清，沉淀即为初步分离得到的纳豆激酶。 用试管定量法分别测定了分离得到的6 株纳豆芽孢杆菌菌株粗酶液中的纳豆激 酶的纤溶活力，b n 、b n - 1 、b n 2 、b n - 3 、b n - 4 、b n - 5 菌株纳豆激酶纤溶活力分别 为：3 8 0 7 1 l g r n i n - 1 m l 、7 2 5 9 9 r r l l n 。1 m l 、1 5 0 0 6 9 9 心i m l 、5 5 7 0 1 1 9 面n 1 1 l l 一、 4 6 9 鹏m i n 血、4 9 4 甥m i n 1 m l 一。 为确定纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶的最佳条件，以普通发酵培养基为基 础，分别改变培养基的成分及含量，考察培养基组成对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆 激酶活力的影响：分别改变培养温度、培养时间等，考察培养条件对纳豆芽孢杆菌液 体发酵产纳豆激酶活力的影响。以3 的麦芽糖为碳源，1 5 的酵母膏为氮源， o 1 m g s 0 4 ，0 0 4 c a c h ，0 2 n a 2 i - i p 0 4 ，0 1 n 龇p 0 4 ，p h7 5 ，接种量为2 装 液量为3 0 m l 2 5 0 m l 的条件下，3 7 1 5 0 r r a i n 摇床培养第3 d 为产酶高峰期。优化后的 液体发酵产酶培养基产纳豆激酶活力比基础培养基的酶活力提高了1 5 倍。 关键词：纳豆芽孢杆菌，蛋白酶，纳豆激酶，条件优化 a b s t r a c t n a t t oi sat r a d i t i o n a lf o o di nj a p a nw i 也h i g hn u t r i t i o n a lv a l u e , a n di t sm a i na c t i v e i n g r e d i e n ti sn a t t o k i n a s ew h i c hi s an e wt y p eo ft h r o m b o l y t i cd r u g n a t t o k i n a s eh a s s i g n i f i c a n tt h r o m b o l y t i cf u n c t i o n , c o m p a r e d 、丽也s t r e p t o k i n a s ea n du r o k i n a s ew h i c ha r e t h ec u r r e n tc o m m o n l yd r u g su s e di nt h et r e a to ft h r o m b u s u s eo fn a t t o k i n a s ec a n o v e r c o m eal o to fl i m i t a t i o n ss u c ha sh i g hs i d ee f f e c t s ，s h o r th a l f - l i f e ，e x p e n s i v ea n ds oo n , a n dh a sm a n yo u t s t a n d i n ga d v a n t a g e s ，s u c ha sh i 曲s e c u r i t y , t a k i n gb yo r a l ，h i g h t h r o m b o l y s i se f f i c i e n c y , l o n ge f f e c tt i m e s on a t t oh a sb r o a dp r o s p e c t sf o rd e v e l o p m e n t a n da p p l i c a t i o n i no r d e rt op r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c h , m a n yb a c i l l u s s u b t i l i sn a t t os t r a i n sw e r es e l e c t e d ，s o m er e l a t i v ep h y s i o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c sw e r e d e t e r m i n e d , t h ec h a r a c t e r i s t i c so fb a c i l l u ss u b t i l i s r i a l t op r o t e a s ew e r es t u d i e d , t h e n a t t o k i n a s ef r o mb