（有机化学专业论文）二茂铁衍生肽的合成、表征及其与β淀粉样蛋白的相互作用.pdf

硕十学位论文摘要 摘要 以二茂铁为起始原料，采用液相合成法得到两种目标产物：二茂 铁三肽( 化合物1 0 ，b o c g l y p r o a r g ( n 0 2 ) - f c - c o o m e ，g p r - f c a ， 总收率为7 2 5 ，f c 为二茂铁) 矛i - - 茂铁五肽( 化合物1 7 ，f c l e u p r o p h e p h e a s p ( o m e ) o m e ，f c i a l 3 5 ，总收率为1 7 8 6 ) ；并同时采用 液相和固相合成法分别合成a 1 3 抑制剂：三肽( 化合物1 1 ，b o c g l y p r o a r g ( n 0 2 ) - o m e ，g p r ) 矛i 五肽( 化合物l 9 ，a c - l e u p r o p h e p h e - a s p o h ，i a l 3 5 ) ；用红外光谱( i r ) 、紫外- 可见吸收光谱( l r v - v i s ) 、核 磁共振氢谱( 1 hn m r ) 和质谱( m s ) 等方法对合成中各步产物进行了表 征。 采用原子力显微镜( a f m ) 、硫代黄色素( t h t ) 荧光光谱和电化学 等方法研究了近生理条件下各种抑制剂与p 淀粉样蛋白( a p 4 2 ) 的相互 作用。原子力显微镜实验结果表明，g p r f c a 与a 1 3 4 2 之间存在特异 性相互作用，能有效地阻止a 1 3 4 2 纤维化。硫代黄色素( t h t ) 荧光光谱 实验结果表明，g p r - f c a 抑制和分解a 1 3 4 2 纤维的效果都要优于g p r ， 并且5 倍量比的g p r - f c a 对a 1 4 2 具有良好的抑制和分解效果。利用 电化学方法实时检测并证实了g p r f c a 与a p 4 2 之间的相互作用。原 子力显微镜结果证实了i a l 3 5 是种有效的寡肽类a p 抑制剂，能有效 地抑制a t 4 2 的聚集。硫代黄色素( t h t ) 荧光光谱实验结果表明， f c i a l 3 5 能有效地抑制a p 4 2 纤维的形成，并且能有效地分解已形成的 a 1 3 4 2 纤维，其抑制和分解a 1 3 4 2 纤维的效果都要优于i a l 3 5 。 关键词二茂铁衍生肽，合成，表征，p 一淀粉样蛋白，a 1 3 抑制剂 硕士学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t i nt h i ss t u d y , t w ot i t l ec o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e df r o mf e r r o c e n c e ： ( 1 ) f e r r o c e n y lt r i p e p t i d e s ( c o m p o u n d 10 ，g p r - f c a ，b o c - g l y p r o a r g ( n 0 2 ) 一f c c o o m e ，y i e l d7 2 5 ) ；( 2 ) f e r r o c e n y lp e n t a p e p t i d e s ( c o m p o u n d1 7 ，f c - i a l 3 5 ，f c - l e u - p r o p h e p h e a s p ( o m e ) 一o m e ，y i e l d 17 8 6 ) a n dt w o t y p i c a l i n h i b i t o r sf o r i b - a m y l o i dp e p t i d e w a s s y n t h e s i z e db yp e p t i d es y n t h e s i s ：( 3 ) t r i p e p t i d e s ( c o m p o u n d1 1 ，g p r ， b o c g l y p r o a r g ( n 0 2 ) 一o m e ) ；( 4 ) p e n t a p e p t i d e s ( c o m p o u n d1 9 ，i a 3 5 ， a c l e u p r o - p h e - p h e a s p o h ) t h ei rs p e c t r u m ，u v - v i ss p e c t r u m ，1 h n m ra n dm a s ss p e c t r u mw e r er e c o r d e di ne a c hs t e pt oc h a r a c t e r i z et h e c o m p o u n d s a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，t h i o f l a v i nt ( t h t ) f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p ya n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o nb e t w e e np - a m y l o i d ( a p 4 2 ) a n de a c ha 3i n h i b i t o ri nv i t r o i n l i g h to fa f mr e s u l t s ，t h ep r e s e n c eo fg p r - f c ai n h i b i t sa d 4 2f i b r i l s a g g r e g a t ef o r m a t i o ng r e a t l yi nv i t r o ，w h i c hp r o v e dt h a tt h e r ei so fg r e a t b i n d i n gc a p a c i t yb e t w e e ng p r - f c aa n da p 4 2 a se v i d e n c e di nv i t r ob y t h tf l u o r e s c e n c em e t h o d ，g p r - f c ai n h i b i t sa p 4 2f i b r i l l o g e n e s i sm o r e s t r o n g l yt h a ng p ri t s e l f , a n d5m g p r - f c ai st h eb e s tf o ri n h i b i t i o na n d d i s a s s e m b l yo fa p 4 2f i b r i l s m e a n w h i l e ，e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sw e r e u s e dt oq u i c k l yi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng p r - f c aa n da d 4 2 n v i t r o a se v i d e n c e d nv i t r ob ya f m ，t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a ti a l 3 5i sa t y p i c a lo l i g o p e p t i d ei n h i b i t o r f o ra p 4 2a n di sa b l et oi n h i b i ta n d d i s a g g r e g a t ea p 4 2f i b r i l l o g e n e s i s b yt h tf l u o r e s c e n c em e t h o d nv i t r o ， t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tf c - i a l 3 5i n h i b i t sa p 4 2f i b r i l l o g e n e s i s m o r es t r o n g l yt h a ni a l 3 5i t s e l fm o r e o v e r ，f c i a f l 5i sa b l et op a r t i a l l y d i s a g g r e g a t ep e r f o r m e df i b r i l s k e yw o r d sf e r r o c e n y lp e p t i d e ，s y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，1 3 - a m y l o i d p e p t i d e ，a 1 3i n h i b i t o r 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 胁珥年月上日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名： 眺鼍年工月出 硕士学位论文第一章文献综述 1 1 二茂铁 第一章文献综述 1 9 5 1 年k e a l y 和p a u s o n 拟由环戊二烯基溴化镁与三氯化铁反应实行合成富 烯计划时，却意外地制得了二茂铁( f e r r o c e n e ) 。几乎在同一时间，m i l l e r 等用 环戊二烯和铁在2 7 2 7 及常压下反应制得了二茂铁1 2 j 。w i l k i n s o n 和w o o d w a r d 通过红外光谱、磁化率以及偶极矩的测定，确定二茂铁是一种具有兀键型夹心结 构( s a n d w i c h ) 的新型金属有机配合物。 二茂铁奇特的分子结构引发了科学家们的强烈兴趣，对二茂铁及其衍生物的 合成、性质、结构的研究工作十分活跃，已成为现代化学中一个热点研究领域。 