（营养与食品卫生学专业论文）水产品中磺胺类和氯霉素类兽药残留分析方法研究.pdf

摘要 摘要 随着人们对动物性食品需求量的增加，食品中兽药残留对人类健康的危害 已成为当今突出的食品安全问题。兽药残留不仅可以直接对人体产生急慢性毒 性作用，引起细菌耐药性增强，而且还可以通过环境和食物链的作用间接对人 体健康造成潜在危害。因此，食品中兽药残留量的检测技术日益受到国内外学 者的关注，迫切需要建立快速、灵敏、准确的残留监控、检测方法。 本论文以鳗鱼，龙虾，鲴鱼等水产品为实验对象，研究了水产品组织中磺 胺类，甲砜霉素、氟甲砜霉素药物残留的测定方法。论文共分四个部分，具体 如下： 第一章：详细介绍了磺胺类、氯霉素类药物在兽医临床上的应用，磺胺类、 氯霉素类药物在食品中残留对人体健康的危害。综述了当前兽药残留常用分析 方法及兽药残留分析进展。兽药残留分析一般包括样品前处理和药物分析两大 步骤，样品前处理对分析结果相当重要，前处理包括提取以及净化。样品提取 方式有组织捣碎法、振荡法、索氏提取法、超声波辅助提取、超临界流体萃取、 强溶剂萃取、微波辅助萃取等，样品净化包括液一液分配( u 正) 、固相萃取( s p e ) ， 固相微量萃取( s p m e ) 、免疫亲和色谱( n c ) 、凝胶渗透色谱法( g p c i 等等。药 物分析方法主要介绍了薄层色谱法( t l c ) 、气相色谱法( g c ) 、高效液相色谱法 ( h p l c ) 、色谱一质谱联用法等。 第二章：建立了一种同时测定水产品( 鳗鱼、鲴鱼、龙虾) 中1 3 种磺胺类药 物残留的高效液相色谱法。样品经乙腈提取，正己烷液一液分配，阳离子固相萃 取小柱净化后，采用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。1 3 种 磺胺类药物在0 1 p g 佃l 5 啦g 细l 范围内线性关系良好，相关系数r 2 为 o 9 9 9 7 0 9 9 9 9 ，在添加范围0 0 2 m g k g 1 o m g l ( g ，回收率为6 2 9 7 ，相对标 准偏差为2 0 1 1 0 4 6 。方法对磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺一6 一甲氧 嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噫唑、磺胺二甲异嗯唑、磺胺阍二甲氧嘧啶、 磺胺喹囔啉定量限为0 0 2 m g k g ，磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧 啶、磺胺甲噻二唑定量限为0 0 5 m g k g 。 第三章：建立水产品中甲砜霉素、氟甲砜霉素残留的超高效液相色谱法测 摘要 定方法。样品经乙酸乙酯提取，正己烷液一液分配，h l b 固相萃取小柱净化后， 采用超高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检钡i ，外标法定量。甲砜霉素在 0 0 5 g m l 2 吮g m l ，氟甲砜霉素在0 0 2 5 g m l 1 毗g m l 范围线性关系良 好，相关系数为0 9 9 9 2 0 。9 9 9 8 ，添加回收率为8 0 0 9 5 。8 ，相对标准偏差 为5 6 1 1 2 ，方法对甲砜霉索、氟甲砜霉素检测限分别为1 0 g 瓜g 、舡k g 。 第四章：结论与展望。 关键词：残留分析；磺胺类药物；甲砜霉素，氟甲砜霉素；水产品；高效液相 色谱法；超高效液相色谱 a b s t r a e t a b s t r a c t n o w a d a y s ，p e o p l en e e dm o r ea n i m a lo r i g i nf o o d s t u f f se v e r y d a y , s o t h er e s i d u e s o fv e t g r i n a r yd r u g si n0 1 1 1 f o o d sb e d t i m eo n eo ft h em o s tn o t i c e a b l ep r o b l e m sf o r s e c u r i t y , w h i c hc a u s e sa c u t eo rc h r o n i cd i s e a s et op u b l i ch e a l t h ，a n db a c t e r i at o l e r a n c e t ot h ed r u g ，a l s oc a u s e sm a n yp o t e n t i a lh a r mi n d i r e c t l yt oh e a l t hb yc i r c u m s t a n c ea n d f o o dc h a i n m o r ea n dm o r er e s e a r c h e r sa r e s t u d y i n g o nt h ed e t e r m i n a t i o no f v e t e r i n a r yd r u gr e s i d u e s w ea l s on e e dt od e v e l o ps o m