（水生生物学专业论文）倒刺鲃雄激素受体cdna克隆、序列分析及时空表达.pdf

倒刺鱼巴雄激素受体e d n a 克隆、序列分析及时空表达 专业：水生生物学 硕士生：苏华丽 导师：刘晓春副教授 摘要 雄激素( a n d r o g e n s ) 在脊椎动物性别分化、性腺成熟和生殖行为中扮演着 重要角色，而雄激素的作用是通过雄激素受体介导的。本论文克隆了倒刺鳃 ( s p i n i b a r b u sd e n t i c u l a t u s ) 雄激素受体( a n d r o g e nr e c e p t o r ，a r ) 的全长c d n a ， 分析了其序列特征，比较了氨基酸序列同源性，并研究了a r 的时空表达情况。 从倒刺岱巴精巢克隆得到的a rc d n a 全长3 1 7 2b p ，可读编码框为2 5 9 5b p ，编码 8 6 5 个氨基酸，预计分子量为9 5 4 k d a ，理论等电点( p ，) 为7 1 3 。倒刺鲤a r 基因存在高度可变的转录激活结构域( t a d ) 、高度保守的d n a 结合结构域 ( d b d ) 和中度保守的配体结合结构域( l b d ) ，与其他硬骨鱼类相比，三种结 构域的同源相似性分别为：t a d ，1 2 8 3 ；d b d ，7 3 9 9 ：l b d ，6 5 9 8 。 将倒刺鲤a r 的氨基酸序列与其它动物进行同源性比较，并构建进化树，结果显 示，倒刺宿巴a r 与鲤科鱼类中的金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 同源性最高，其次是 黑头软口鲦( p i m e p h a l e s p r o m e l a s ) 和斑马鱼( d a n i or e r i o ) 。组织分布结果表明： a r 在雄鱼脑各分区均有表达，外周组织以精巢、肝、脾、肾、头肾、心脏、红 肌、白肌和胃的表达水平最高，在皮肤、鳃和脂肪组织也有微量表达；a r 在雌 鱼的嗅球、端脑、下丘和垂体中有表达，外周组织以肝脏和心脏的表达水平最高， 在脾、肾、头。肾、红肌和皮肤中有微量表达。运用r t - p c r 技术研究a rm r n a 在倒刺岱巴胚胎发育过程的表达情况，结果显示：a r 在受精卵、1 6 细胞期、囊胚 中期都有微弱的表达；原肠中期和神经胚期没有表达；表达水平在胚孔封闭期、 眼囊期和尾芽期逐渐升高；肌肉效应期表达水平降低，晶体出现期升高，心跳期 降低；孵化前期、初孵仔鱼和孵化后4 天( 4 d p h ) 仔鱼a r 的表达水平呈现逐 渐升高的趋势。采用组织学方法鉴定脑、垂体、肝和性腺样品所处的性腺发育阶 段，然后利用r e a k i m e p c r 技术定量检测脑、垂体、肝、性腺四种组织的a r 在倒刺钯性腺发育早期、性腺发育中期和性腺成熟期的表达水平，结果显示：对 于雄鱼，精巢发育早期、中期和成熟期，脑组织a r 的相对表达水平存在显著性 差异；精巢发育早期和中期，垂体组织a r 的相对表达水平显著低于精巢成熟期， 早期和中期a r 的相对表达水平差异不显著；精巢发育中期和成熟期，精巢组织 a r 的相对表达水平显著低于精巢发育早期，中期和成熟期a r 的相对表达水平 差异不显著。精巢发育早期、中期和成熟期，肝脏组织a r 的相对表达水平存在 显著性差异。对于雌鱼，卵巢发育早期，脑组织a r 的的相对表达水平显著低于 中期，早期和成熟期a r 的相对表达水平差异不显著，中期和成熟期a r 的相对 表达水平差异也不显著；垂体、卵巢和肝脏组织a r 在卵巢发育早期、中期和成 熟期的相对表达水平的差异都不显著。结果暗示了雄激素可以通过a r 的调节作 用，调节倒刺鲍脑和垂体发育成熟及功能的维持，同时也表明了a r 在促进精子 发生和精子形成、卵黄蛋白原的合成、卵母细胞发育成熟过程中的重要作用。 关键词：倒刺鳃雄激素受体( a r ) c d n a 克隆组织分布表达水平 m o l e c u l a r c l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o na n ds p a t i a l - t e m p o r a le x p r e s s i o n o fa n d r o g e nr e c e p t o ri ns p i n i b a r b u sd e n t i c u l a t u s m a jo r ：h y d r o b i o l o g y n a m e ：s uh u a l i s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rl i ux i a o c h u n ，p h d a b s t r a c t a n d r o g e n sp l a yk e yr o l e si nv e r t e b r a t es e xd i f f e r e n t i a t i o n ，g o n a d a lm a t u r a t i o n a n dr e p r o d u c t i v eb e h a v i o u ra n dt h e i ra c t i o n sa r