（微生物学专业论文）耐高温木聚糖酶基因在两种酵母中的分泌表达.pdf

摘要 本研究以海栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m a ) m s b 8 菌株基因组d n a 为模板，通过p c r 获得木聚糖酶( x y l a n a s e b ) 基因m x y n b ( “) 和m x 3 m b ( s 7 7 ) 。经与k a r e ne n e l s o n 等人在g e n b a n k 中注册的木聚糖酶基因x y n b ( a f l 0 0 0 6 3 ) 进行同源性比较得知，吁酶6 4 ) 的第6 4 位碱基由腺 嘌呤( a ) 转变为鸟嘌畸( g ) ，因此该基因产物的第2 2 位氨基酸由原来的天冬酰胺( a ) 转变 为天冬氨酸( a s p ) ；而聊b o r o 的第5 7 7 位碱基由胸腺瞌啶( t ) 转变为胞嘧啶( c ) ，该基因 产物的第1 9 3 位氨基酸也由原来的酪氨酸( 1 m 转变为组氮酸m s ) 。将木聚糖酶基因蛐妒啦“) 克隆至袭达载体p e t - 2 8 a ( + ) ，转化大肠杆菌 该基因可在大肠杆菌细胞内高效表达其表达 产物具有酶活性高、耐9 0 高温、纯化方便等特点，采用r b b 木聚糖法测定酶活为1 2 1 6 u m g 蛋白，但其表达产物不能分泌至细胞外。 分别将木聚糖酶基因矽啦鳓和m x y # b ( 5 7 n 克隆至表达载体p p i c 9 k ，通过转化整合至巴斯 德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i a ) g s i1 5 菌株基因组中。摇瓶培养发现，重组木聚糖酶m , x y n b 州、和 m x y n b o ，n 分泌表达置较高，在甲醇诱导培养1 0 8 小时后，胞外木聚糖酶酶活分别可达到0 6 u h n l 和o s u ，m l ，并具有良好的酶学性质。两种重组木聚糖酶的最适反应温度分别为9 0 和8 0 c 。 并在p h5 0 - 1 0 8 范围内稳定，推测该酶的第1 9 3 位氨基酸残基仅与酶的耐热性有关，并不影响 其p h 稳定性。在5 升自动发酵罐上对毕赤酵母重组菌株g s 1 5 - 9 k - n u 3 r n b ( 6 4 ) i i 进行高密度甲醇 诱导产酶培养，经1 0 8 小时培养后其细胞密度可达o d 一o1 4 4 ，酶活水平达到6 u m l ，高于摇瓶 水平1 0 倍，适于工业化应用 本实验通过p e r 分别获得了多形汉逊酵母( h t m s e n u l a 砌叩蚺口) 中的3 个启动子序列。 并将酿酒酵母因子分泌信号肽序列和整合外源基因( 肌钟诹) 的r d n a 序列组合，成功构建 四种可在大肠抒菌和汉逊酵母中穿梭表达的载体，包括食有诱导型启动子的曲d o x p - m 硼t 、 ( 1 0 6 k b ) ，西m d p _ 蛐叫最) ( 9 7 k b )，p a o x i p - m x 3 m b l 6 ) ( 9 8 k b ) 和含有组成型启动子的 p p m a l p _ m 习m 稚) ( 1 1 i k b ) 将它们分别转化并整台至多形汉逊酵母a 1 6 菌株基因组中，摇瓶 培养发现，重组耐高温木聚糖酶的分泌表达量比毕赤酵母略低，在摇瓶培养诱导1 0 8 小时后。多 形汉逊酵母重组菌株中，具有诱导型启动子的蔼株a 1 6 - p m o x r m x y n b ( h 、脆外本聚糖酶活力最 高，达0 2 5 u m l ，但比毕赤酵母菌株g s i l 5 - 9 k m x y n b ( “) i i 的分泌水平低倍。在7 5 升自动发 酵堙上的高密度培养结果证明，组成型表达的汉逊酵母菌株a 1 6 - p d m a i p - m x ? n b ( “、具有不需要 甲醇诱导、生长迅速的特点具有工业化应用的潜力 关键词：海栖热袍菌巴斯德毕赤酵母多形汉逊酵母耐高温木聚糖酶分泌表达 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t w om u t a t e dx y l a n a s eg e n e sw e r eo b t a i n e df r o mp c rb yu s i n gt h e g e n o m i cd n ao ft h e r m o t o g am a r i t i m am s b 8 船t e m p l a t e ，t e r m e da sm x y n b ( 6 4 ) a n d m x y n b ( s 7 7 ) ，w h i c hr e p r e s e n t e dt h a tt h eb a s e so f t h e6 4 t ha n d5 7 7 “s i t e so ft h eg e n e 聊忸 m u t a t e df r o mat oga n df r o mtt oca n dt h ea m i n oa c i d sm u t a t e dc o r r e s p o n d