1 1 1 二茂铁的结构及性质 二茂铁是夹心化合物的代表，它的分子结构和成键方式已经用x 射线衍射 法和分子轨道法进行了详细的研究，其结构如图1 1 所示。 f o 5 i 4 。1 。 3 2 图1 1 二茂铁的结构 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f f e r r o c e n e 二茂铁是具有高度稳定性和芳香性的富电子体系，两个环戊二烯负离子提供 2 6 = 1 2 个电子，中心离子f e 2 + 的d 轨道提供6 个电子【l 】，它的结构符合1 8 e 规则， 键合情况可以用l c a o m o 近似方法处理。整个二茂铁基团是一个很好的推电 子基团，对于具有电子给体受体共轭结构的分子，给体受体强度越大越有利于 体系形成电荷转移的共振态，扩大兀电子的流动范围【3 j ，当它通过兀共轭体系与 受体( 醛基、酯基、氯取代基和硝基取代苯基等) 相连时，易于发生分子内电子转 移，能有效的诱导体系的非对称极化，使共轭体系尽可能得到扩展跟延伸，这样 分子具有较大非极性极化率。 二茂铁的夹心结构，使其呈现出特殊的化学性质【4 ，5 1 ，它不能进行加成反应， 不易发生还原反应，但易发生亲电取代反应，具有突出的芳香性。 r o s e n b l 啪【6 i 等总结出二茂铁衍生物的红外光谱规则：( 1 ) 1 1 0 0 1 0 0 0 规则： 带 硕士学位论文第一章文献综述 二茂铁在3 0 1 0 、1 4 2 0 、1 1 0 0 、1 0 0 0 和8 2 0c m d 处有振动吸收，如果有一个茂环 未被取代，就会出现11 0 0 和1 0 0 0c m 。1 特征吸收；若两个茂环均被取代，则两峰 消失；( 2 ) 9 1 7 规则：1 , 2 二取代二茂铁在9 1 7c m 1 处有一个中等强度的吸收峰； ( 3 ) 9 1 7 - 9 0 5 规则：l ，3 二取代二茂铁在9 1 0c m 。1 附近有双峰。 1 1 2 二茂铁衍生物的生物( 理) 活性 二茂铁衍生物之所以能在医学、药学、生物学、微生物学等方面得到广泛应 用是因为它们具有特殊的结构和性质。首先，二茂铁衍生物具有亲脂性，使其能 顺利通过细胞膜，与细胞内的各种酶、d n a 、r n a 等物质起作用，因此可能作 为治疗某些疾病的药物【7 8 1 ；其次，二茂铁衍生物具有氧化还原可逆性，该特点 使其在生物酶的作用下，能参与各种代谢作用；第三，二茂铁衍生物具有芳香性， 易于发生取代反应，具有一定厚度的夹心结构，能阻止二茂铁衍生物接近某些酶 的活性位点，具有较强选择性；同时，二茂铁衍生物稳定性好、毒性较低【9 1 ，具 有多种生物( 理) 活性，如抗肿瘤、杀菌、杀虫、治贫血、抗炎、调节植物生长、 抗溃疡、酶抑制剂等。因此，二茂铁衍生物在生物学、医学、微生物学等领域有 广泛的应用i j 景。 ( 1 ) 抗肿瘤活性 1 9 9 4 年k a t t i 等【l o l 厶成- j f e ( i i ) p d ( i i ) 杂三金属有机化合物 【( f c 2 c h n nc h 3 ) 2 1 2 p ( e ) r p d c l 2 ( r = m e ，e t ，p h ，e = o ；r = o e t ，e = s ) ；n e u s e 【l l j 等合成了结构类似于顺铂的配合物 f c c h ( c h 3 ) n h 2 p t c l 2 ，它们均为潜在的抗肿 瘤试剂；特别是席夫碱类二茂铁衍生物，由于酰腙有较强的生物活性，又易与金 属离子配位，将二茂铁基引入酰腙，并与金属离子形成配合物，具有独特的抗肿 瘤、抗癌、抗结核等生物活性1 2 1 。比较典型的抗癌药物有j a o u e n 等【1 3 1 研究的一种 用于治疗乳腺癌的药物三苯氧胺。 9 0 年代以来，具有抗癌活性的二有机锡羧酸酯配合物的研究日益受到重视， 二茂铁衍生物的生物活性亦呈现良好的应用前景，因此对于含二茂铁基的二有机 锡羧酸酯配合物的研究也是人们感兴趣的课题之一。t a o 【1 4 j 等合成了系列配合物 f c c 0 2 s n ( n b u ) 2 1 2 0 2 ， f c c 0 2 ( c h 2 ) 2 c 0 2 s n ( n - b u ) 2 1 2 0 2 和 p f c p h c 0 2 s n b u ) 2 1 2 0 2 ，其分子结构和t i e k i n k 1 5 】总结的二有基锡羧酸酯中常见的分子结构 有明显不同，在它们的分子结构中羧基( c 0 2 ) 与锡的配位方式也明显不同。该课 题组还研究了双二茂铁羧酸二有机锡配合物，经初步的生物活性测试，它们均有 明显的抗癌活性1 1 6 1 。 ( 2 ) 杀菌和杀虫活性二茂铁衍生物可用作杀虫剂和杀菌剂。1 9 7 6 年e d w a r d 在青霉素和头孢菌素上引入二茂铁酰基后，其杀菌活性大大提耐1 。7 】；苯甲酰基 二茂铁是有效的杀微生物剂，( 3 ，4 二甲基) 苯甲酰基二茂铁可用于杀灭黄瓜霉菌 。