eg e n e r a l l ym e d i a t e dt h r o u g ha n d r o g e n r e c e p t o r s t h ep r e s e n ts t u d yd e s c r i b e dt h ei s o l a t i o n ，s e q u e n c i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f c d n a e n c o d i n gt h ea n d r o g e nr e c e p t o r ( a r ) ，t h ed i s t r i b u t i o no fa ri nd i f f e r e n tb r a i n r e g i o n sa n dp e r i p h e r a lt i s s u e s ，a n dc h a n g e so fa re x p r e s s i o nd u r i n ge m b 巧o n i c d e v e l o p m e n ta n da t d i f f e r e n t s t a g e s o f g o n a d a ld e v e l o p m e n ti ns p i n i b a r b u s d e n t i c u l a t u s a rw a sc l o n e df r o ms p i n i b a r b u sd e n t i c u l a t u st e s t i sa n de n c o d e da p r e d i c t e dp r o t e i no f8 6 5r e s i d u e s ，w i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f9 5 4k d aa n d at h e o r e t i c a lp io f7 13 s e v e r a ld o m a i n sp r e s e n ti na l lc l o n e da r sw e r ei d e n t i f i e di n s p i n i b a r b u s d e n t i c u l a t u s a r ( s d a r ) t h e d o m a i n s c o r r e s p o n d e d t oa n a m i n o - t e r m i n a lh y p e r v a r i a b l et r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nd o m a i n ( t a d ) ，ac e n t r a l h i g h l y c o n s e r v e d d n a - b i n d i n gd o m a i n ( d b d ) ，a n dac a r b o x y t e r m i n a l l i g a n d - b i n d i n gd o m a i n ( l b d ) p e r c e n t a g e so fh o m o l o g y s i m i l a r i t ya m o n gt h e s e f u n c t i o n a ld o m a i n si nt e l e o s tf i s hr a n g e db e t w e e n12a n d8 3 f o rt h et a d ，7 3a n d 9 9 f o rt h ed b d ，a n d6 5a n d9 8 f o rt h el b dw h e nc o m p a r e dt ot h o s eo f s p i n i b a r b u sd e n t i c u l a t u s w h e nt h es e q u e n c eo fa m i n oa c i dw a sc o m p a r e dw i t ho t h e r a n i m a l s ，i ts h o w e dt h a ts d a rw a sh i g h e rs i m i l a r i t yw i t hg o l d f i s h ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) ， w h i l el o w e rs i m i l a r i t yw i t hf a t h e a dm i n n o w ( p i m e p h a l e sp r o m e l a s ) a n dz e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) i nm a l es p i n i b a r b u sd e n t i c u l a t u s ，s d a rw a se x p r e s s e di na l lb r a i nr e g i o n s f u r t h e r m o r e ，h i g