a c i l l u ss u b t i l i sn a t t os t r a i n sw a sp u r i f i e d , a n dl i q u i df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so fn a t t o k i n a s cw e r eo p t i m i z e d f i r s t l y , e x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e dt oi s o l a t e db a c i l l u ss u b t i l i sn a t t os t a i n s a c c o r d i n g t ot h ec h a r a c t e r i s t i c so fh e a tr e s i s t a n c ea n ds a l tr e s i s t a n c eo fas u b t i l i sn a f f os t r a i n s ， s a m p l e ss u s p e n s i o nw i t hb a c i l l u ss u b t i l i sn a t t ob a c t e r i aw e r eh e a t - t r e a t e d ，t h e nd i l u t e dt o s p r e a di nh i g h - s a l tm e d i u mt oo b t a i nb n a t t os t r a i n s t h o s eg s t r a i n s ，w h i c hh a v et h e c h a r a c t e r i s t i c so fb a c i l l u s , w e r es e l e c t e da n dp o i n t e do nt h es k i mi n j 狄m e d i u mt os c r e e n f o rb a c i l l u ss u b t i l i sn a t t os t r a i n s f i n a l l y , o n es t r a i n , b n ，w a so b t a i n e df r o mn a t t od u s t p r o d u c t , a n df i v es t r a i n s ，n a m e da sb n - i ，b n - 2 ，b n - 3 ，b n - 4 ，b n - 5 ，w e r eo b t a i n e df r o m f a m i l yn a t t o f i f t e e np h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l t e s t sw e r ed e s i g nt oi d e n t i f yt h e s es i x s t r a i n s ，a n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l lt h e s es i xs t r a i n sb e l o n gt ob a c i l l u s 跗b f i l i sn a t t o t h ec h a r a c t e r i s t i c so fb a c i l l u ss u b t i l i sn a t t op r o t e a s ew e r ep r o v e d a l lt h e s es i x s t r a i n sh a v ep r o t e i n a s ea c t i v i t i e s t e s t sa b o u te f f e c to fp h y s i c a la n dc h e m i c a lc o n d i t i o n s s u c ha sp h , t e m p e r a t u r e ，m e t a li o n so nb n - 4p r o t e a s ea c t i v i t yw e r ep e r f o r m e d , a n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o t e a s ea c t i v i t yo fb n 一4w a ss t a b l ei nt h es c o p eo fp h 6 0 - - 10 0 t h eb n - 4p r o t e a s ea c t i v i t yd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw h e np hb e l o w5 0o rh i g h e rt h a n lo 0 ， a n dt h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 0 c 啊1 ep r o t e a s ea c t i v i t yw e r es i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e db y5 m m o l lo fm e t a li o n ss u c ha sf e 3 + ，m n 2 + ，c u 2 + ，z n 2 + ，a n dt h ei n h i b i t i o nr a t e w e r e9 7 ，3 ，8 7 ，9 9 r e s p e c t i v e l y b u tt h ep r o t e a s ea c t i v i t yw a sa c t i v a t e db y 5 m m o l lo fk + ，w i t hi n c r e a s er a t ea s1 2 5 t e s t sa l s os h o w e dt h a t2 0 p g m lf i n a l c o n c e n t r a t i o no fa n t i b i o t i cs u c ha sn y s ，e r y t h r o m y c i n , g e n t a m i c i nh a dn oe f f e c t so nt h e p r o t e a s ea c t i v i t yo fb n - 5 n es a t u r a t e da m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o nm e t h o dw a su s e dt op u r i f yt h e 1 1 1 n a t t o k i n a s ef r o mt h ec r u d ee n z y m el i q u i do fb n - 5 a m m o n i u r ns u l f a t ew a sa d d e dt o 也e c r u d ee n z y m es o l u t i o na t3 0 。a n dt h es o l u t i o nw a sc e n t r i f u g a t e di n4 ca t8 0 0 0 r r a i nf o r 2 0 m i n , p r e c i p i t a t i o nw a sd i s p o s e d t h e na m m o n i u ms u l f a t ew a sa g a i na d d e dt ot h e s u p e m a t a n ta t7 0 a m m o n i u ms u l f a t es a t u r a t i o n , t h es o l u t i o nw a sc e n t r i f u g a t e da g a i ni n4 a t8 0 0 0 r r a i nf o r2 0 r a i n , t h ep r e c i p i t a t i o nw a st h es a m p l eo f n a t t o k i n a s e 乃et u b em e t h o dw a sd e s i g n e dt od e t e r m i n et h en a t t o k i n a s ea c t i v i t yf o rs i xb a c i l l u s s u b t i l l sn a t t os t r a i n si nt h i se x p e r i m e n t t h en a t t o k i n a s ea c t i v i t yo fb n ，b n - 1 ，b n - 2 ，b n - 3 ， 劭“，b n 5w e r e3 8 0 7 i - t g r a i n q m l 一，7 2 5 1 x g r a i n 1 m l 1 ，1 5 0 0 6 1 x g m 酊1 m l 1 ， 5 5 7 0 i t g m i n 1 m l 一，4 6 9 肛g r a i n l - n i l ，4 9 4 鹏m i n - 1 m l ，r e s p e c t i v e l y b a s e do nc o m m o nf e r m e n t a t i o nm e d i 呱t h ec o m p o s i t i o na n dc o n t e n to ft h em e d i u