二茂铁基拟除虫菊杀虫剂是二茂铁硫醚的环烷酸酯【1 9 】；由苯甲酰基二茂铁 硕士学位论文 第一章文献综述 和1 ，l 二苯甲酰基二茂铁与炔基锂合成的二茂铁羟基炔衍生物也具有较强的杀 菌活性。研究表明，在几十种二茂铁衍生物杀菌剂中，卤化酰基二茂铁是最活泼 的杀菌剂。此外，含二茂铁甲酰基的硫脲衍生物均具有一定的植物生长调节活性 和杀菌活性【2 0 j 。 ( 3 ) 抗炎和治贫血等其它生物( 理) 活性k l i m o v a l 2 1 】等人合成的含二茂铁的 环丙烷有很好的抗炎效果。另外，铁元素是动物和植物所必需的微量元素之一。 动物如果缺乏铁元素，会造成贫血症：植物缺铁，则会出现萎黄病等【2 2 。二茂 铁甲酰基衍生物f c c o r ( r = m c 6 h 4 c 0 2 e t ，c h ( c h 2 m e ) ( c h 2 ) 3 m e ，c h m e c h 2 c h 2 m e 等1 对动物或人的贫血均具有一定的治疗效果。 1 2 老年性痴呆 老年性痴呆，又称阿尔茨海默病( a l z h e i m e rd i s e a s e ，a d ) 是进行性神经退化 疾病，是一种发病率几乎与年龄成对数关系的【2 3 1 。该病由德国医i ) 开i a l o i s a l z h e i m e r 于1 9 0 6 年首先发现【2 4 1 ，并以其名字命名。在6 5 岁以上老年人中的发病 率为7 1 0 ，8 0 岁以上老年人中发病率大约为4 0 1 2 引。2 0 0 5 年据权威医学杂志 t h el a n c e t ) ) 报告估计全世界有2 4 3 0 万人患有痴呆，仅2 0 0 6 年全球即新增患者 约4 6 0 万人【2 4 】。2 0 0 7 年，新的数据显示，患者人数已经高达2 5 0 0 万【2 6 1 。目前我国 大约有6 0 0 万人患有a d ，是世界上老年人口最多的国家，也是世界上老龄化速度 最快的国家之一。2 0 0 4 年底，我国6 0 岁及以上人口已经达到1 4 3 亿，至u 2 0 5 0 年， 老年人口规模将达到4 3 7 亿。 1 2 1 老年性痴呆病因 老年性痴呆以p 淀粉样蛋白( a m y l o i dd p e p t i d e ，a p ) 沉积、老年斑( s e n i l e p l a q u e s ，s p ) 、双螺旋纤维( p a i r e dh e l i c a lf i l a m e n t s ，p h f s ) 和神经纤维缠结 ( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t s ) 形成以及学习记忆相关部位大脑神经元缺失为主 要特征，表现为进行性记忆功能受损、认知功能紊乱及行为状况改变，并失去社 交能力，语言功能障碍，最终生活不能自理。a d 的主要病因是病人大脑中p 一淀 粉样蛋白( a d ) 的异常聚集【2 7 1 。研究表明：脑神经细胞外聚集形成老年斑的a p 是 由转膜蛋白( d 淀粉样前体蛋白，a p p ) 水解生成的，如图1 2 所示。a p p 是一跨膜 糖蛋白，分为三部分：膜外区、跨膜区、膜内区。a 1 3 由a p p 细胞外的2 8 个氨基酸 和跨膜部分的1 2 个氨基酸组成。a d 位于a p p 的疏水部分，具有很强的聚集性，易 形成极难溶解的沉淀。研究表明，至少有三种蛋白水解酶：0 【分泌酶、p 分泌酶、 p 分泌酶参与a p p 的代谢，其中p 分泌酶、p 分泌酶的作用与a p 的形成有直接关 系。a p p 的水解主要有非淀粉样肽源性途径( 结构性分泌) 和淀粉样肽源性途径两 条。生理条件下，多数a p p 由仅分泌酶裂解成可溶性的a p p 肽，a p p 肽再进一步 硕士学位论文 第一章文献综述 被丫- 分泌酶裂解产生a p ，此为前一途径。后一途径为在胞质溶酶体内，在p 分泌 酶和p 分泌酶的连续作用下裂解成a 9 网。 菸残幻x 零 ， 霞 l 貉铷雕嘲l 一p _ j c 蜘i 锄料钟c u i w 勉眺i lc 削b 耐蹿嘲撇曲嘲鼬 矗a 糟蝎 ，- h ， 广j l1 ，、i ： 一 f，簟l 器：酬 削i鬻 lli 鳓 f 棚鹳瑚趔爨i 蝣鳓削渤嗍嘲呦幽溺翰辫嘲嘲嘞潮瞄翻粼蝴 l 霸黟奢a 触昝黎刚弼囤嘲飘搿黝镯瞧期弹禳觏列嗡绷嗡| ； l 嘲豳嘲熊阉隅l 纛 p - 簟撼，- ja p 4 0 毅醚第翔明嘲鳓鹰辆静翻隰艄照褊暇黝潮删嘲以瞒黼啜热俺 翻豳嘲黼1 嗍豁黻辫鞠镁辫嚣嘲黝焖争罐瞬姻鲷警翱既隧固黼粼糌蠢稠鬻瓣媚鬣鲞v l 捌鞫- 黝各掰鞠嗷绷溯瞪硼剿糊嘞强a 辅豫糊鞠哟淑翰酾渤茂粼飘鲥诵雕孙 l 蝴却瞄钧掰治哺嘲翮降矧躞附臻澍鞠憩 翻翻。嘲辆潋w v = 淼啼a p l 7 4 0 溉辚糊蠛嘲瀚黼婚嘲瓯躲黼 嘲翻蛾醐辫哟鳓麓鐾魄翻黼锎瞧蹦搿蠛弼糊鞠湖黼栈删 稃约翻黼 图1 - 2 肛淀粉样蛋白的序列结构图 f i g 1 _ 21 1 皓s e q u e n c es t r u c t u r e so fa m y l o i db p e 撇 1 2 2d 淀粉样蛋白的研究 p 一淀粉样蛋白( a m y l o i d 俐d e ，a 脚是由4 0 - 4 3 个氨基酸残基构成的，具有 折叠构型、长4 k d 的多肽蛋白，主要包括a p4 | d 和ap 1 4 2 两种分子( 一级结构如图1 - 2 ) 。 