hs d a re x p r e s s i o nw a sf o u n di nt e s t i s ，l i v e r ，s p l e e n ，k i d n e y ，h e a d k i d n e y ，h e a r t ，r e dm u s c l e ，w h i t em u s c l ea n ds t o m a c h ，w h i l el o we x p r e s s i o ni ns o m e o t h e rt i s s u e s ，s u c ha ss k i n ，g i l la n df a t i nf e m a l eb r a i n ，s d a rw a so n l ye x p r e s s e di n o l f a c t o r yb u l b ，f o r e b r a i n ，h y p o t h a l a m u sa n dp i t u i t a r y ；w h i l ei np e r i p h e r a lt i s s u e s ，h i g h l e v e l so fs d a re x p r e s s i o nw e r ef o u n di nl i v e ra n dh e a r t ，b u tl o wl e v e l si ns p l e e n ， k i d n e y ，h e a dk i d n e y ，r e dm u s c l ea n d s k i n as e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rw a sd e v e l o p e dt os t u d yt h ee x p r e s s i o no fa r m r n ad u r i n gt h ep e r i o do fe m b r y o n i cd e v e l o p m e n t t h er e s u l t ss h o w e dv e r yl o w m r n ae x p r e s s i o nl e v e l so fa ri nt h ef e r t i l i z e de g g ，16c e l ls t a g ea n dm i db l a s t u l a s t a g e ，n oe x p r e s s i o nw a so b s e r v e di nt h em i dg a s t r u l as t a g ea n dn e u r u l as t a g e ，t h e e x p r e s s i o nl e v e l sw e r ei n c r e a s e di nt h ec l o s u r eo fb l a s t o p o r es t a g e ，o p t i cv e s i c l es t a g e a n dt a i lb u ds t a g e ，b u td e c r e a s e di nt h em u s c u l a rc o n t r a c t i o ns t a g e ，a n dt h e n ，b e c a m e h i g h e ri nt h ea p p e a r a n c eo fe y el e n ss t a g ea n dl o w e ri nt h es t a g eo fh e a r tp u l s a t i o n a g a i n ，f i n a l l yt h ee x p r e s s i o nl e v e l sw e r ei n c r e a s e di nt h ep r e - h a t c h i n gs t a g e ，n e w l y h a t c h e dl a r v a es t a g ea n dt h el a r v a eo f4d a y sp o s th a t c h i n g d i f f e r e n ts t a g e so fg o n a d a ld e v e l o p m e n t ，i n c l u d i n gt h ee a r l ys t a g e ，t h em i d d l e s t a g ea n dt h em a t u r es t a g e ，w e r ed i s t i n g u i s h e dw i t hg o n a dh i s t o l o g ym e t h o d b r a i n ， p i t u i t a r y , l i v e r , t e s t i sa n do v a r i e sw e r ec o l l e c t e df r o mf i s ho ft h et h r e ed e v e l o p m e n t s t a g e s ，a n dt h e i ra r m r n a e x p r e s s i o nw a sd e t e r m i n e db yq u a n t i