es i m p l e ，s e n s i t i v ea n de x a c t m e t h o d s i nt h i sp a p e r , e e l s ，l o n g s n o u tc a t f i s l l ，l a n g o u s t ea r et h ea n a l y t i c a lo b j e c t sa n dw e r e s e a r c ht h ed e t e r m i n a t i o no fs u l f o n a m i d e s ，t h i a m p h e n i c o l ，f l o r f e n i c o lr e s i d u e si n t h ea q u a t i cp r o d u c t s 1 1 1 et h e s i sc o n s i s t so f f o u rp a r t s t h ed e t a i l sa r ea sf o u w i n g ： i n c h a p t e ro n e ：i n t r o d u c e dt h e h a r mo f s u l f o n a m i d e s ，t h i a m p h e n i c o l ， f l o r f e n i c o lr e s i d u e s , s u m m a r i z e dp r o g r e s so na n a l y t i c a lm e t h o do fs u l f o n a m i d e sa n d s o m eo t h e rv e t e r i n a r yd r u g s t h ed e t e r m i n a t i o no ft h er e s i d u e so fv e t e r i n a r yd r u g s u s u a l l y c o n t a i n st w op r o c e s s e s ： s a m p l ep r e t r e a t m a n t a n dd e t e c t i o n s a m p l e p r e t r e a t m e n ti sv e r yi m p o r t a n tt ot h er e s u l t i tc o n t a i n se x t r a c t i o na n dc l e a n e d u p t h e r ea r em a n ym e t h o d se x t r a c t i n gt h ed r u g sf r o mt h es a m p l e ，f o re x a m p l e ， h o m o g e n i z a t i o n ，s h a k i n g , s o x h l e te x t r a c t i o n ，s o n i c a t i o n - a s s i s t e d e x t r a c t i o n , s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n , a c c e l e r a t e d s o l v e n t ，m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n , a n d s oo n c l e a n e d - u pc o n t a i n s l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ，s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s o l i d p h a s e m i c r o e x t r a c t i o n ,i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , g e l p e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y , a n ds oo n a tp r e s e n t ，m a n ym e t h o d sh a v eb e e nr e p o r t e di nt h e l i t e r a t u r ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h er e s i d u e si na n i m a lt i s s u e s s u c ha sh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , g a sc h r o m a t o g r a p h y , c h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y , t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y i nc h a p t e rt w o ：ah i 【曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o dh a sb e e n d e v e l o p e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no ft h i r t e e ns u l f o n a m i d e sr e s i d u e si n a q u a t i cp r o d u c t s ( e e l s l o n g s n o u tc a t f i s h ，l a n g o u s t e ) 1 1 圮s a m p l e sw e r ee x t r a c t e d w i t ha c e t o n i t r i l e ，a n dt h e nc l e a n e du pb yn - h e x a n el i q u i d l i q u i de x t r a c t i o na n ds o l i d i i i a b s t r a c t p h a s ee x t r a c t i o n t h e r e s i d u e sw e r ed e t e r m i n e d b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yw i t hu l t r a v i o l e td e t e c t i o na n dq u a n t i f i e db ye x t e r n a ls t a n d a r dm e t h o d t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e 0 ，0 2 m g k g f o rs u l f a m g t h a z i n e 。 s u l f a m e t e r , s n i f a m o n o m e t h o x i n e 。 s u l f a c h l o r o p y r i d a z i n e ， s u l f a m e t h o x a z o l e ，s u l f i s o x a z o l e ， s u i f a d i m e t h o x i n e ，s u l f a q u i n o x a l i n e ，a n do 0 5 m g k gf o rs u l f a d i a z i n e ，s u i f a p y d d i n e ， s u l f a t h i a z o l e ，s u l f a m e r a z i n e ，s u l f a m e t h i z o l e t h el i n e a rr a n g e sw e r eo 1 p g m l 5 0 肛g n i l t h ea v e r a g er e c o v e r i e si ns p i k e ds a m p l ew e r e6 2 9 7 i nc h a p t e rt h r e e ：a nu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d ( u p l c ) h a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h i a m p h e n i c o l ，f l o r f e n i c o lr e s i d u e si n a q u a t i cp r o d u c t s t h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e dw i t he t h y la c e t a t e ，n e x t ，c l e a n e du pb y n - h e x a n el i q u i d 1 i q u i de x t r a c t i o n ，t h eu n d e d a y e rw a sa p p l i e dt oh l bs p e e o l u n m t h ec a r t r i d g ew a sw a s h e dw i m 3 m l1 0 m e t h a n 0 1 t h er e s i d u e sw e r ee l u t e df r o m t h ec a r t r i d g ew i t h5 m lm e t h a n 0 1 t h ee l u a t ew a se v a p o r a t e dt od r y n e s su n d e r n i t r o g e ns t r e a m ，a n dt h e nd i s s o l v e di nl m l1 0 a c e t o n i t d l e t h er e s i d u e s w e r e d e t e r m i n e db yu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t hp d a d