i n g l yf r o m a s n 2 2t oa s pa n d 矗o mt y r l ”t oh i sr e s p e c t i v e l y , b yc o m p a r i n g 谢t l lt h ex y l a t l a s eg e n e p u b l i s h e di ng e n b a n kw i t ht h er e g i s t r a t i o nn u m b e ro fa e 0 0 1 6 9 3 w i t ht h ea s s a yo ft l l e a d v a n c e ds t r u c t u r eo fx y l a n a s e bb yb i o i n f o r m a t i c s ，m x y n b ( 6 4 ) w a sc l o n e di n t oec e l l e x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) a n dw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nec e l lb l 2 1 私s o l u b l e p r o t e i np r o d u c t n er e c o m b i n a n tm x y n b ( “) i nec o l is h o w e dg r e a te n z y m ea c t i v i t y w h i c hr e a c ht o1 2 1 6 u ，m l ( t e s t e db yi u b b _ x y l a n sm e t h o d s ) ，a n di ts h o w e dh i g ha c t i v i t y i n9 0 t h et h e r m o s t a b i l i t yo ft h i sp r o t e i no f f e r e di tt ob ep u r i f i e de a s i l y b u tt h e r e c o m b i n a n tm x y n b c s ) e x p r e s s e di nec o l ic o u l dn o tb es e c r e t e do u to ft h ee e l lw h i c h w o u l db ea l lo b s t a c l ef o ri tt ob ea p p l i e di np r a c t i c e b o t ho ft h et w ox y l a n a s eg e n e s ，m x y n b ( 6 4 ) a n dm x y n b 0 7 7 ) , w e r ei n s e r t e di n t ot h e s h u t t l ea n di n t e g r a t e de x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kr e s p e c t i v e l ya n de x p r e s s e db yp i c h t n p a s t o r i sa sa na c t i v ee x t r a c e l l u l a rp r o d u c te f f i c i e n t l y t h et w or e c o m b i n a n tx y l a n a s e s e x p r e s s e di npp a s t o r i ss t i l ls h o we x t r e m et h e r m o s t a b i l i t ya n dp hs t a b i l i t y m x y n b ( 6 4 ) a n d m x y r d 3 ( 5 7 7 ) w e r eo p t i m a l l ya c t i v ea t9 0 c a n d 8 0 cr e s p e c t i v e l ya n db o t hq u i t es t a b l eo v e r t h ep hr a n g eo fp h5 0 1 0 8a t7 0 f r o mw h i c ht h a tt h em u t a t e da m i n oa c i di n m x y n b o t 7 ) o n l ya f f e c t e dt h et h e r m o s t a b i l i t yo ft h i se n z y m eb u tn o n e o ni t sp hp r o p e r t i e s c o u l db e s u g g e s t e d i nt h ec o n d i t i o n so fh i g hc e l l d e n s i t yc u l t i v a t i o n ，只p a s t o r i s r e c o m b i n a n ts l a i