t a t i v er e a l t i m e p c r t h er e s u l t ss h o w e dt h ee x p r e s s i o nl e v e l si nb r a i nw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ei nt h e t h r e ed e v e l o p m e n ts t a g e so ft e s t i s e x p r e s s i o nl e v e l si nt h ee a r l yd e v e l o p m e n ts t a g e a n dt h em i d d l ed e v e l o p m e n ts t a g ew e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h em a t u r es t a g eo f t e s t i si np i t u i t a r y , b u tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ee a r l yd e v e l o p m e n ts t a g e a n dt h em i d d l ed e v e l o p m e n ts t a g e i nt h em i d d l ed e v e l o p m e n ts t a g ea n dt h em a t u r e s t a g e ，e x p r e s s i o n l e v e l si n t e s t i sw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n i nt h e e a r l y d e v e l o p m e n ts t a g e ，b u tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h em i d d l ed e v e l o p m e n t s t a g ea n dt h em a t u r es t a g e e x p r e s s i o nl e v e l si nl i v e rw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ei n i v j】lj，i t h et h r e ed e v e l o p m e n ts t a g e so ft e s t i s f o rf e m a l ef i s h ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so ft h e e a r l yd e v e l o p m e n ts t a g ei nb r a i nw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to ft h em i d d l e d e v e l o p m e n ts t a g e b u t ，n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo fa re x p r e s s i o nb e t w e e nt h ee a r l y d e v e l o p m e n ts t a g ea n dt h em a t u r es t a g e ，a n d ，n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h e m i d d l ed e v e l o p m e n ts t a g ea n dt h em a t u r es t a g ew e r ef o u n d e x p r e s s i o no fa ri n p i t u i t a r y , o v a r i e sa n dl i v e rh a dn os i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ei na l lt h r e ed e v e l o p m e n t s t a g e so fo v a r i e s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ta n d r o g e n sr e g u l a t e dt h ed e v e l o p m e n ta n df u n c t i o no f b r a i na n dp i t u i t a r ym e d i a t e db ya r ，a n di n d i c a t e dt h ei m p o r t a n tr o l e sf o ra ri n c o n t r o l l i n gt h ep r o c e s so fs p e r m a t o g e n e s i s ，s