a 陆倾向于形成斑块样的沉积，a 陬从产生到凝集的过程中，在不同的阶段有不 同的致病作用例。早期的体内、外实验均表明，刚产生的可溶性寡聚体和纤丝状 a p 具有很强的神经毒性网，所以防止其形成低聚体或者增强它从大脑中清除是 最根本的方法。同时，a p 具有较强的聚集能力，其相互聚集形成的纤维具有毒 性，能够促发炎症级联反应、轴突损伤、突触丢失和细胞凋亡等病理改变，是导 致神经元变性乃至形成痴呆的重要因素【3 l 】。研究a d 分子结构及其纤维形成的机 制，探讨阻止其聚集的方法，在a d 的防治研究中有着重要的意义。 由于a p 是疏水性很强的多肽，在水中溶解度较低，容易聚集【2 3 】，因此对其 分子结构的研究比较困难。随着蛋白质分子研究方法的不断发展，x 线衍射、固 相核磁共振：圆二色光谱以及投射电子显微镜等技术的应用使得人们对a 8 分子 结构及其形成纤维的机制有了更多的认识。a d 结构中的疏水区域对于调节a d 纤 4 硕士学位论文 第一章文献综述 维的形成起着重要的作用，由于疏水氨基酸主要位于羧基端，所以羧基端的长度 决定其溶解性的高低，并影响聚集成纤维的速度。a 1 3 4 2 相对于a 1 3 4 0 在羧基端多出 2 个疏水性氨基酸，其疏水性增强，较易聚集。圆二色光谱分析表明，a 1 3 4 2 的构 象也要i ：i ：a 1 3 4 0 紧密。这些差异导致了这两种蛋白不同的聚集行为1 3 2 】。a d 4 2 c 端的 1 0 个氨基酸残基3 3 - 4 2 及5 个氨基酸1 7 2 1 构成t a l 3 4 2 的疏水区( 以a 1 3 的n 端第一个 氨基酸编号为1 ) ；2 8 4 2 氨基酸残基形成d 折叠构象的可能性较大，而9 2 1 的氨基 酸残基也可能形成p 折叠构象。c 端的v a l 4 0 l l e 4 l a l a 4 2 这三个氨基酸残基对p 的构 像起到了稳定的作用，有利于p 折叠的形成。a d 4 2 的n 端具有亲水性，根据溶液 条件的不同，能够形成i x 螺旋、无规螺旋或p 折叠的构象。d 折叠的构象有利于 a 1 3 4 2 的聚集。 研究发现 3 3 】，在已形成a p 纤维中，反向平行1 3 折叠结构的存在是其相互聚 集形成纤维的基础。x 线衍射研究发现，在生理条件下a 1 3 的二级结构主要为不 规则卷曲，其疏水羧基末端隐藏在内侧，而以仪螺旋为主的亲水氨基末端暴露在 外侧，此时a 1 3 不溶于水；而a 1 3 纤维中a 1 3 分子的二级结构主要为反向平行的d 折叠，其疏水基团暴露在外部，而亲水基团隐藏在内部，这使得a 1 3 在水中变得 很容易聚集【3 4 】。在a p 纤维形成过程中，a p 分子间通过d 折叠结构上的氢键连结 在一起，形成一种交叉的p 折叠结构( c r o s s1 3 - s h e e t ) ，新的a 1 3 分子又可以通过其 自身的d 折叠连接到前一个分子的末端，这样随着连接的分子的不断增多，逐渐 形成了a 1 3 纤维。a 1 3 形成纤维的速度受浓度、p h 值、温度、离子强度等很多因 素的影响【3 5 l ，其中浓度的影响，最为主要，只有在a d 浓度超过o 7 5m g m l 。1 时 才可能聚集成纤维，不过也有实验发现，a 1 3 4 2 在0 1 0m g m l 以便可以开始聚集。 但只有当其浓度达到或大于0 5m g m l 。1 时，才会形成明显的聚集。目前，针对 a 1 3 的研究主要集中在3 个方面： ( 1 ) 减少a 1 3 的产生d 一和丫分泌酶抑制剂的研究。抑制p 和y 分泌酶的活性 或改变a p p 的代谢途径( 抑s t a p p 的过度生成和调节a p p 的裂解) ，可减慢或减少 a 1 3 肽的生成，从而降低脑中a 1 3 肽的浓度并阻止其聚集。如化合物二氟代酮的肽 衍生物【3 6 】可抑制y 分泌酶的活性。但人们目前对这两种分泌酶的性质及其活性认 识得还不全面，在这方面的研究还需要进一步的深入。 ( 2 ) 增力n a l 3 的清除 主要是a d 疫苗的主动免疫和被动免疫治疗。主动免疫 应用a p 多肽疫苗，a 1 3 疫苗能使认知稳定，缓解痴呆的进程神经病理学检查发现， 脑片层的a 1 3 减少，但与a d 相关的病理现象没有发生变化。被动免疫应用抗a 1 3 的抗体。抗a 1 3 抗体的产生与缓解a d 的发展密切相关。尸体解剖结果显示，与未 免疫的脑组织相比较，免疫后患者脑组织各区域的a 1 3 沉积斑消失或稀少，其他 的一些病理学现象与对照组并无差别【3 7 1 。a d 疫苗还存在一些问题，例如在3 7 5 硕十学位论文第一章文献综述 例受试者中约有5 的患者产生了脑膜炎。 ( 3 ) 阻止a p 的聚集a 1 3 聚集抑制剂和阻断肽的研究，研究主要集中在有机 小分子【3 8 1 和多肽3 9 1 。目前在多肽方面的研究是重点和热点。 1 3 多肽抑制剂 目前，a p 疏水区结构的重要性引起了科学家们的重视。a d 的阻断药物有两 大类，即有机小分子类【3 8 1 和多肽类( 包括多肽模拟物) ，其中以多肽类为主【3 9 1 。 