e t e c t i o na n d q u a n t i f i e db ye x t e r n a ls t a n d a r dm e t h o d t h el i n e a rr a n g e sw e r e0 0 5 g m l 2 ”m l f o rt h i a m p h e n i c o la n do 0 2 5 p g 细l lp g 勉lf o rf l o r f e n i k ：0 1 t h ed e t e c t i o nl i m i t w e r e1 0p g k gf o rt h i a m p h e n i c o la n d5 t g k gf o rf l o r f e n i c 0 1 t h ea v e r a g er e c o v e r i e s i ns p i k e ds a m p l ew e r e8 0 o 9 5 8 i nc h a p t e rf o u r ：c o n c l u s i o na n de x p e c t a t i o na r er e v i e w e d k e yw o r d s ：r e s i d u ea n a l y s i s ；s u l f o n a m i d e s ；t h i a m p h e n i c o l ；f l o r f c n i c o l ；a q u a t i c p r o d u c t s ；h p l c ；u l t r ap e r f o r m a n c el c 缩略语注释 h p l c ： u p l c ： g c ： l c m s ： g c m s ： i a c ： g p c ： t l c ： l l e ： s p e ： s p m e ： s a s s d ： s p d ： s t ： s m i ： s m 2 1 s t z ： s m t s m m ： s c p ： s m z ： s i z ： s d m ： s q ： c a p 躬 缩略语注释 h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o 画a p h y ，高效液相色谱 u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，超高效液相色谱 g a sc h r o m a t o g r a p h y ，气相色谱 l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ， 液相色谱质谱联用 g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y 。气相色谱质谱联用 i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 。免疫亲和色谱 g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，凝胶渗透色谱 t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 。薄层色谱 l i q u i d 1 i q u i de x t r a c t i o n ，液液分配 s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，固相萃取 s o l i d p h a s em i c r o e x t r a e t i o n ，固相微萃取 s u l f o n a m i d e s 。磺胺类 s u l f a d i a z i n e 。磺胺嘧啶 s u l f a p y r i d i n e 。磺胺吡啶 s u l f a t h i a z o l e 。磺胺噻唑 s u l f a m e r a z i n e 磺胺甲基嘧啶 s u l f a m e t h a z i n e 。磺胺二甲嘧啶 s u l f a m e t h i z o l e 磺胺甲噻二唑 s u l f a m e t e r , 磺胺甲氧嘧啶 s u l f a m o n o m e t h o x i n e ，磺胺一6 一甲氧嘧啶 s u l f a c h l o r o p y r i d a z i n e 磺胺氯哒嗪 s u l f a m e t h o x a z o l e ，磺胺甲基异嗯唑 s u l f i s o x a z o l e 磺胺二甲异嗯唑 s u l f a d i m e t h o x i n e 磺胺间二甲氧嘧啶 s u l f a q u l n o x a l i n e 。磺胺喹嗯啉 c h l o r a m p h e n i c o l s 。