ng s l l 5 - 9 k - m x y n b ( “) i i c o u l ds e c r e t e dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i no f m x y n b ( 6 4 ) e f f i c i e n t l y , w h i c hi n d i c a t e dt h a ti tw a so fg r e a tu s e i nav a r i e t yo fi n d u s t r i a la n d a g r i c u l t u r a la p p l i c a t i o n s a n o t h e rm e t h y l o t r o p h i cy e a s t ，h a n s e n u l ap o l y m o r p h a ，e x p r e s s i o ns y s t e mw 私a l s o e s t a b l i s h e di nt h i ss t u d y t h m ep r o m o t e rs e q u e n c e sw e l eo b t a i n e db yp c r ，a n di n t e g r a t e d i n t ot h ef o u r1 1 p o l y m o r p h as h u t t l ea n di n t e g r a t e de x p r e s s i o nv e c t o r sw i t ht h ex y l a n a s e e x p r e s s i o nc a 站e i l e , a m o n gw h i c hp m o x r - m x y n b ( 酣) ( 1 0 6 k b ) ，p f m 啪n 聊4 ， ( 9 7 k b ) ，p a o x l p - r n x y n b ( 6 4 ) ( 9 8 k b ) w e r eo fi n d u c i b l ep r o m o t e r s ，w h i l e p p m a i r , - m x y n b ( 6 4 ) ( 11 i k b ) c o n s t i t u t i v ep r o m o t e n t h ef o u rhp o l y m o r p h ae x p r e s s i o n v e c t o r sw e r eu s e dt oh a t e r o l o g o u s l ye x p r e s sm 】协虽“) g e n ei ni t p o l y m o r p h aa 1 6 a f t e r c u l t i v a t i o ni ns h a k ef l a s hf o r1 0 8h o u r s ，t h e1 t p o l y m o r p h ar e c o m b i n a n ts t r a i no fa 1 6 - p m o ) 缸姗帆瞰科) s h o w e dt h eh i g h e s ti n t e m e l l u l a rx y l a n a s ea c t i v i t yo fo 2 5 u m 1 h i 曲 c e l lf e r m e n t a t i o no f h p o l y m o r p h ar e c o m b i n a n ts t r a i n ，a 1 6 一p p m a l p - m x y n b ( “) ，s h o w e d h t h a tt h er e l a t i v e l ys i m p l ef e r m e n t a t i o np r o c e s sw o u l dm a k eb e t t e rs e n s ei nf u t u mi n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：t h e r m o t o g am a r i t i m a ，p i c h i a p a s t o r i s ，h a n s e n u l a p o l y m o r p h a ， e x t r e m e - t h e r m o s t a b l ex y l a n a s e s ，s e c r e t ee x p r e s s i o n 1 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 崩步午 时间： 2 0 畸年6 月j 1 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：戈：訇童笋争 导师签名：振 时间：2 0 0 穸年6 月2 1 日 时间：2 0 0 毒年6 月2 1 日 1 1 木聚糖酶简介 1 1 1 木聚糖酶的的应用 第一章文献综述 木聚糖酶是一组可将术聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。