1 3 1g p r 三肽 据文献报道，g l y p r o l i n t 4 0 】是一类具有特殊生物( 理) 活性的多肽类物质。研究 者 4 1 , 4 2 】研究了该系列中的三肽g l y - p r o a r g ( g p r ) ，发现g p r 作为阻断肽能与a d 在体内发生特异性相互作用，能够有效抑制神经细胞的凋亡。 1 3 2i a d 5 五肽 研究1 4 3 j 结果发现a d 的疏水区a p l 6 - 2 0 的五肽n 1 4 2 l y s l e u v a l p h e p h e o h 能 与a p 相结合，从而阻止其聚集。通过丙氨酸逐个取代，表明l y s l 6 、l e u l 7 和p h e 2 0 在其中起了关键作用。这说明了a p l 6 2 0 残基是a p 聚集过程中与邻近a d 肽链相 结合的部位【4 3 1 。利用上述认识，s o t o 等m 】设计了几个d 片层阻断肽( d s h e e tb r e a k e r p e p t i d e ) 的候选物，进行动物实验，其中叫h e l p f f d o h ，i a l 3 5 ) 抑制聚集的效果 较好，而且还可以抑制a d 多肽的神经毒性1 4 5 l ，不过i a l 3 5 在3 7 的血浆中试验 稳定性较差m l 。为了增加其对酶分解的抵抗能力，通常对其中的氨基酸进行化 学修饰，主要包括对多肽分子侧链基团的改变和主链结构的改变这两种方法。 s o t o 47 】等对i a l 3 5 分子的n 端和c 端分别进行了乙酰化和酰胺化改性，得到了 a c e t y l l p f f d a m i d e ( i a 3 5 p ) ，通过腹腔注射纤维化a d 使大鼠发生行为障碍，然后 检验由i a l 3 5 p 对神经元的保护作用，1 个月后发现已形成的a d 沉积斑部分减少， 注射位置的星形胶质细胞明显减少。i a l 3 5 p 不仅能阻止a d 纤维形成，且对a p 纤 维具有分解作用。不过i a l 3 5 p 在鼠身上进行的药物( 代谢) 动力学表明i a p 5 p 的半 衰期只有3 7 分钟。g o r d o n 等用d 一氨基酸取代l 氨基酸，其稳定性得到提高【4 8 】。 因此，有效性和抗酶解稳定性是当前a p 阻断肽药物存在的两大瓶颈，亟待研究 开发新一代高效、抗酶解的治疗a d 的药物。 1 4 多肽 1 4 1 多肽研究进展 蛋白质是机体内最重要的一类生物大分子。目前被广泛地作为药物用于人类 疾病的治疗。然而，由于蛋白质类药物具有分子量大、制备困难、抗原性强、毒 6 硕士学位论文第一章文献综述 警小h 衬喝烽0 科警斟耥胥 哆、警如2 毋一散b 氛2 良 影 、d 10n 硕十学位论文第一章文献综述 确定的肽键来实现，包括以下三个步骤：( 1 ) 需要制备部分基团被保护的氨基酸， 氨基酸的两性离子结构不再存在；( 2 ) 形成肽键的两步反应，n 保护氨基酸的羧 基必需先活化为活性中间体，随后形成肽键。这偶合反应既可作为一步反应进 行，也可作为两个连续的反应进行；( 3 ) 对保护基进行选择性脱除或全脱除。多 肽形成的简要化学反应过程如图1 3 所示。此过程中氨基酸的羧基被一个较强的 吸电子基团取代，使羧基活性增强，碳原子亲电性同时增强，另一个氨基酸的氨 基的亲核进攻更加容易而发生偶联反应；肽键形成之后，将保护基团y 1 ，y 2 去 掉【5 1 1 。 1 4 3 多肽合成方法 多肽合成主要有两种方式：液相合成和固相合成。最早的多肽合成是将需要 合成的氨基酸或短肽配成溶液，其中的氨基端和另外的羧基端以及不发生反应的 侧链基团被有效的化学基团保护，而参加反应的氨基端和羧基端则分别活化，在 溶液中偶联在一起，发生化学反应。反应完毕后，需用各种方法将未参加反应的 原料试剂、活化试剂分离除去，以纯化合成产物【5 2 1 。由于其操作步骤烦琐，未 反应试剂及原料难以完全清除，因此最后产品的肽段很难纯化，并且反应后切割 保护基团的方法较为复杂，因此液相合成法的使用受到很大限制。 多肽固相合成法是目前多肽合成中最常用的方法，它是由m e r r i f i e l d 于1 9 6 3 年成功创立的，其原理是把多肽c 端第一个氨基酸通过其羧基偶联固定在不溶性 树脂上，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护 基，并同过量的活化羧基组分反应接长肽链，重复( 缩合、洗涤、去保护、中和 和洗涤、及下一轮缩合) 操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上 裂解下来，经过纯化等处理，即得所需多肽【5 0 l 。多肽的固相合成与液相合成相 比优点在于： ( 1 ) 大大简化反应后处理操作不溶性载体键合成的聚合物只要简单地反 复过滤和洗涤，即可从可溶性的溶剂和副产物中分离出来，省时、省力； ( 2 ) 可充分利用热力学和动力学因素促进反应 可溶性试剂可以过量以使 反应完全和获得高产率，过量的试剂可简单地用溶剂冲洗，过滤清除； ( 3 ) 逐步合成更为简化 因为所有的反应都可以在一个容器中进行，因而也 避免了反应中间体转移的手续和损失； ( 4 ) 易于实现自动化所有的操作包括聚合链的增长都可实现自动化； ( 5 ) 树脂再生如果选择适当的连接分子和裂解条件，高分子树脂可再生重 复使用。 “ 1 4 4 多肽的固相合成 ( 1 ) 固相合成步骤 硕士学位论文第一章文献综述 固相合成一般由目的多肽的c 端到n 端逐步合成，避免了氨基酸消旋的风险。 其基本步骤如下： ( a ) 将第1 个a n 保护氨基酸接到树脂上1 5 3 j 首先树脂在适宜溶剂中溶胀， 然后加入缩合试剂以及相关试剂进行反应，室温下反应若干小时，检测反应进行 程度，若达到反应要求，则终止反应并封闭树脂上未反应的羟基，最后检测是否 封闭完全。 ( b ) 脱去t z - n 端保护基对于逐步完成的固相多肽合成，保护基分为2 种：( a ) 侧链保护基，合成完毕后在不影响目的肽链的情况下被去除，这类保护基目前常 用的有b o c 、t b u 、p b f , t r t 、o t b u 、b z l 、t o s 等，反应完毕后这些保护基可以用 t f a 脱去：( b ) 仅- n 端保护基，在每一个肽键形成后被脱去，要求脱去过程不影响 肽链的进一步加长，也不影响侧链保护基的稳定，目前主要利用的是f m o c 保护 基，用哌啶与d m f 混合液来脱去f m o c 保护基。 ( c ) 肽键生成在脱去t z - n 保护基的肽链或者氨基酸的溶液中，加入下一个 羧基活化的0 c n 保护氨基酸，进行偶联反应，使肽链进一步加长。常用的活化羧 基的试剂即缩合试剂主要有d c c 、t b t u 、h b t u 、h a t u 、h d t u 和h d a t u 等【5 4 】。这些缩合试剂在二氯甲烷等非极性溶剂中既可以直接催化0 【n 保护氨基酸 间游离氨基发生偶联反应，也可以先同0 【n 保护氨基酸发生反应生产0 【n 保护氨 基酸活化酯或对称酸酐，再同游离氨基发生反应生成肽键。反应究竟以何种方式 进行取决于反应条件。在液相接肽反应中，可能主要是直接偶联反应；而在固相 接肽反应中，由于碰撞机会减少，主要是先生成对称酸酐，再同胺反应。若先将 n 保护氨基酸同带有胺基组分的树脂预先平衡足够时间，使n 保护氨基酸同氨 基组分形成离子键结合，然后加入缩合试剂，则肽键的生成主要是直接偶联反应。 ( d ) 重复步骤b 和步骤c ，直至目标多肽合成完毕。 ( e ) 将目标多肽从树脂上切下，得到目的肽链f m o c 固相合成中，以t f a 溶 液切下目的肽链。t f a 溶液中一般含有1 0 水、硫醇或硅烷等中的一种，它们可 作为清除剂用来清除反应过程中的烷化作用【5 5 1 。肽链切落后过滤，滤液滴入乙 醚中，沉淀目的肽链，静置一段时间，离心得到目的多肽粗品。目的多肽粗品通 过h p l c 等 5 6 , 5 7 】方法纯化，得到多肽纯品。 ( 2 ) f m o c 固相法 在b o c 固相合成中反复用酸脱除保护基，然后用h f 把肽段从树脂上裂解下 来，不可避免地会引起或多或少的副反应，其中包括某些侧链保护基的不稳定， 已延长的肽链从固相支持物上的逐步损失，还有a s p 、g l u 等氨基酸残基的侧链 变化等1 5 引。1 9 7 0 年睦i c a r p i n o 和h a n 提出了一种烷氧羰基型氨基酸保护基n 芴甲氧 羰基( f m o c ) 。该方法与经典固相多肽合成相比，具有反应条件温和、副反应少、 9 硕士学位论文第一章文献综述 产率高等优点，被广泛用于各种活性多肽的合成【5 9 1 。近几年来，国内一些实验 室也开始应用此方法，并有一些成功的实例【6 0 】。f m o e 作为氨基保护基的优点在 于它对酸稳定，用t f a 等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，通过d 消除 反应即可脱去，不需用三级胺中和。与n f m o e 基团配套的侧链保护策略为对碱 稳定的叔丁氧羰基( b o e ) 等。肽段最后用t f a d c m 定量地从树脂上切除避免 了采用强酸，如h f 可能产生的氯基酰化等副反应。但f m o e 保护的氨基酸价格昂 贵，合成成本也相应较高。 ( 3 ) 多肽固相合成装置 在固相法合成多肽时，可以简便快速的使用手工合成装置，如图1 4 所示【6 l 】。 ( a ) 将反应瓶磨口盖a 与反应瓶b 和圆底烧瓶c 的磨口连接，t 型三路活塞则 与氮气瓶减压阀出口连接。 ( b ) 反应或洗涤时，打开a 磨口盖，将反应液及树脂或洗涤液置反应瓶b 的 砂芯上。打开氮气瓶减压阀通气，让氮气通过t 型三路活塞的d 3 至d 2 ，关闭d 1 ， 同时调节反应瓶b 的三通活栓，开通b 瓶与b 3 的活栓阀，关闭b 瓶与c 瓶的连接， 再关闭c 瓶的两路活栓。此时通入的氮气自下而上进入b 瓶内可使瓶内溶液产生 气泡而起混匀作用。 ( c ) 反应完毕或洗涤完毕后，开放c 瓶的两通活栓，将b 瓶的三通活栓旋转 至使b 瓶与c 瓶连接，并关闭b 3 与d 2 的连接。