p e r m i o g e n e s i s ，v i t e l l o g e n i ns y n t h e s i sa n d o o c y t ed e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：s p i n i b a r b u sd e n t i c u l a t u s 1 a n d r o g e nr e c e p t o r 、c d n ac l o n i n g ， t i s s u ed i s t r i b u t i o n 、e x p r e s s i o nl e v e l s v 倒刺鱼巴雄激素受体c d n a 克隆、序列分析及时空表达苏华丽 1 雄激素的生物合成 j 上一 月i j吾 鱼类性类固醇激素主要包括雄激素和雌激素。天然雄激素是一类含有1 9 个 碳原子的甾体化合物，主要有睾酮( t e s t o s t e r o n e ，t ) 、雄烯二酮( a n d r o s t e n e d i o n e ， a d s d ) 、二氢睾酮( d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ，d h t ) 等。天然的雌激素是含有1 8 个碳原子的甾体化合物，主要包括雌酮( e s t r o n e ，e 1 ) 、雌二醇( e s t r a d i 0 1 ，e 2 ) 、 雌三醇( e s t r i o i ，e 3 ) ，其中e 2 的分泌量最大，活性最高( 林浩然，1 9 9 9 a ) 。 雄激素起源于性腺和肾上腺组织。肾上腺分泌主要的雄激素前体物质，例如 脱氢异雄酮硫酸盐( d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n es u l f a t e ，d h e a s ) 、脱氢异雄酮 ( d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e ，d h e a ) 和a d s d ，这些前体在脂肪腺等外围组织中 转化为它们的活性形式( l o n g c o p e ，1 9 8 6 ) 。a d s d 在脂肪组织中通过酶解作用 转化成了e l ( h e r b s te ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 性腺中有两类特殊细胞产生性类固醇激素，一类是卵巢中卵母细胞双层滤泡 膜上的类固醇生成细胞( s p c s ) ，另一类是精巢中位于精小囊间隙的间质( l e y d i g ) 细胞( n a k a m u r a ，2 0 0 3 ) 。鱼类雄激素的来源主要是精巢的间质( 1 e y d i g ) 细胞。 间质细胞以胆固醇为原料，首先转变为孕烯醇酮( p r e g n e n o l o n e ) ，而后由各种不 同的酶进一步催化形成含1 9 个碳原子的甾体化合物，如1 1 酮基睾酮 ( 11 - k e t o t e s t o s t e r o n e ，11 - k t ) 、t 、a d s d 和d h t 等雄激素( 林浩然，1 9 9 9 a ； b o r g ，1 9 9 4 ) 。t 在靶组织通过5 u 还原酶( 5 t 1 r e d u c t a s e ) 代谢为d h t 或通过芳香 化酶( a r o m a t a s e ) 代谢为e 2 。雄激素的合成和代谢途径见图1 。d h t 最终转化为 稳定产物50 【雄烷30 【，1 7b 二醇葡糖甘酸( 5 a a n d r o s t a n e 3 q ，1 7b d i o l g l u c u r o n i d e ) ( h e r b s te ta 1 ，1 9 9 2 ) 。而雌激素的合成需要卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞共同参 与完成，即卵母细胞双层滤泡膜上的特殊鞘膜细胞以胆固醇为原料，在促性腺激 素( g o n a d o t r o p i nh o r m o n e ，g t h ) 的作用下首先合成雄激素，然后转移到颗粒 细胞层，在芳香化酶的作用下芳香化为含1 8 个碳原子的e l 或e 2 ( n a g a h a m a ， 】9 8 3 ) 。 中山大学硕士学位论文 2 醋酸 胆固醇 h o 0 孕烯醇酮 孕酮 1 7 。羟化酶c h 。 1 7 。羟化酶l c ：o h o g h 3 c 2 o 芦i o o 17q 羟孕烯醇酮 1 7q 一羟孕酮 一 一 o 雄烯酮 h o o 雄烯二醇 2 h 图l 雄激素及雌 激素合成途径 睾丸酮 h o 雌二醇 白斗少 倒刺鲍雄激素受体c d n a 克隆、序列分析及时空表达苏华丽 2a r 的基因结构及转录因子功能 2 1 越因结构特点 a r 是核受体家族的一员，核受体家族大约包含1 5 0 种蛋白质，在脊椎动物和 非脊椎动物中都起着转录因子的功能。除了类固醇激素核受体外，核受体家族还 包括类维生素a 受体、甲状腺素受体、脂肪酸受体和前列腺素受体，以及一系列 所谓的孤儿受体。