一个木聚糖分子的完全降解需 要几步酶速反应。作用于主链瞻有两种酶：b 1 , 4 木聚糖酶( p 一1 , 4 - d - x y | a n o h y d r o l a s c ：e c3 1 。2 s ) 和b 木聚苷酶( 1 ，4 b d x y l a n o h y d r o l a s e ：e c3 1 2 3 7 ) 一般而言，前者从主链内部作用于木糖 苷键，将术聚糖分解成低聚糖，而后者则作用于低聚木糖的末端，释放出术糖。 由于术聚糖是 杂合多聚分子，在一些情况下木聚糖中木糖的2 位和3 位被侧链基取代，如阿拉伯糖残基、半乳 糖残基、葡萄糖酸残基和乙酰残基所以要将这样的术聚糖完全水解成单糖的话，必须要与其它 酶协同作用，如阿拉伯糖苷酶、葡萄糖苷酶和乙酰木聚糖酶等i - 4 1 木聚糖及其衍生物是自然界主要的可再生有机资源p i 但是半纤维索资源长期以来得不到充 分的重视和利用，造成极大的浪费。我国是农业大国。植物纤维资源非常丰富，每年农作物废弃 物、国有森林采伐加工剩余物、甘蔗渣等半纤维素类资源相当可观，如能加以开发利用，不仅节 粮节能，而且能处理废物，消除公害，保护环境因此生产木聚糖酶即可以开发利用我国的植物 纤维资源，为国家扩大资源的利用范围。又能生产对人类健康有利的功能因子。木聚糖酶在食品、 纺织、造纸、能源等方面具有广泛的应用前景”。 1 1 , 1 1 木聚糖酶在纸浆漂白工业上的应用 利用微生物来代谢术聚糖的酶系史研究自然界中第2 种最丰富的多聚糖( 木聚糖) 的重要工 具。近年来，国际上对微生物分解木聚糖系统的研究日益关注，主要研究工作集中在不同条件下 微生物术聚糖酶的诱导产生和调节机制，酶的提纯、鉴定，木聚糖酶基因的分子克隆和表达，以 及木聚糖酶在加工工业，尤其是在纸浆漂白方面的应用l o j 据报道，1 9 9 8 年在世界工业用酶1 6 种酶制剂占有的市场份额中，木聚糖酶捧到第7 位前6 位依次为z 蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、 脂肪酶、凝乳酶和糖化酶”j 。 在造纸行业，木聚糖酶可作为生物漂白剂用于造纸工业i j 在化学或机械制浆过程中，部分 的木质素可从木材或其它粗原料的纤维素中除去，但仍然残留3 y - 1 2 ，这部分残留的木质素会 造成纸浆程褐色，并降低纸张的强度。传统的化学漂白法是采用酸性漂白剂，如氯气、二氧化氯 来去掉木质素这就会使造纸废水中含有大量的、有毒的、强烈的致癌致畸的物质，造成环境的 污染如果在化学漂白之前，用木聚糖酶对纸浆进行预处理，就会使氯气等化学漂白齐j 更好地渗 透到纸浆里面大大减少化学漂白剂的用量，从而减轻环境污染：而且可提高纸浆的漂白度，降 低纸张的脆性，是纸张不易返黄现在，已在欧洲和北美的三十余家大型纸厂得到应用，成为生 物技术在造纸工业应用最成功的一铡。丹麦诺和诺德公司和美国山遒骺化学公司等多家纸浆厂在 使用木聚糖酶，其中加拿大有7 家、美国有1 3 家2 0 0 1 年，有3 9 0 多万吨纸浆采用了木聚糖酶 处理，2 0 0 2 年更达到了6 0 0 万吨在加拿大，每天需处理4 2 0 0 吨纸浆，而在美国每天需要处理 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 6 9 0 0 吨纸浆。由于制浆造纸工业是上千亿美元的巨型产业，一旦上述技术得到广泛推广，酶制剂 的需求量将非常之大。 但是，将木聚糖酶应用于造纸工业遇到的瓶颈问题是木聚糖酶在纸浆预漂工艺中的应用受到 制浆过程中的强碱性和高温等因素所制约如果能生产出耐高温、耐碱性的木聚糖酶，那就解决 了木聚糖酶在造纸中的这个大问题。因此耐热耐碱木聚糖酶的开发与利用成为当今该领域研究的 热点。由于在自然情况下耐热酶多由嗜热菌产生，因此嗜热茵的研究也一直成为热点之一。嗜热 菌能产生热稳定的酶目前仍是解决工业酶失活的主要途径1 8 9 8 年s c h i l l i n g e r 首先提出了嗜热 菌的概念，通常讲这一类细菌按其生长温度分为耐热菌油e r m o - t o l e r a n tb a c t e r i a ) 、嗜热茸 ( t h e r m o p h i l i cb a c t e r i a ) 和极端嗜热菌( e x t r e m et h e r m o p h i l i cb a c t e r i a ) 。现已发现的极端嗜热菌都是 古细菌界( a r c h a eb a c t e d a ) 和真细菌界( e u b a c t e r i a ) 的种类。除栖热袍菌( t h e r m o t o g a ) 之外，已知的 能在7 5 c 以上生长的都是古细菌嗜热性最高的真细菌是栖热袍菌属的海栖热袍菌( t m a r i t i m a ) 和新阿波罗栖热袍菌( z w 印口f j 细曲p ”l 。因此，来自于这两个菌属的木聚糖酶也就具有更高的利 用价值。 1 1 1 2 木聚糖酶在食品加工上的应用 术聚糖酶在食品行业的应用主要体现在它能从棉壳、甘蔗渣、玉米皮嚣等天然食物半纤维中 分解得到低聚木糖。低聚木糖是由2 - 7 个术糖，以b _ l ，4 糖苷键连接而成的低聚糖。