氯霉素类 i x 缩略语注释 c a p ： t a p ： f f ： l o d ： l o q ： s ，n ： r s d ： c h l o r a m p h e n i c o l ，氯霉素 t h i a m p h e n i c o l ，甲砜霉素 f l o r f e n i c o l ，氟甲砜霉素 l i m i to fq u a n t i t i o n ，检测限 l i m i to f d e t e c t i o n ，定量限 s i g n a l n o i s e ，信噪比 r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o i l ，相对标准偏差 x 学位论文独创性卢明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌塞堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：懈签字日期： 彬p 年p 月0 2 f t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ：傅j 笫己衽 导师签名( 手写) ： 签字r 期：硼年护月口日签字同期：i ，年d 月p z 只 第一章引言 第一章引言 近2 0 年来，兽药( 包括药物添加剂) 在畜牧业中的应用日益广泛，其在降 低动物发病率与死亡率、促生长、提高饲料利用率和改善产品品质方面的作用 是十分显著的，已经成为现代畜牧业不可缺少的物质基础。但是，兽药的使用 无疑会导致动物体内药物的滞留和蓄积，并以残留方式进入人体或生态系统。 食用含有兽药残留的动物性食品后，一般对人不表现急性毒性作用。但如 果长时间摄入低剂量的兽药残留的动物性食品，则可造成兽药残留在人体内蓄 积，引起各种组织器官发生病变，甚至癌变。兽药残留对人体的危害主要表现 在以下凡方面： i 毒性损害如磺胺类药物可引起泌尿系统损害； “引发超敏反应经常食用一些含低剂量青霉素、四环素、磺胺类药物 及某些氨基糖苷类抗生素等残留的食品，能使易感的个体出现超敏反 应： i i i 导致病原菌产生耐药性； i v 破坏微生态平衡，导致二重感染； v 致畸、致癌、致突变作用； v i 激素作用“1 。 随着社会的进步，科学技术的发展，食品是人类赖以生存和发展的基本生 活资料，人们对自身健康越来越重视，对食品安全性问题也有了更多的了解，食 品安全问题已成为全世界普遍关心的热点问题。 当今，食品安全问题已成为食品国际贸易的重大障碍，也是世界各国用以 设置贸易壁垒的最主要手段之一。2 0 世纪9 0 年代初美国以在我国的蘑菇罐头中 检出肠毒素为由，停止进口我国的蘑菇罐头，仅在1 9 9 9 年8 月至2 0 0 0 年1 月 的6 个月内，美国f o a 就以有害物质超标为由，扣留了6 3 4 批从中国进口的食 品。2 0 0 3 年7 月，日本以查出烤鳗的“恩诺沙星”超标为由，突然宣布对我国 生产的烤鳗实行“命令检查”，我国主动暂停对日本出口，给我国鳗鱼出口造 成巨大经济损失。2 0 0 5 年6 月，受“孔雀石绿”事件影响，福建省烤鳗出口一 度陷入停滞，甚至出现负增长，广东烤鳗出口急降2 1 。 当前人们的生活方式j 下随着收入水平的迅速提高而发生着深刻的变化，从 第一章引言 过去单纯地追求“吃饱”向“吃好”、“吃健康”转变。这必然对食品质量和 食品安全提出新的更高的要求。因此我们不仅需要在源头上控制兽药的滥用，而 且需要开发出快速、灵敏、简单的残留检测方法。 1 1 磺胺类、氯霉素类药物在兽医临床上的应用 自1 9 3 2 年发现第一个磺胺类药物“百浪多息”以来，已有7 0 多年历史， 先后合成的这类药物约8 5 0 0 种，而临床上应用的不过2 0 多种。磺胺类药物能 够治疗多种细菌感染。可用于家畜腹膜炎、呼吸道感染、消化道及泌尿道感染 以及败血症、乳腺炎等等。由于该类药物具有抗菌谱广，性质稳定，使用方便， 价格低廉等优点，因此，磺胺类药物至今在畜禽、水产品等抗感染治疗中仍有 一定市场。 氯霉素类抗生素包括氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素。氯霉素为广谱抑菌 抗生素，对革兰氏阳性和阴性菌都有作用，兽医临床上对多种感染有治疗作用； 甲砜霉素为人工合成广谱抗菌药，2 0 世纪9 0 年代在国内外用于兽医临床，其l 临 床应用与氯霉素相同；氟甲砜霉素是甲砜霉素的单氟衍生物，可用于各种革兰 氏阴性和阳性菌感染，临床上主要用于治疗和预肪畜禽出巴氏杆菌、胸膜肺炎 放线菌及霉形体引起的呼吸系统疾病，也可用于控制敏感菌引起的鱼虾等水产 品疾病。 1 2 食品安全与磺胺类、氯霉素类药物残留 随着我国养殖业的发展，越来越多的抗生素被应用于渔业生产中，这些药 物的使用几乎贯穿养殖的全过程，由于养殖户不遵守休药期规定及未正确使用 药物，造成在水产品中的高水平残留。人长期摄入含抗生素残留的水产品后， 药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用。 通过任何途径摄入的磺胺类药物都会在人体中蓄积，会对人类的身体健康 产生很大的危害。磺胺类药物的副反应有过敏反应、泌尿系统损害、血液系统 的反应，磺胺二甲嘧啶可能引起甲状腺癌。因此，许多国家对动物使用磺胺类 兽药和其在动物源性食品中的残留作了严格的规定。联合国食品法典委员会和 许多国家均规定动物源性食品中磺胺类药物残留总量以及磺胺二甲嘧啶等单个 2 第一章引言 磺胺最高残留量不得超过0 1 m g k g ，而日本规定动物源性食品中日本规定磺胺 甲基嘧啶和磺胺二甲嘧啶残留最大限量为0 0 2 m g k g ，磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲 氧嘧啶和磺胺喹嗯啉残留最大限量为0 0 3 m g k g 。