m w e r ev a r i e ds e p a r a t e l y , a n dt h ee f f e c t so fm e d i u mc o m p o s i t i o no nt h en a t t o k i n a s e p r o d u c t i o no fb n 3 s t r a i ni nt h el i q u i df e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d t h ee f f e c t so f t e m p e r a t u r ea n dt i m e o f ft h en a t t o k i n a s ep r o d u c t i o no fb n 一3s t r a i ni nt h el i q u i d f e r m e n t a t i o nw e r ea l s os t u d i e d 1 1 1 eo p t i m u mc o n d i t i o nf o re n z y m ea c t i v i t yw e l ea s f o l l o w i n g ：m a l t o s e3 ，y e a s te x t r a c t1 5 ，m g s 0 40 1 ，c a c h0 0 4 ，n a 2 h p 0 40 2 ， n a i l 2 p 0 40 1 ，p h7 5 ，i n o c u l u mv o l u m e2 ，m e d i u mv o l u m e3 0 m l 2 5 0 m l ，3 7 。ca n d s h a k i n ga t 15 0 r r a i n 功ee n z y m ep e a kv a l u ea p p e a r e da tt h et h i r dd a y 砀eo p t i m i z e d m e d i u ma n dc u l t u r a lc o n d i t i o ne n h a n c e dt h ea c t i v i t yo f n a t t o k i n a s eb y1 5t i m e s k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i sn a t t o ，p r o t e a s e ，n a t t o k i n a s e ，o p t i m i z a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：i 釜：】：五i时间：矽汐夕年钼7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，l l p ；学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师繇2 塾蟹帆卵年月日 1 文献综述 1 1 纳豆简介 纳豆( n a t t o ) 是日本的一种传统食品，由纳豆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 在一定温度、 湿度下发酵蒸煮大豆制备而成，食用纳豆已有两千多年的历史。新鲜纳豆色泽金黄， 口感酥软，表面覆有一层粘性物质，挑起时有长长的拉丝状物质，风味独特，营养丰 富，具有多种保健功能，深受日本人民的喜爱，在民间一直作为药食同疗的食品【m 】。 纳豆被认为是日本人长寿的秘诀，具有很高的营养价值，含有丰富的蛋白质和氨 基酸，其多种营养成分如蛋白质、纤维、钙、铁、维生素等的含量均高于煮熟的大豆， 特别是维生素b 2 的含量是蒸煮大豆的6 倍，可见将大豆加工成纳豆后营养价值倍增， 其中纤维、钙、铁等多种成分的含量甚至超过鸡蛋和牛肉m ；纳豆中还含有较高的 生物活性物质，如纳豆激酶、异黄酮、超氧化物歧化酶( s o d ) 、皂甙素、生育酚、吡 啶二羧酸等，其中含有的纳豆菌更是其他食品中所没有的。纳豆作为一种具有食品、 生物等多种功能的微生态健康品，在日本享有“蔬菜干酪 的美誉，可与欧美的干酪 媲美，且因其具有高蛋白和低价格的特点，又被人们称为“田野的肉 【7 一。 纳豆的语源来自日本平安时代( 7 9 4 - 1 1 9 2 年) ，当时寺庙的厨房都称做“纳所一， 纳豆来自僧人的素食。传说是鉴真和尚将中国云南的豆豉传到日本，后变成纳豆，是 人们日常食用的方便食品。1 9 8 6 年须见洋行博士把纳豆放在纤维蛋白的平皿上，发 现3 7 培养后纳豆具有很强的溶解纤维蛋白的功能，从而发现了纳豆的溶解纤维蛋 白能力。此功能一经发现就受到学者们的广泛关注，近年来大量的研究证实纳豆具有 多种医疗保健功能，常食纳豆不仅能有效预防和治疗心脑血管疾病，而且还具有强身 健体、防癌抗癌、调整肠功能、延缓衰老等功效【9 l o l 。 