该糖的特点 与功能是；具难消化性，低热量而不会导致肥胖；有很高的双歧菌增殖活性，是肠内双歧菌的活 化因子；是难发酵性糖，因此不易造成龋齿。另外，用低聚木糖可制成不同甜度的食品，可替代 葡萄糖作为糖尿病人的疗效食品。生产低聚木糖最有效、副作用最少的方法是利用术聚糖酶分解 木聚糖因此。术聚糖酶在食品行业的应用有着巨大的潜力p ，l ”。此外，还可以作为饲料添加剂 去除戊聚糖类的抗营养因子，提高饲料的利用率。改善其营养价值1 1 6 1 。 1 1 1 3 木聚糖酶在其它工业行业中的应用 生物转化：在术聚糖降解酶系的共同作用下，术聚糖可被转化为胁木糖弹体，而m 术糖可 用于生产重要的糖类替代品木糖醇，又可被细菌、酵母及真菌转化为有价值的燃料和化工原 料。以富含木聚糖的植物资源为原料，经过内切型术聚糖酶水解后。分离、精制而制得功能性低 聚木糖。低聚术糖即木寡糖的聚合度为2 - 7 d p ，糖度约为蔗糖的4 0 ，对p h 值及热的稳定性好， 极难被消化吸收，肠道内残存率高，具有极好的双歧杆菌增殖性，其选择利用性高于其它功能性 低聚糖还可将木聚糖及其水解产物生物转化为液体燃料、单细胞蛋白、溶剂、功能性甜味剂 等。 在饲料工业的应用方面，木聚糖酶可作为饲料添加剂加入到动物饲料中，将其中的木聚糖部 分水解，使得与其相连的纤维素更容易被瘤胃消化，从而可以改善农作物清贮饲料及谷物饲料的 营养价值l i “ 木聚塘醇还可以用于咖啡、植物油和淀粉的提取；可作为复合酶制剂的一个重要组成部分， 使植物组织软化，使细胞破壁，有利于有效成分的充分提取，同时大大降低提取液的粘度而粘 2 中国农业大学硬士学位论文 第一章文献综述 奠曼置曼量量篁皇曾曼曼曼曼罾暑曼置曼曼曼堂皇皇曼曼鼍曼曼皇詈量置量皇曹量量鼍曼曼詈量詈鲁董皇皇鼍| ! 舅_ i 度的降低可使生产中的浓缩或干燥的效率成倍提高，也相应降低生产成本i ”j 。 木聚糖酶具有很大的应用潜力，在应用研究方面每年都有大量专利和文章报道。但应用的经 济可行性仍存在一些问题，主要由于木聚糖酶的生产成本高和应用适应性较差。随着生物技术的 发展以及基因工程、蛋白质工程等在木聚糖酶研究方面的应用，木聚糖酶作为一种工业酶制剂将 会带来很大的经济和社会效益。 1 1 2 木聚糖酶资源的开发幸l j 用 1 1 2 1 微生物产生木聚糖酶 目前，木聚糖酶的生产主要依靠真菌或细菌的发酵生产。一般情况下，术聚糖酶都是诱导性 酶，只有在以木聚糖为碳源的条件下才能产生木聚糖酶。一般细菌能产两秘本聚糖酶，分别是高 分子量酸性木聚糖酶和低分子量碱性木聚糖酶，而真菌则大多产生低分子量碱性木聚糖酶。真菌 木聚搪酶又有非脱支型和脱支型两种类型，前者不解离阿拉伯糖：后者则能从取代基支链上解离 阿拉伯糖，且能切除主链上的支链连接链孢霉菌、黑曲霉和链霉菌所产生的木聚糖酶具有脱支 话性：木霉菌和黑蓝霉的另一菌株所产生的木聚耱酶却不具有脱支能力丝状真菌对本聚糖酶的 分泌水平一般超过酵母和细菌很多。不过，真菌木聚糖酶一般都与纤维素酶交联在一起，因此其 专一性生产通常是用木霉或曲霉品系且只以木聚糖为碳原来进行。而这些菌株在以纤维素为底物 时。能同时生产纤维素酶和木聚耱酶，因为维生素底物中含有微量的半纤维索1 9 1 2 0 。 目前自然发酵生产的木聚耱酶酶活都非常商，例如：据1 9 9 2 年h a a p a l a 报道，里氏木霉【2 l l 产木聚糖酶的活力可以达到3 3 5 0 r j m l ，而h a l i a i c h 在研究s c h i z o p h y l l u m 突变株”的固态发酵时， 得到木聚糖酶话力可达到2 2 7 0 0 1 u ，“，但是自然发酵得到的术聚糖酶特性并不银好，都在常温条 件下发酵产酶，得到的木聚糖酶的最适温度都比较低，因而在工业应用中受到制约。 1 1 2 2 耐高温木聚糖酶的研究 随着酶的开发利用，尤其木聚糖酶在造纸中的利用，对木聚糖酶的耐热性要求也越来越高 耐热木聚糖酶生产也就成为研究的发展方向。目前研究所知道的耐高温木聚糖酶大部分都属于 f i o 族，其中一种来自于真细菌t h e r m o t o g as p s h , a i n f j s s 3 b 1 的耐高温木聚糖酶x y n a 是目前已知 的反应温度最高的木聚糖酶，可达1 0 5 ，在9 5 下半衰期为9 0 分钟通过对许多耐高温术聚糖 酶与普通的木聚糖酶的氨基酸序列比较、蛋白晶体结构的研究及其氨基酸位点突变分析发现大 部分耐高温木聚糖酶与普通术聚糖酶的氨基酸序剜组成基本相似。耐高温木聚糖酶的耐热性及热 稳定性一般由于蛋白质本身某几个氨基酸的修饰使得该蛋白质的折叠能力更强，结构更紧密而 且不同的耐高温木聚糖酶都具有其独特的蛋白折叠方式以保证其热稳定性田l 。 研究者们在研究生产耐高温、耐碱性的木聚糖酶时采取了两种方式：一方面从天然微生物中 筛选产高温、耐碱性术聚塘酶的微生物，目前筛选的微生物主要集中在其酶能在p h9 - 1 0 ，温度 为7 0 c 条件下正常发挥功能的微生物上；另一方面将一些极端菌的耐高温、耐碱性木聚糖酶的基 因通过基因工程的方法在通用的宿主菌中表达，得到高纯度。