我国也制定了磺胺类药物残留 限量，我国规定动物源性食品中磺胺类药物残留总量不得超过0 1 m g k g ，并己 将其列为国家兽药残留监控项目。 甲砜霉素和氟甲砜霉素同属氯霉素类药物，是一类广谱抗生素，对多种病 原菌有较强的抑制作用，但同时此类药物毒副作用也较大。t a p 主要抑制人的 免疫功能，毒性作用较大，欧共体和美国均禁用于食品动物；而新型氯霉素类 抗生素f f 毒性作用较小，主要对动物胚胎有毒性作用。 t a p 还具有血液系统毒性，主要表现为可逆性的红细胞生成抑制，但未见 再生障碍性贫血的报道。由于f f 结构中以c h 3 s 0 2 取代氯霉素上与抑制骨髓造 血功能有关的- n 0 2 ，无潜在致再生障碍性贫血危险。但是，随着临床应用范围 的扩大和用药时间的延长，可能会出现一些毒副作用。目前，许多国家都规定 了氯霉素类药物在食品性动物中的最高残留限量。日本规定鲈形目中甲砜霉素 残留限量为2 0 1 j g k g ，鳗鲡目中氟甲砜霉素残留限量为2 0 0 9 9 k g 。 为了确立产品的信誉，增强其竞争力，我们务必在源头把关，对动物源食 品兽药残留实施监控，尤其在扩大对外出口，保障消费者健康等方面有着十分 重要的意义，同时，建立起快速、灵敏的残留检测方法事在必行。 1 3 兽药残留分析方法 1 3 1 样品前处理方法 兽药残留分析通常包括生物组织的破碎、匀浆，用一合适的溶剂提取，然 后经过一步或多步净化，浓缩富集后，应用色谱系统或其它检测仪器分析测定。 样品前处理主要包括提取和净化，提取是将样品中的残留兽药溶解分离出 来的操作。而由于样品基质复杂，提取后往往还需经过净化步骤才能达到待测 物和干扰基质尽可能的分离，同时减少对色谱系统的污染。 在残留分析检测中，样品 ； 处理技术是耗时最长，最容易造成误差的步骤， 成熟可靠的样品前处理技术可以提高残留检测的效率和准确率，如何对提取溶 剂、提取方式、净化手段等因素进行选择优化直接影响到检测结果的准确性。 第一章引言 ( 1 ) 提取 提取方法有：组织捣碎法、振荡法、索氏提取法、超声波辅助提取、超i 临 界流体萃取、强溶剂萃取、微波辅助萃取等，其中组织捣碎法、振荡法、超声 波辅助提取是生物组织样品残留分析较常用的方法。 提取溶剂的选择应遵循“相似相溶”规则并满足下列要求： 对待测组分溶解度大； 对干扰杂质溶解度小： 与样本基质较好的相溶性； 能有效释放药物； 具有脱蛋白或脱脂能力； 其他，如沸点适中( 4 0 c 8 0 c ) 、黏度小、毒性低( 尽量少用卤代试 剂) 、易纯化、价格低廉和易于进一步净化“。 根据上述原则和大量的实践，残留分析中广泛采用乙腈即1 、甲醇“、丙酮 等水溶性溶剂作为提取剂作为提取剂。水溶性溶剂的提取效果好，适用范围广， 特别是多残留中效果更明显，但往往所提取出来的杂质较多，进一步萃取时乳 化较严重。 在一些脂溶性的残留物的分析中，常采用非水溶性的极性溶剂，如乙酸乙 酯”、二氯甲烷1 ”、氯仿、乙醚等进行提取。 ( 2 ) 净化 在样品前处理过程中，净化是最为关键的一步。样品净化方法有液一液分配 ( l l e ) 、固相萃取( s p e ) 、固相微量萃取( s p m e ) “、免疫亲和色谱( i c a ) 、凝胶 渗透色谱法( g p c ) 等等。 s p e 是一种由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来的试样处理技术，即 利用固定相将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离， 然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。与传统液一液萃取相 比，s p e 具有很多优点：速度较快，缩短了预处理时间；较高的精密度和准确度； 分析物的高回收：有机溶剂的低消耗，减少了对环境的污染；不出现乳化现象， 易获得较为纯净样品；操作简单，易于自动化等。 根据固相萃取柱中填料的不同，s p e 主要可分为以下几种类型： 4 第一章引言 ( 1 ) 正相固相萃取：柱中填料都是极性的，如硅胶、氧化铝、硅镁吸附剂等， 用来萃取( 保留) 极性物质。 ( 2 ) 反相固相萃取：柱中填料通常是非极性的或是弱极性的，如c 8 、c 1 8 、 苯基柱等，所萃取的目标化合物通常是中等极性到非极性的化合物。 ( 3 ) 离子交换型固相萃取：柱中填料是带电荷的离子交换树脂，如n h 2 ，所 萃取的目标化合物是带电荷的化合物。 根据相似相溶的原则，尽可能选择极性与待测组分相近的的固定相，使组分 得到最佳的保留。分析碳氢化合物( 非极性物质或低极性) 时选用反相固定相； 中等极性物质反相或正相均可应用；离子型、或较强的有机酸或有机碱化合物 可选择离子交换固定相。 s p e 操作步骤包括固定相活化、样品上柱、洗涤和洗脱四个部分。 活化的目的是为了创造一定的溶剂环境和除去柱内的杂质。一般首先使用 一种强洗脱能力的溶剂( 始溶剂) 润湿和净化s p e 柱，然后再用弱沈脱能力的 溶剂( 终溶剂) 平衡s p e 柱。终溶剂的强度应与样品溶剂接近或更低，以免样 品被带出造成回收率。 