纳豆在日本方兴未艾，在与之相邻的韩国也有纳豆上市，并得到不少人的喜爱， 在美国，与纳豆相类似的一种印尼豆类食品日益成为美国人欢迎的健康食品，现在纳 豆已逐渐成为各国喜爱的方便食品、健康食品。 1 2 纳豆中的微生物纳豆菌 由纳豆中分离得到的微生物为纳豆菌( b a c i l l u sn a t t o ) ，经菌种鉴定属芽孢杆菌属， 称为纳豆枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i sn a t t o ) ，具有枯草杆菌的形态特征，是好氧的 革兰氏阳性菌【l l 】。 1 9 0 5 年浞村将产生纳豆粘性物质的一类菌作为独立的纳豆菌提出。由于其生理生 化等许多性质与枯草杆菌相似，故( b e r g e y 细菌学鉴定手册( 第八版) 【黯】中将纳豆菌 归于枯草杆菌。后来有学者对纳豆菌和枯草杆菌的d n a 碱基组成和碱基排列做了比 较，发现两者的同源性非常高，从分子生物学上证明了纳豆菌和枯草杆菌属同一种类。 但由于用纳豆菌以外的枯草杆菌接种蒸煮大豆不能产生纳豆特有的粘性物质，故在纳 豆菌制造领域仍广泛使用纳豆菌( b a c i l l u s 蒯d ) 这一名称【l 引引。 纳豆菌是对人体无病原性的安全菌株，纳豆作为健康食品在日本食用了两千多年 更是充分证明了这点。研究结果表明纳豆菌具有多种功能，首先具有抗菌作用，纳 豆茵可产生杆菌肽、多粘菌素、2 ，6 一吡啶二羧酸等多种抗菌素，起到抑制沙门氏菌、 伤寒菌和痢疾菌等致病菌的效果；其次纳豆菌可以使肠道酸化从而促进铁、钙及维生 素d 等的吸收( 1 6 】；除此之外纳豆菌的代谢物还具有多种功能，如降血压、抗肿瘤、 抗氧化性、溶血栓等。纳豆菌的抗菌物质更具有安全性高、抗菌谱广等其他药品所不 具备的优点，故纳豆菌因其独特功效被称为人类的“第一益生菌 0 0 a 7 。 1 3 纳豆激酶的研究进展 纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n k ) 是纳豆菌在纳豆发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白 酶，具有良好的纤溶活性和溶栓能力，是一种具有高纤溶活性的激酶，可用于治疗和 预防血栓病。 1 3 1 纳豆激酶的结构i 埔】 1 3 1 1 纳豆激酶的基因结构 1 9 9 2 年n a k a m u r at 首先在大肠杆菌饵c o l o 宿主载体系统中克隆得到了n k 基因 ( 又称枯草杆菌蛋白酶n a t 基因，a p r n ) 的全长序列，报道了1 4 7 3 b p 的n k 全基因序 列，包括其中的调控顺序i t 9 l 。n k 基因从第1 8 1 个碱基开始，以g t o 为起始密码子， 起始密码子上游是核糖体结合位点s d 序列，下游是1 1 4 3 b p 组成的分为3 个部分的 开放阅读框架( o r f ) ：信号序列( s i g n a ls e q u e n c e ) ，编码2 9 个氨基酸残基组成的信号 肽( s i g n a lp e p t i d e ) ：前序列( p r os e q u e n c e ) ，编码7 7 个氨基酸残基组成的前肽( p r o p e p t i d e ) ；成熟序列( m a t mg e n e ) ，编码2 7 5 个氨基酸残基组成的成熟肽( m a t u r e p e p t i d e ) 。结构基因的3 末端为连续的3 个终止密码子1 = 从，t a g ，t m 。 1 3 1 2 纳豆激酶的蛋白质结构 1 9 9 3 年须见洋行等用反向i - i p l c 层析法分离出纳豆激酶，并对其氨基酸序列进 行了测定，发现纳豆激酶由2 7 5 个氨基酸组成，呈单链结构，无二硫键。与n a d a m u r a 等根据测定的核苷酸序列而推导出的氨基酸序列完全一致 2 0 2 n 。 根据h i ( 基因的d n a 序列推出其氨基酸序列的一级结构，结构显示：纳豆激酶 是一种单链多肽酶，含有8 个赖氨酸残基，肽酶可将其水解成9 个小肽，该酶的活性 部位在舢p 3 2 ，h i s 6 4 ，s e r 2 2 1 处，底物结合部位在s e r l 2 5 ，l e u 2 6 和g l y l 2 7 处。 将n k 的分子结构与已报道的枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 相比较，发现n k 与大 多数枯草菌素在核苷酸序列和氨基酸组成上具有高度同源性【冽。 1 3 2 纳豆激酶的理化特性 1 3 2 1 纳豆激酶的分子量 纳豆激酶是一种单链多肽酶，测定分子量的技术方法不同，所测得到的分子量也 有明显不同。