这些受体无论在氨基酸序列的一级结构还是在功能结构域上都 有高度的相关性，暗示了它们的作用机制在很多方面都是保守的( p a r k e r ，1 9 9 3 ； m a n g e l s d o r f , 1 9 9 5 ) 。 a r 和其他核受体一样存在着高度保守的d n a 结合结构域( d n ab i n d i n g d o m a i n ，d b d ) 和中度保守的配体结合结构域( 1 i g a n db i n d i n gd o m a i n ，l b d ) ， d b d 内部含有一个二聚化结构域，l b d 对于二聚化的形成和转录活性都有功能 ( 图2 - a ) ( p a r k e r ，1 9 9 3 ；m a n g e l s d o r f , 1 9 9 5 ) 。d b d i 妇两个锌指结构( z i n cf i n g e r m o t i f s ) 组成。d b d 包含两个框，近端框p b o x ( g s c k v ) 参与a r 与目的基因雄激 素反应元件的结合，远端框d b o x ( a s r n d ) 参与识别反应元件h a l f - s i t e s 之间的间 距，也参与a r 的二聚化作用( p f a h l ，1 9 9 3 ) 。l b d 是一个螺旋结构域，与激素 识别受体及转录调节有关。l b d 的亮氨酸拉链结构( 1 e u c i n ez i p p e rm o t i f ) 是a r 基因二聚化的必要条件( j o h n s o ne ta 1 ，1 9 8 9 ) 。a r 基因d b d 中存在短的回文序 列a g a ( g ) a c a n n n t g t ( c ) t c t ( 图2 b ) ，回文序列使得a r 形成二聚体，二聚化 的雄激素受体才能够结合到目的d n a 上。雄激素、糖皮质激素、黄体酮和雌二 醇都是同型二聚体( m a n g e l s d o r f e t a l ，1 9 9 5 ) 。 a r 还有两个调节目的基因表达的转录激活结构域，a f l 位于n 端或a b 区， a f 2 位于配体结合域或e f 区( 图2 a ) ( p a r k e r ，1 9 9 3 ；m a n g e l s d o r f , 1 9 9 5 ) 。不 同的类固醇激素受体a f l 的核甘酸数目及氨基酸序列不同，且a f l 是被其他信号 途径磷酸化的对象( a l ie ta 1 ，1 9 9 3 ；k a t oe ta 1 ，1 9 9 5 ；b u n o n ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 a f 2 在所有有转录活性的核受体中都是保守的，是受体功能的基本条件 ( d a n i e l i a ne ta 1 ，1 9 9 2 ；s a a t c i o g l ue ta 1 ，1 9 9 3 ；b a r e t t i n oe ta 1 ，1 9 9 4 ；d u r a n de t 口，19 9 4 ) 。 中山大学硕士学位论文 4 d b dl b d d n ab i n d i n g l i g a n db i n d i n g d i m e r is a ti o n d i m e r is a ti o n 广 厂 a bcde f n 亿覆爱z 霞羹跹二二翌二c 1 _ j i一 n u c1e a ri _ j t r a n s a c t i v a t i o n 1 0 c a l i s a t i o nt r a n s a c t i v a t i o n s i g n a l s ba n d r o g e nr e c e p t o r s a g 台a o a n n n t g t 舌c t 图2核受体的功能结构域和类固醇激素受体结合到d n a 示意图 ( p a r k e r ，19 9 3 ：m a n g e l s d o r f , 19 9 5 ) 图2 a ：核受体的功能结构域示意图。d b d ，d n a 结合结构域( c 区) ；l b d ，配体结合 结构域( e f 区) ；a f l ，n 端转录激活结构域( a b 区) ，a f 2 ，c 端端转录激活结构域( e f 区) ；d 区，核定位信号。图2 b ：雄激素受体结合到d n a 示意图。d b d 中的回文序列形 成二聚体，二聚化的雄激素受体能够结合到目的d n a 上。a g a ( g ) a c a n n n t g t t ( c ) c t 为 雄激素受体的反应元件核心序列。 