同时将t 型三路活塞调至d 3 与d l 连 通，关闭与d 2 的连接，并盖好a 磨口盖。此时开通的氮气由氮气瓶出口一d 3 一 d 1 一a 1 ，自上而下进入反应瓶b 内产生正压，使b 瓶内液体流入c 瓶，树脂则留 在b 瓶的砂芯上，起到过滤作用。 图1 4 手动合成装置 f i g 1 - 4m a n u a lp e p t i d es y n t h e s i sb u b b l e rv e s s e l ( 4 ) 茚三酮显色法( k a i s e r 法) 茚三酮显色法( k a i s e r 法) 【5 纠，是用茚三酮颜色反应快速测定树脂上的氨基， 1 0 硕士学位论文 第一章文献综述 从而判定酰化反应是否完全；用茚三酮法检测聚苯乙烯树脂氨基的灵敏度可达到 5i _ t m o l g 。这样的灵敏度已可检测出缩合反应是否进行了9 9 以上。茚三酮检测 时，由于末端氨基酸残基及序列不同，出现的颜色强弱不同：天门冬氨酸( a s p ) 、 天门冬酰胺( a s n ) 会产生很弱的蓝色或淡棕色。生色试剂2 ，4 ，6 三硝基苯磺酸与树 脂上氨基反应显示橙红色，灵敏度为3p m o l g 树脂。 显色反应机理：各种伯氨基酸的氨基酸和茚三酮反应都会得到相同结构的 有色缩合物( 见图1 5 ) 。 0 + h a n - + c h c o o - 斗 r n + r c h o + c 0 2 i + 3 h 2 0 1 4 5 多肽的应用 多肽在医药方面同样具有很大作用。它作为药物具有分子量小，无免疫原性， 较为安全；分子较小，易于合成，成本低；结构相对简单，功能较明确，特异性 强，副作用低；多肽药物易于多途径吸收；合成的多肽纯度高，不存在热原问题 等优点。目前已有2 0 多种多肽药物上市( 如血脂康、地奥血脂康等) ，按其作用 功能可分为多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、导向多肽、细胞因子模拟肽、 抗菌活性肽、降压降脂多肽等【6 2 j 。 1 5 蛋白与多肽相互作用的研究方法 蛋白与多肽之间相互作用的研究，不仅有助于从分子水平上了解蛋白与多肽 的作用机理与规律，而且有助于认识药物的转运和代谢过程，为新的高活性的多 肽的设计与开发研究提供有价值的信息及理论指导。 日前，蛋白与多肽结合作用的研究热点己从纯实验的方法研究转移至分子机 理和预测方面的研究【6 3 - 6 5 1 。对于蛋白与多肽相互作用的研究，目前有许多方法与 技术被引入此研究领域，比如紫外一可见吸收光谱、拉曼光谱、荧光光谱、傅里 叶转换红外光谱、核磁共振、质谱、电化学、渗析、微量热技术等等。综合运用 各种方法和手段可以得到有关蛋白与多肽结合的各种信息。 1 5 1 电化学分析法 近年来电化学分析方法在蛋白与多肽相互作用中也得到广泛的应惭 6 7 】。它作 为一个很活跃的领域，其研究方法也处在不断的发展中，如循环伏安法、线性扫 描伏安法、常规脉冲法、差示脉冲法、计时电量法等等。 硕士学位论文 第一章文献综述 电化学方法在研究蛋白与多肽相互作用时，主要是根据蛋白与多肽作用前后 氧化还原峰电流的变化，峰电位的移动进行分析研究，对于一些吸收光谱比较弱， 或者与蛋白质作用前后光谱变化不明显，无法用紫外可见、荧光等光谱手段来研 究的分子，有可能用直接或者间接电化学方法进行研究，从而获得其他分析方法 无法得到的信息。 但是电化学分析法在一定程度上受分子电活性的限制，另外其需样量稍大， 背景信号干扰相对较强，采用蛋白质修饰电极的方法将有助于此问题的解决。同 时采用多种电化学手段进行研究，能更好的获取有关电化学反应机理、药理作用 机制和生命化学机理等多种信息。 1 5 2 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱是研究蛋白与多肽相互作用的一种最方便的技术。紫外吸 收光谱有助于洞察分析的基本骨架结构或某些生色团的特征。蛋白与多肽的相互 作用会引起吸收带的红移( 蓝移) 现象或增色( 减色) 效应。吸光度减小、吸收带红 移以及等吸收点的形成是蛋白与多肽发生相互作用的光谱标志，同时通过测量不 同浓度作用下的吸光度值的变化，可以进行定性定量分析。 紫外吸收光谱一般与荧光发射光谱相互补充，利用二者图形的重叠部分，按 照能量转移原理求出小分子与蛋白之间的结合距离。 1 5 3 荧光光谱法 荧光光谱法是研究蛋白与多肽相互作用的主要手段，无论是定性还是定量的 研究都获得了成功。它是1 9 世纪发展起来的一种分析方法，具有灵敏度高、选择 性强、用样量少、方法简便等优点。 蛋白质能够发出荧光，是因为蛋白质存在三种芳香族氨基酸残基一色氨酸 ( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 、苯丙氨酸( p h e ) 。蛋白质的荧光通常在2 8 0 n m 或更长的波长 被激发，而p h e 在绝大多数实验条件下不被激发，所以很少能观察到，通常荧光 强度比为1 0 0 ：9 ：0 5 t 6 引，因此，认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基，而 且含色