须见洋行就曾经得到过2 个不同的结果，他采用s e p h a d e x ( 3 2 1 0 0 柱凝 2 胶过滤法，得到的结果为2 0 0 0 0 ，后来在另外文章中发表的分子量则为3 5 0 0 0 1 1 。f u j 妇 等团】根据推出的纳豆激酶的氨基酸顺序计算出该酶准确的分子量为2 7 7 2 8 ，目前以这 个结果为准。 1 3 2 2 纳豆激酶的理化性质 纳豆激酶的等电点为8 6e 0 3 ，n k 在p h6 o 1 2 o 区间内比较稳定，p h 低于5 o 时很不稳定。4 0 保温3 0 m i n 酶活无损失，温度超过5 0 时活力逐渐丧失，温度超 过6 0 时则因蛋白变性而迅速失活；甘油、丙二醇、牛血清蛋白和海藻酸钠等的添 加有利于提高酶的热稳定性瞄】，若添加明胶，可使其热稳定性提高5 倍以上。研究表 明，冻融对n k 活性影响不大，反复冻融5 个循环，酶活性仍保持9 5 以上。当n k 与煮沸过的小麦或大米提取液、肉汤以及血清蛋白和胃粘液蛋白混合后，稳定性显著 提高，甚至在酸性条件下仍保持有酶活性阮明。n k 的活性不受5 m m o l l 半胱氨酸( c 弼 的影响，但l m m o f l 二异丙基氟代磷酸酯( d f p ) 、5 m m o l l 敌百虫( n e g u r o n ) 及5 m m o l l 苯甲基磺酰氟( p m s f ) 则能完全抑制该酶活性，这也验证了n k 是一种丝氨酸蛋白酶 瞄】。c u e + 、z n 2 + 和舢3 + 等金属离子对n k 有明显的抑制作用，h g 甸使其完全失活， 而m 矿和c 0 2 + 对该酶则有显著的激活作用。此外，n i t 还可与血浆q2 巨球蛋白按2 ：l 的摩尔比结合而失去活性【2 4 j 。 1 3 2 3 纳豆激酶的底物特异性 纳豆激酶有其特异的水解蛋白的氨基酸作用和识别位点。s u m i i 】发现纳豆激酶最 敏感的底物为血浆纤维蛋白溶酶s - 2 2 5 1 ，对凝血酶底物s - 2 2 3 8 和激肽释放酶底物 s - 2 3 0 2 也具有一定的活性，而对尿激酶底物s 2 4 4 4 和弹性蛋白酶底物s 2 4 8 4 则明显 无活性；f 哂i 如的研究表明n k 对枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶的底物 s u c a l 扣a l a - p r o p h e p n a 也有高度水解活性。对n k 酶切特性的研究表明n k 具有严 格的识别位点及限制性酶切位点，首选酶切位点在l e u l 5 一t y r l 6 ，其次在s e r 9 h i s l 0 ， 在g l n 4 h i s 5 及h i s 5 l e u 6 也有微弱的水解活性田j 。 1 3 3 纳豆激酶的分离纯化 纳豆激酶的分离纯化方法很多，传统方法多采用蛋白质分离纯化技术，如盐析沉 淀，凝胶过滤等幽捌。但传统方法往往存在很多缺点，如纯化步骤较多、时间长、回 收率不高、不利于大规模工业化生产等。一些新技术在纳豆激酶分离纯化的研究中逐 渐被采用，如膨胀床吸附、金属螯合亲和分离、反胶束萃取和磁性微球分离等，为纳 豆激酶的工业化生产提供了高效新手段。 1 3 3 1 膨胀床吸附( e x p a n d e db e da c l s o r p f i o n ) 法 膨胀床吸附技术是根据静电吸附的原理，用s t r e a m l i n es p 阳离子交换吸附剂将 纳豆激酶从发酵液中分离出来。该法将固液分离、目标产物的浓缩和初步纯化在一个 单元操作中完成，充分体现了分离过程的集成优势。h u 等将发酵液上清用膨胀床吸 3 附分离，不仅大大简化了分离过程，而且使得纳豆激酶的回收率达到了9 5 t 3 0 1 。 1 3 - 3 2 金属螯合双水相亲和分配( i m m o b i l i z e dm e t a la f f i n i t yp a r t i t i o n ) 法 3 l 】 此法的原理是利用二价或三价金属离子对纳豆激酶氨基酸序列中存在的 - h i s g l y - t h r - h i s 结构进行螯合亲和作用，再引入双水相分配系统中达到分离的目的。 该法操作在水相中进行，具有分离条件温和、选择性好和与生物质兼容性好等优点。 1 3 3 3 反胶束萃取( r e v e r s em i c e l l e se x t m c t i o n ) 法1 3 2 反胶束萃取法是针对生物活性成分的一种液液萃取体系，具有步骤少、选择性 强、成本低和易于放大等传统蛋白质分离纯化手段所不具备的优点，自2 0 世纪7 0 年代末反胶团概念提出到现在，一直是生化工程领域研究的热点【3 3 j 。 此法的原理是将表面活性剂溶于非极性有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓 度，在有机溶剂内形成一个内核亲水的聚集体，从而使极性亲水物质可以进入聚集体 内得到分离。