高产量，酵学性质稳定的耐高温耐 3 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 i i 碱性木聚糖酶 野生型嗜热菌往往培养困难，需要在高温厌氧条件下培养，产酶量低而且酶系复杂，很难实 际应用。1 9 9 6 年s t a u d e n b a u e r 等m 1 系统研究栖热袍菌属野生型菌株发酵生产半纤维素酶，结果表 明产生的酶大部分位于细胞周质，分泌至培养液中的能力很差，细胞浓度达1 3 1 0 9 c e l l s m l 。木 聚糖酶活力仅o 2 u m l 。海栖热袍菌产生的酶系也比较复杂，研究表明野生型嗜热菌发酵产酶存 在3 个普遍性的问题：( 1 ) 野生型栖热袍菌产酶所要求的培养条件苛刻( 高温厌氧条件) ：( 2 ) 野生型菌株产酶承平非常低且酶系复杂( 相关的酶有8 种以上) ；( 3 ) 野生型菌株所产的酶属于 诱导酶，但分泌能力很差( 低于l o ) 1 2 5 1 普通木聚糖酶的生产可以通过筛选高产菌株、诱变 等传统方法解决，但目前看来，嗜热菌的这些问趣只有通过分子生物学的手段来解决，才能使应 用耐热木聚糖酶变为现实 通过筛选及自然发酵得到的木聚糖酶使一种古老又传统的方法，在选择菌株的时候，必须尽 量做到同时满足酶产量高、酶热稳定性号、酶的p h 稳定性好的要求。而实际上，我们在筛选菌 株的时候往往只能同时满足两个条件；此外，自然发酵菌株产酶酶系比较复杂。分离纯化步骤繁 琐为了满足木聚糖酶符合工业应用的要求，研究者们将生物技术应用到了木聚糖酶的生产上， 将一些具有良好特点的木聚糖酶基因克隆表达到已知的载体中，以满足人们的需求。 1 2 3 利用基因工程生产木聚糖酶 术聚糖酶基因工程的研究起始于七十年代末、八十年代初，到现在已经有3 0 个属的上百种 来自真菌和细菌的本聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌及真菌表达载体中表达口i 。而且还使用定点 突变技术探讨了木聚糖酶的结构与功能的关系，并对酶的性质进行改造以满足工业生产的需要 1 9 9 0 年b o r g q u i s t 等以大肠杆菌为受体菌尝试表达来自于( c a l d o c e l l u m , ，a c h a r o l y t i c u m ) 的耐 热木聚糖酶基因习柏，控制x y n a 的启动子采用表达载体妒上的温度诱导的p r 和p l 启动子。 x y n a 的袁大量可达到细胞总蛋白的2 0 以上，并且表达的) 【y n a 具有正常的生物学活性，与原 始的天然酶没有显著差异1 2 6 1 。 1 9 9 3 年，s u n g 等根据大肠杆菌的密码子偏向人工合成的环状芽孢杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) 木聚糖酶编码基因，并采用启动予，结果重组木聚糖酶在细胞周质中的表大量高达3 0 0 n 喀f l 发酵液田i 1 9 9 3 年s h e n d y e ，1 9 9 6 年l a p i d o t 等也同样利用大肠杆菌作为受体菌分别表达了来自 于一种芽孢杆菌的耐热木聚糖酶，后者用启动子t 7 驱动木聚糖酶基因的表达，表达量达到细胞 总蛋白量的7 0 剐 2 0 0 1 年，本课题的合作者之一江正强博士克隆海栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m a ) 中的木聚 糖酶基因x y n b ，并在大肠杆菌中表达弘珥，表达量占细胞总蛋白的3 0 ，得到的重组极端耐热 木聚糖酶x y n b 的最适温度高，p h 稳定性好，非常适合于工业应用，尤其在造纸工业的纸浆漂 自上具有很大的应用潜力。 虽然利用大肠杆菌为受体表达木聚糖酶使产量水平有所提高，但在大肠杆菌中表达的酶蛋白 难以分泌到培养基中，从有利于生产及进一步提高表达水平的角度出发，许多研究人员尝试利用 分泌型的芽孢杆菌、链霉菌、曲霉等作为生物反应器m o r o s o l i i ”l 等将目的基因插入p j h s 质粒， 在目的基因前引入了树干毕赤酵母的木聚糖酶诱导型启动予x y l i ，将构建好的质粒p l a f l 4 5 转 毒 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 化受体细胞树干毕赤酵母p j h 5 3 ，表达并分泌有活性的胞外木聚糖酶。 j u n g ! ”l 等用枯草芽孢杆菌基因组上的强启动子替换热纤维梭菌木聚糖酶基因自身的启动子， 井去掉c 末端与酶活无关的一段基因序列，把该基因转化到枯草芽孢杆菌中进行表达胞外酶活 可达到3 0 u m l 。1 9 9 6 年r u i z - a r d b a s 等强郝氏链霉菌( s t r e p t o m y c e sh a l s t e d i 0 的木聚糖酶编码基因 在微小链霉菌( s t r e p t o m y c e s p a r u l l u s ) 中进行表达，表达量为1 4 4u m l 发酵液p “。 