4 陵园 倒刺自巴雄激素受体c d n a 克隆、序列分析及时空表达苏华丽 在研究虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) ( t a k e oe ta 1 ，19 9 9 ) 、三斑海猪鱼 ( h a l i c h o e r e st r i m a c u l a t u s ) ( k i me ta 1 ，2 0 0 2 ) 、舌齿鲈( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) ( b 1 7 a z q u e ze ta 1 ，2 0 0 5 ) 、日本鳗鲡( a n g u i l l a j a p o n i c a ) ( i k e u c h ie ta 1 ，1 9 9 9 ； t o d oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 和牛蛙( r a n ac a t e s b e i a n a ) ( c h a t t o p a d h y a ye ta 1 ，2 0 0 3 ) 的 a r 基因结构功能的时候，研究者着重分析n 端的转录激活结构域( t a d ) 、中央 高度保守的d n a 结合结构域( d b d ) 和羧基末端中度保守的配体结合结构域 ( l b d ) 的结构特点，进而深入研究a r 与配体之间的亲和力关系。 2 2a r 的配体 a r 的配体包括激动剂( a g o n i s t ) 和拮抗剂( a n t a g o n i s t ) 。雄激素是a r 功能 不可或缺的激动剂，此外，还需要其它激动剂的参与，最主要的有p 1 6 0 蛋白和 c b p p 3 0 0 。雄激素的作用是促使a r 的配体结合结构域中螺旋1 2 的正确重排，重 排后的螺旋1 2 与螺旋3 形成的表面复合物有利于p 1 6 0 蛋白禾1 c b p p 3 0 0 的识别和 结合。激动剂的活性由转录激活结构域( a f l ) 驱动( k a m e ie t a l ，1 9 9 6 ；h e n t t u 甜a 1 ，1 9 9 7 ) 。对雌激素受体的研究表明，拮抗剂使得螺旋1 2 不能正确重排，其 活性由转录激活结构域( a f 2 ) 驱动( b e r r y e ta 1 ，1 9 9 0 ；d a n i e l i a ne ta 1 ，1 9 9 3 ； t z u k e r m a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。用于降低或阻碍类固醇激素作用的拮抗剂有三类：一 为非类固醇类，包括雌激素受体拮抗剂t a m o x i f e n 和a r 拮抗剂f l u t a m i d e ；二 为类固醇类，包括i c i1 8 2 7 8 0 和醋酸环丙氯地孕酮( c y p r o t e r o n ea c e t a t e ) ；三为类 固醇和非类固醇芳香化酶抑制剂( c l a r k ee ta 1 ，1 9 9 1 ；r o b e r t s & s p o r n ，1 9 9 2 ) 。 k w o n 等人的研究发现，雄激素1 7 0 【甲醛酮( 1 7 c c m e t h y l t e s t o s t e r o n e ，m t ) 对肝 脏卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ) 合成的促进作用可以被a r 拮抗剂f l u t a m i d e 所阻断 ( k w o ne t a l ，2 0 0 5 ) 。 2 3 越因的作用方式 不存在激素( 激动剂，a g o n i s t ) 的情况下，没有活性的类固醇激素受体寡聚 复合物结合有大量的其他蛋白因子，包括热休克蛋( 了h s p 9 0 、h s p 7 0 、p 2 3 、 c y c l o p h i l i n - 4 0 等分子伴侣( s m i t h & t o i l ，19 9 3 ；p r a t t & t o i l ，19 9 7 ) 。分子伴侣 的功能可能是维持受体正确的折叠方式以便对激素信号作出快速反应。也就是 中山大学硕士学位论文 说，无活性受体以复合物的形式存在，这样的构型更有利于激素的结合。受体结 合激素后，寡聚复合物解体，受体活化。 s t r u c t u r eo ft h el i g a n db i n d i n gd o m a l n a b o u h r g u rx e t e r t a | an 饧1 糍2 纩勉3 纺囫4 沥5 _ p 6 励7 抛8 刎勉9 饧1 0 1 11 2 c 。 sis z h rxrq 12 3 456789101112 ( + ii g a n d )n 磁缓滋纩堰覆缓琵m 覆霆 落劢眩豸趣滋戮弦引珊嵫c b e n a u de ta i s 1s 2 b yt rq ( + i i g a n d ) w a g n e re ta 1234567891o1 112 n 弦物一炒一隧凌压吃缓黔物罂囫饧貉弦缓缓豹嘞c s 1 s 2s 3s 4 ia m in oa c i d s inc o n t a c tw i t hii g a n d a g o n i s t c + a g o n i s t 图3a r 与激动剂结合后的l b d 结构效应模型 ( b o u r g u e te t a l ，1 9 9 5 ；r e n a u de ta 1 ，1 9 9 5 ；w a g n e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 图3 a ，人类维生素a x 受体( h r x r c t ) 、人视黄酸受体( h r a r 丫) 、小鼠甲状腺素受体( r t a o t ) 三种不同受体的配体结合结构域( 1 i g a n db i n d i n gd o m a i n ，l b d ) 序列元件的排列顺序。 