纳豆激酶分子小，空间位阻小，易于进入反胶团，以纳豆激酶的氨基酸 类酶活抑制剂作为亲和配基，利用亲和反胶团萃取来增加萃取的选择性，可方便地分 离出纳豆激酶。 1 3 3 4 磁性微球分离( m a g n e t i cb e a ds e p a r a t e ) 法 磁性微球是一种新型生物分离技术，微球由磁性的内核和高分子外壳两部分组 成，高分子外壳上的多样性功能基团可与多种生物活性物质偶联，再通过在外加磁场 中微球的定向移动达到快速分离的目的。 磁性微球适用于温和条件下复杂生物体系的快速分离，尤其是对蛋白质进行纯 化。与传统的分离纯化工艺相比，具有高效、快速等优点。y a n gc h e n l i 等【1 6 j 应用超 顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 微球从发酵液中纯化纳豆激酶只需4 0 r a i n ，纯化因 子与酶活回收率分别为8 7 和8 5 【3 4 j 。 1 3 3 5 发酵与泡载分离相耦合法 该方法是在发酵过程中利用泡沫分离法对蛋白或酶进行富集分离。该法将发酵 与分离相耦合，且解除终产物的反馈抑制作用，可大大缩短生产周期、提高酶活，已 经成为生物分离技术中的一个研究热点。韩润林等采用这种方法将酶的产率提高了 3 0 t 3 5 l 。 1 3 4 纳豆激酶的溶栓机制 纳豆激酶主要是通过以下4 方面的机制溶解血栓，发挥治疗血栓的疗效【3 6 l 。 1 3 4 1 纳豆激酶的直接溶栓作用 n k 最早就是以其显著的体外溶栓效果被发现的【3 7 t 3 引。纳豆激酶作为一种丝氨酸 蛋白本身就具有水解纤维蛋白的作用；纳豆激酶的主要酶切位点在l c n - t y r 之间，其 次在s e r - h i s 位点间，较微弱水解g l u - h i s 和h i s - l c n 位点【3 7 - 3 引，通过直接作用于交联 纤维蛋白血栓的上述氨基酸位点使纤维蛋白水解成可溶性的小分子，达到溶解血栓的 4 目的。f u j i t a 等对纳豆激酶降解人纤维蛋白原和交联纤维蛋白进行深入的研究1 3 9 也表 明纳豆激酶具有直接降解血栓的作用。 1 3 4 2 激活血管内皮细胞产生t - p a 组织型纤溶酶原激活剂( t - p a ) 在体内纤溶系统中起着重要的调控作用，它可激活 体内的纤溶酶原形成纤溶酶，而纤溶酶可将已形成的纤维蛋白栓子溶解。大量研究表 明脚1 1 ，纳豆激酶通过刺激血管内皮细胞产生内源t - p a 而增加t - p a 含量，再由t - p a 激活纤溶酶原产生新的纤溶酶溶解血栓，起到溶栓治疗作用。 1 3 4 3 纳豆激酶激活尿激酶原形成尿激酶 须见洋行等研究发现纳豆激酶可激活体内尿激酶原( p r o u r o k i n a s e ) 转交为尿激 酶【4 l 】。尿激酶是一种纤溶酶原激活剂，可激活纤溶酶原产生纤溶酶进而增加内源纤溶 酶，增加体内溶栓作用。 1 3 4 4 纳豆激酶的间接溶栓作用 最近研究发现【4 2 舶】，n k 可水解纤溶酶原激活剂的i 型抑制剂( p ! 甜一i ) ，使其失 活。蹦一i 是体内调控纤溶系统平衡的主要因子，具有通过降解t - p a 来调节体内纤 溶酶原激活形成纤溶酶的作用。故纳豆激酶可通过降解和失活p ：舭一i 间接使纤溶作 用增强。 1 3 5 纳豆激酶活性的测定方法 目前纳豆激酶溶栓活力的测定方法主要有琼脂糖一纤维蛋白平板法、纤维蛋白块 溶解时间法( c l t ) 、血清板法、四肽底物法、酶联反应吸附法等，这些纳豆激酶溶栓 活力的测定方法各有优缺点，如今普遍使用的仍是经典的平板法和c l t 法【4 5 阄。 1 。3 5 1 琼脂糖钎维蛋白平板法 琼脂糖一纤维蛋白平板法是根据a s t r u p ( 1 9 5 2 ) 方法改进的，是目前最常用的纤 溶酶溶栓活力测定方法【4 7 1 ，此法的原理是用琼脂糖作为固体支持，以凝血酶和纤维蛋 白原制做人工血栓平板，注入n k ，用溶解圈垂直直径的乘积( m m 2 ) 表示纤溶活力， 以标准u k 或纤溶酶为标准品作标准曲线，计算出n k 的活性相当于标准品的单位数 【4 8 l 。此法简便易行，并可同时测定多个样品，但由于溶解圈面积受恒温反应时间的影 响很大，所以对恒温时间的控制十分重要，且恒温时间对粗制酶活性测定的影响比对 n k 精制产品活性测定的影响大1 4 9 】。 1 3 5 2 纤维蛋白块溶解时n ( c l t ) 法 此法是由纤溶酶、u k 等溶血栓物质的活性测定方法改进得到的【4 引，首先测定标 准品不同活力单位对等量纤维蛋白的溶解时间，以活力单位对溶解时间作图，再测出 纳豆激酶的溶解时间，从标准曲线中计算出相当于标准品的单位数。