2 0 0 0 年，j e a n - g u y p 7 1 等把黑曲霉( a s p e r , g i l l u sn i g e r ) 中的f 1 l 同源性木聚糖酶基因x y l a 整 合至p h i l - d 2 质粒，以酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的s u c 2 作为信号肽。在毕赤酵母 中表达，其目的产物在发酵罐中分泌量为6 0 m g r l 。 2 0 0 3 年，m o n i c a l a s l 将耐高温菌( t h e r m o m y c e s l a n u g i n o s u s ) i o c 4 2 4 5 中的木聚糖酶在巴斯 德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r b ) 中表达采用a o x l 作为启动子，在l l 的摇瓶中进行培养，达到 1 4 9 m g l 的术聚糖酶的产量，酶学性质分析发现其最适反应温度为7 5 ( 2 。 1 2 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 1 2 1 酵母表达系统简介 在微生物细胞反应器中，真核微生物酿酒酵母( s a e c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是第一个用于生 产真核异源蛋白的酵母表达体系与大肠杆菌等原核生物表达体系相比，酵母表达体系具有以下 优点：( 1 ) 易于操作酵母属于单细胞真核微生物，其结构简单。因此，那些在原核生物中已知 的分子遗传操作技术同样也适用于酵母的研究。同时酵母也能像细菌一样在廉价的培养基上迅速 生长、繁殖，便于进行异源基因的遗传操作。因此利用酵母菌来生产一些药用蛋白，可避免使用 那些既昂贵，操作又复杂的动植物细胞组织；( 2 ) 酵母细胞具有与高等生物十分相似的蛋白翻译 后加工修饰的能力因而为异源蛋白的表达提供了一个转译后加工和分泌的场所从而使异源蛋 白产物具有与天然蛋白十分相似或完全一样的结构：( 3 ) 酵母表达体系可将n 一末端信号肽与异源 蛋白相融合，指导新生肽的分泌，并在分泌过程中对蛋白进行n - 基或d 基的糖基化修饰；( 4 ) 酵母表达体系还可以像高等生物一样，在m r h a 翻译过程中去掉甲硫氨酸，从而避免在药物使 甩过程中引起免疫反应。( 5 ) 酵母体系还可以进行n 一乙酰化、c 一甲基化及十四酰化等修饰作用， 这对细胞内定向表达的蛋白有重要作用1 3 9 1 。由此可见，酵母表达系统是一个极为重要的对异源蛋 白进行表达的宿主系统 早在上个世纪8 0 年代初，对酿酒酵母表达体系的研究就已经进入了成熟阶段，至今利用该 系统已表达了几十种来自人类、动植物、微生物及病毒的异潭基因p ”由于酿酒酵母在啤酒和 面包等饮食行业的广泛应用，已使人们积累了大量与其相关的遗传学和生理学知识，这也使酿酒 酵母成为了第一个为人类普遍接受的安全的宿主微生物然而，目前认为酿酒酵母并不是一个理 想的表达异源蛋白的模式宿主菌株因为，酿酒酵母本身也存在莱些缺陷，如缺少高效和能够严 格调控的启动子、必须通过分批发酵才能达到高细脆生长密度、对蛋白的过度糖基化修饰等，其 中最大的缺点是对异源蛋白的表大量较低呻l ，长期停留在m g l 的水平上，其对异源蛋白的表达 量最多能达到t c p 的1 - 5 i 2 l ，难以满足大规模生产的要求，因此般认为酿酒酵母表达系统不 适宜对异源蛋白进行工业化大规模生产。 5 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 自上世纪8 0 年代末以来，国外的科学工作者开始对非常规酵母( u n c o n v e n t i o n a ly e a s t s ) 表 达系统进行了复杂而深入的分子遗传学研究。包括乳酸克鲁维亚酵母( 日坤 m 忉删l a c t i s ) t 4 3 1 、粟 洒裂殖酵母噼舭脚c ，d m ) 档御1 6 e 尸”、解脂耶鲁酵母( w 曲l i p o l y t i c a ) 1 4 ”以及甲基营养型酵 母中的巴斯德毕赤酵t 耳( p i c h i a p a s t o r i s ) 【蛔、多形汉逊酵母( h a n s e n u l a p o ! y m o r p h a ) i ”1 等。这些具有 重要商业应用价值的酵母表达系统，在工业生产规模上具有快速生长及高效分泌等优势。其中发 展最为成熟的就是巴斯德毕赤酵母系统和多形汉逊酵母。 1 2 2 巴斯德毕赤酵母表达系统的启动子 在二十世纪七十年代，巴氏毕赤酵母曾是生产单细胞蛋白( s c p ) 的重要菌株1 4 q ，由于人们 对其遗传及生理特性的特别关注，而使得与其相关的发酵技术已发展得相当成熟。比如，人们已 掌握了维持巴氏毕赤酵母大体积连续培养的发酵技术，并能使其细胞密度大于0 0 e l 细胞干重； 用于发酵的培养基中包括限量的无机盐混合物、微量元素、生物素和少量碳源，完全不含有毒紊 和热原物质，既廉价叉安全1 4 埘以上这些优点足以证明巴氏毕赤酵母能够成为最具优势的异源基 因表达系统 巴氏毕赤酵母的生物学特性与酿酒酵母十分相似，但与酿酒酵母相比则更具优势，主要体现 在三方面：( 1 ) 高表达利用其强启动子可使表达的异源蛋白达到其细胞总蛋白的3 0 ，比其它 体系商l o 到1 0 0 倍。