h r x r o t ，没有配体存在情况下的l b d 序列元件的排列；b r a r v 和r t a a ，有配体存在的 情况下l b d 序列元件的排列。数字1 1 2 表示1 2 个独立的c t 螺旋，s 1 - $ 4 表示p 一折叠。 在0 【螺旋3 、c 【螺旋5 、s 1 、s 3 、0 【螺旋6 与c t 螺旋7 之间的环、0 l 螺旋1 1 与a 螺旋1 2 之间的环中发现与配体紧密相关的氨基酸位置，已刚黑杆表示。图2 b 和图2 - c 显示了有 配体存在和没有配体存在的l b d 的折叠结构，以及旺螺旋l c 【螺旋1 2 的相对位置。模 型显示了m 螺旋1 0 和0 【一螺旋1 1 的重排和u 螺旋1 2 位置的改变以形成一个配体结合e l 袋 的盖。这种重排导致了l b d 形成一个新的表面( 用白色圆圈表示) ，认为这个面与共激活 子( c o a c t i v a t o r s ) 蛋白的相互作用有关。 6 倒刺鱼巴雄激素受体c d n a 克隆、序列分析及时空袭达苏华丽 通过对人类维生素a - x 受体c c ( h u m a nr e t i n o i dx r e c e p t o r a ，h r x r ) 、人视 黄酸受体吖( h u m a nr e t m i ca c i dr e c e p t o r - 丫，h r a r l , ) 、小鼠甲状腺素受体a ( r a t t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r a ，r t r a ) 晶体结构的研究，对l b d 和激动剂之间的相 互作用关系有了更进一步的了解。这三种受体l b d 的二级结构模型见图3 a ，折 叠结构模型见图3 b 和图3 c 。没有激动剂存在的情况下，所得到的h r x r o tl b d 结构域的晶体结构由1 2 个c 【螺旋和2 个d 折叠排列成三层，构成一个0 【螺旋的三文 治结构( b o u r g u e te ta 1 ，1 9 9 5 ) 。从受体的晶体结构来看，在螺旋9 和螺旋1 0 形 成二聚体和二聚体的作用面。随后又有学者获得了激动剂存在时，h r a r vl b d 结构域的晶体结构( r e n a u de t a l ，1 9 9 5 ) 和r t r al b d 结构域的晶体结构( w a g n e r e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，发现蚣、h r a 脚和r t r c t 三种受体的l b d 结构域的晶体 结构几乎完全一致，唯一不同的就是无激动剂结合的h r x r 0 tc 末端的螺旋1 2 是 远离配体结构域核心的，而结合有激动剂的h r a r t 和r t i kc 末端的螺旋1 2 回 折横过l b d 核心。由此可以推测，这些受体基因的l b d 螺旋结构域包含1 2 个螺旋， 且蛋白序列是保守的。与配体结合后，螺旋1 0 和螺旋1 1 发生重排，导致螺旋1 2 可以作为整个激动剂结合“口袋”的“盖 ，并与螺旋4 形成盐桥。 a r 结合激动剂的主要作用就是改变l b d 的结构以形成一个新的面，这样就 使其有机会结合相互作用蛋白，包括共激活子( c o a c t i v a t o r s ) 、共抑制子 ( c o r e p r e s s o r ) 和其他的调节蛋白。b e i t e l 收录了已经分离出来的作用于a r 基因 n 端、d b d 、l b d 的相互作用蛋白( b e i t e l ，2 0 0 2 ) 。 雄激素与a r 的l b d 结合，促使了l b d 螺旋1 2 的重新配置，改变了n 端和c 端的交互作用，推动了a r 从细胞质到细胞核的重新分配，使得a r 具有了转录因 子的功能。根据已有信息建立的a r 迁移入核的模型( 图4 ) ，表明了a r 和目的基 因转录的关系( b l a c k & p a s c h a ，2 0 0 4 ) 。b l a c k 和p a s c h a 在模型描述了a r 通过 亚核装配车间重新装配，进而结合到染色体的雄激素反应元件( a n d r o g e nr e s p o n s e e l e m e n t s ，m 汪s ) 的过程。a r 与雄激素结合后进入细胞核，a r 尽管有很高的可 变性，但在核中的分布还是不均一的，因为a r 的稳态分布受到激动剂“装配车间” 的影响。已经结合上雄激素的a r 再与共激活子( c o a c t i v a t o r s ) p 1 6 0 在亚核中心 结合。a r 可能通过两种途径装配有用元件成为有活性的转录因子，一种是预先 装配( p r e a s s e m b l y ) ，即a r 在激动剂装配车间与p 1 6 0 共激活子形成亚复合物， 中山人学硕：t ：学位论文 随后结合到染色体上；另一种是随机装配(