纤维蛋白溶解时 间( c 的测定方法是在0 1 2 下，依次向小试管中加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶 液、n k 溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于3 7 1 2 恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计 时，到气泡停止冒出时，作为纤维蛋白溶解时f 司( c l t ) 。此法迅速快捷，分辨率较大， 更适于粗酶的活性测定，但不适合灵敏度要求较高的样品的活性测定，也不方便多个 样品的同时测定【4 9 】 1 3 5 3 血清板法 血清板法是根据纤维平板法改进得到的【5 0 1 。血栓纤维在6 5 5 n m 处有最大吸光度 值，n k 的加入使纤维溶解吸光度也相应降低，且吸光度的减少同n k 的浓度成线性 关系。该法简便快捷，样品消耗小，成本低，可信度高，可同时测定多个样品。但人 工血栓的制备对吸光值的测定有一定影响，一般认为当反应开始时小孔内的血栓的吸 光值在0 2 以上，人工血栓的制备对o d 6 5 5 值影响不大。 1 3 5 4f l i o n 酚法 此法是以经典的测定枯草芽孢杆菌的蛋白酶活力方法为依据的。f l i o n 酚试剂在 碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色( 钼蓝与钨蓝的混合物) 。酪蛋 白经蛋白酶水解作用后产生的含有酚基的氨基酸( 如酪氨酸、色氨酸等) 与f l i o n - 酚反 应产生蓝色化合物，通过测定蓝色化合物在6 8 0 r i m 处的吸光度可以推断酶活力的大 小。此法简单易行，可以同时测多个样品，成本低，但需要严格控制酶解时间，且不 能完全表示为纤溶酶活力，有实验证明此法测得的蛋白酶活力与纤溶活力之间存在一 定的相关性1 5 。 1 3 5 。5 酶联免疫吸附法( e l i s a ) 1 5 2 】 该法是先对n k 进行处理使其形成一种特殊结构，再通过标志酶即过氧化 物酶的反应来测定n k 的活性。该法灵敏度很好，特异性高，但操作复杂，成本高。 1 3 5 6 四肽底物法 四肽底物法由枯草杆菌蛋白酶e 的酶活测定方法 5 3 1 改进得到。在四肽底物s u e a l a a l a p r o p h e 。p n a 溶液中加入n k 溶液，置于3 7 水浴中l m i n ，测定单位时 间内4 1 0 n m 处光吸收值的变化。该法简单易行可迅速测定酶的活性，但该法得到的 蛋白酶活性并不能完全表示其溶纤维活性【5 4 。 1 3 5 7 聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法 赵明等1 5 5 1 在琼脂纤维蛋白平板的基础上，用聚丙烯酰胺代替琼脂作载体，用平板 电泳制胶模具代替玻璃或塑料平皿，制作出能严格控制厚度、均匀的薄层聚丙烯酰胺 纤维蛋白平板，用蛋白染色法指示纤维蛋白溶解情况。此法具有灵敏度高、易于标准 化、样品用量少、操作简便及可定量分析等优点，适用于纤溶酶类药物的初筛、跟踪 检测活性成分和测量相对纤溶酶活性等。 1 3 5 8 试管法【刈 试管法是一种比较快捷的活性测定方法。在直径1 5 r a m 的硅化试管中依次加入 p h 值为7 7 的咪唑缓冲液、纳豆激酶收集液、凝血酶和纤维蛋白原，立即振摇数秒， 6 使之产生絮状物，置3 8 0 水浴3 0m i l l ，置冰水中终止反应。用1 0 0 目尼龙网过滤试管 中未溶解的纤维蛋白，滤纸吸干，用蒸馏水漂洗，再用滤纸吸干，放入小试管中，再 加3 m l 浓度为o 2m o l l 的n a o h 溶液，在沸水中煮至1 5 r a i n ，冷却。用分光光度计 测定溶液在2 8 0 n m 处的吸光值，并根据活力计算公式计算纤溶活力。 纤溶酶活力= 彳对照一彳样品 0 5m l 3 0r a i n 3 1 0 0 0 肛g 1 3 6 纳豆激酶发酵的研究 目前我国许多高校和科研机构都对纳豆激酶的发酵条件进行了研究。 梁淑划5 7 1 对液体深层发酵产纳豆激酶的条件进行了优化，结果表明深层发酵的最 佳培养基配方为葡萄糖2 ，大豆蛋白胨l ，n a 2 h p 0 4 0 6 ，n a h 2 p 0 4 0 1 ， m g s 0 4 0 0 5 ，c a c h0 0 2 ；最佳培养基起始p h 值为7 0 ，接种量为3 ，最适发酵 温度为3 5 。在此条件下，5 0 0 m l 摇瓶、5 0 l 罐和5 0 0 l 罐发酵酶活最高分别达到 1 9 0 3 i i ，m i ，、2 2 1 0 1 u m l 和1 9 3 4 i iy ，m i ，。 祖国仁等【诣】对纳豆茵固体发酵的条件进行研究，确定了最佳工艺条件，将浸泡后 的大豆于1 2 1 高压蒸煮3 0 m i n ，按2 的接种量接入纳豆菌，于3 7 发酵2 4 h 后置 于4 冰柜后熟2 4 h 。成熟的纳豆产品纳豆激酶活力可达6 7 0 1 5 i u g 湿纳豆。 黄占旺等【5 9 】对采用米曲霉、纳