如破伤风毒素蛋白( t i t ) 的产量可达t 2 9 r 0 5 ，而一般常用的表达系统只 在毫克级；( 2 ) 高稳定口”。在进行转化重组时，该系统的载体能和核基因组发生整台，构建出遗 传特性非常稳定的工程菌株，一般不会出现异源基因随生长而丢失的现象；( 3 ) 高分泌。该系统 可利用多种信号肽引导异源蛋白进行分泌，如人血清自蛋白的分泌量可达1 0 9 f l t ”1 这在已知的 分泌表达系统中时罕见的。目前，国内外利用这种表达体系已成功表达多种异源蛋白。 在巴氏毕赤酵母中有两个基因a o x l 、a o x 2 ，编码乙醇氧化酶，单在细胞中乙醇氧化酶基因 的表达大部分来自于a o x l 。a o x i 受甲醇专一性诱导且能商水平表达，当培养基中没有甲醇存 在时则检测不到a o x l 的表达，但是当以甲醇作为难一碳源时，a o x i 就齄高水平的转录，其m r n a 可占细胞体内总m r n a 的5 以上p “，乙醇氧化酶的含量可达到细胞可溶性蛋白的3 0 以上 | 5 4 , 5 5 1 ，因此，a o x l 启动子非常适合于作为调控外源基因的表达的启动子。虽然a o x 2 与a o x l 具有9 7 的同源性，但a o x 2 提供的乙醇氧化酶的活力很低几乎不表达，只有当a o x i 基因受 到抑制或损伤而不能正常表达时。a o x 2 才会进行低水平的表达。在以甲醇作为唯一碳源的培养 基上，含有a o x t 基因的酵母菌株生长表现为正常野生型( m u + ) ，如果a o x l 基因被替抉或者 被破坏，只有a o x 2 基因起作用的菌株利用甲醇的能力减弱，则表现为生长缓慢型( m 酊) l s q 巴氏毕赤酵母的a o x l 基因的表达严格受葡萄糖和其它碳源的阻遇，甲醇诱导不能迅速解除葡萄 糖的阻遏，因此在用于外源基因袭达时，先用甘油作碳源进行颈培养。在转换到甲醇作为难一碳 源的培养基进行诱导培养。 乙醇氧化酶的高效表达及对其基因转录过程的严格调控均表明a o x l 启动子适合于异源蛋白 袁达的商效调控启动子，这一点己在a o x l 启动子与l a e z 基因进行融合表达的实验中得到验证 对单拷贝a o x t 1 a c z 杂交基因来说，葡萄糖和甘油能严格阻遏它的表达，而甲醇则能有效地诱导 开启a o x l 启动子的转录l ，”；而带有多拷贝p a r s 的质粒则不受诱导调控，即使有甘油存在也能 6 中圈农业大学硕士学位论文第一章文献综述 进行少量表达。因此，a o x l 启动予能被用来进行各种异源蛋白的生产。 除了a o x l 启动子，人们还在巴氏毕赤酵母中分离得到其它的启动子，如组成型表达的g a p ( 磷酸甘油酸脱氢酶) 、p g k ( 磷酸甘油酸激酶) 基因的启动子及来自a o x 2 基因的启动子，单 这些启动子的应用均不如a o x l 启动子普遍”。 1 2 3 巴氏毕赤酵母表达载体 在巴氏毕赤酵母中不存在内源的能够整合到染色体基因组中的表达载体，而整合型的表达载 体能更稳定地存在于酵母染色体基因组中，因砸在设计载体质牲时，偏好于整台型表达载馋。典 型的毕赤酵母表达载体一般都含有乙醇氧化酶的调控序列，包括5 a o x , 启动子、3 a o x 3 终止 序列及3 a o x ，近末端序列并在5 a o x l 启动子和3 a o x l 终止序列间含有多克隆位点( m c s ) ， 以供异源基因插入。选择标记通常为h i s 4 基因此外，酿酒酵母的a r g 4 基因1 5 ”、s u c 2 基因p 8 l 及巴氏酵母的t r i 9 0 3g 4 1 8 抗性基因p ”等也可作为选择标记由于巴氏毕赤酵母本身不能利用蔗 糖作为唯一碳源，所以s u c 2 基因地标记就愈发显著g 4 1 8 抗性标记则更有利于高拷贝转化子 地筛选 作为一个既能在大肠杆菌又能在酵母中繁殖扩增的穿梭质粒，毕赤酵母表达载体通常还含有 部分p b r 3 2 2 质粒或c o le l 穿列，其中抗生素抗性标记基因a m ：或k a n r 便于质粒在大肠杆菌 中的筛选目前，美国的l v i t r o g e n 公司已经开发了一系列商用毕赤酵母表达载体，如p p i c 3 ，5 k 、 d p i c 9 k 、p a 0 8 1 5 、p h i l - d 2 、p h l l - s i 、p p i c z a ，b ，c 系列及p p l c z aa ，b ，c 系列等。可从网站 w w w i n v i b o g e n c q m - 查询得到相关载体的信息除了整合型的载体外，毕赤酵母也- - f 以携带有 多拷贝的附加型表达载体，在这种载体上通常含有巴氏毕赤酵母的自主复制序列p a r s i 和 p a r s 2 6 0 1 等序列。 为了便于异源蛋白的下游加工，还为毕赤酵母构建了分泌型表达载体。就是在胞内融合表达 载体的基础上增加了一段分泌信号序列，通常位于5 a o x l 启动子和m c s 之间。在信号肽的引 导下，异源蛋白在内质网和高尔基体中被修饰加工，并最终转移至胞外。对异源蛋白的分泌虽然 省却了细胞破碎工作。但同时也发现了一个遗憾的现象，即相