洗涤是除去不需要的组分或者杂质，所用溶剂一般略强于或等于样品溶剂。 洗脱溶剂选择时得避免溶剂太强沈出不必要的组分，使用混合溶剂是获得适宜 强度溶剂的有效方法。 林海丹“”等用w a t e r so a s i sm c xs p e 柱净化鳗鱼样品提取溶液，预先分别 用3 m l 甲醇和3 m l 5 ( v ，v ) 乙酸溶液处理s p e 柱，用2 m l 5 乙酸溶液甲醇 ( 5 0 + 5 0 ) 淋洗，最后用1 0 m l 5 氨甲醇溶液沈脱磺胺药物，吹干，定容，h p l c 分析。郭根和“”等用h l bs p e 柱净化了对虾样品，样品经二氯甲烷提取，提取 液用氮气吹干，残渣用3 m l 磷酸盐缓冲液一乙腈( 9 5 + 5 ) 溶解，过h l bs p e 柱 净化，用5 m l 甲醇洗脱五种磺胺类药物，吹干，定容后上机分析。 基质固相分散( m a t r i xs o l i d p h a s ed i s p e r s i o n ，m s p d ) 是将样品与吸附剂( 如 c 1 8 键合硅胶颗粒) 均匀混合后填柱，用不同溶剂对杂质和目标分析物进行洗脱。 由于其具有直接处理样品的能力，分离过程快速以及具有较高的分离效能，已 在许多兽药残留分析中得到应用，并特别适用于多组分兽药残留的分析测定。 但m s p d 处理样品量较小，要求检测仪器具有较高的灵敏度。 农业都于2 0 0 3 年1 月2 2 日发布2 3 6 号公告，公开了1 2 个动物性食品中兽 药残留检测方法，其中对磺胺二甲嘧啶残留提取净化于是应用基质固相分散萃 第一章引言 取技术，将样品与c 1 8 填料混合研磨，装柱，用正己烷洗涤，二氯甲烷洗脱“。 张宝“”等用类似的方法来提取净化鸡肉中磺胺喹嗯啉残留，首先将鸡肌肉组织 与c 1 8 填料研磨混合均匀，然后装柱，正己烷洗涤，二氯甲烷洗脱。张素霞“” 等研究了猪肌肉组织中磺胺类药物的m s p d 净化和h p l c 测定。 1 3 2 兽药残留检测方法 2 0 世纪5 0 年代，残留分析技术发展缓慢，仅限于化学分析法、比色法以及 生物测定法，这些方法灵敏度低、特异性差，很难满足分析要求。薄层色谱法 ( t l c ) 的出现使残留分析技术有所发展，但其检测灵敏度仍很低。2 0 世纪6 0 年代，g c 的飞速发展以及许多高灵敏度检测器的广泛应用，解决了许多兽药残 留分析中存在的问题。随后，h p l c 的快速发展大大拓宽了兽药残留分析的范围。 目前许多兽药残留的分析方法仍以高效液相色谱为主。免疫分析技术是近几十 年发展起来的新技术。 ( 1 ) 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀 薄层待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药 品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法经常作为样品的筛选方法， 具有速度快，处理时间短，适合生产现场进行等优点。在对饲料、组织、体液 等的分析中得到广泛应用。但由于该方法灵敏度低、特异性差，限制了它在痕 量残留分析中的应用。 ( 2 ) 气相色谱法( g c ) 气相色谱法是一种以气体为流动相的色谱法。气相色谱的检测器有许多种， 如火焰光度检测器( f p d ) 、电子俘获检测器( e c d ) 、氮磷检测器( n p d ) 、 热导池检测器( 1 d ) 等，应用气相色谱法测定兽药残留的关键是如何选择检测 器。 气相色谱法的特点是分离效能高和选择性好、灵敏度高、分析速度快以及 应用范围广。 分析磺胺药的气相色谱法主要是气相色谱一电子捕获检测器( g c e c d ) 法， 样品通过提取和净化后，需要进行重氮甲烷甲基化以增加挥发性，减少极性。 6 第一章引言 由于e c d 的灵敏度高，对许多杂质都有响应，色谱柱一般为毛细管柱或其他柱 效高的填充柱，检测器温度通常大于3 0 0 。 氯霉素类药物由于结构中含有吸电子的卤素，用g c e c d 法测定能得到很 高的灵敏度，检测限可达0 1 5 n g g ，但氯霉素和甲砜霉素不易挥发，用g c 或 g c m s 分析时需要经过衍生化过程，较费时。孙丰云“”等应用气相色谱一微电子 捕获检测法测定了虾肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺残留，样 品经乙酸乙酯一氨水( 9 8 ：2 ) 提取后，过m c x 固相萃取小柱净化，再经硅烷化后 用g c e c d 分析，方法检测限为0 0 8 o 4 p g k g 。刘永涛“”等建立了水产品中氯 霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量的毛细管电子捕获气相色谱法，用乙酸乙 酯同时提取水产品中待测物，提取液浓缩至干后溶于甲醇氯化钠溶液，正己烷 脱脂，过c 1 8 柱净化，衍生化后，c r c e c d 分析，方法对氯霉素、氟甲砜霉素 和甲砜霉素的检测限分别为0 1 、0 2 、o 2 1 t g k g 。 ( 3 ) 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱法是一种以液体为流动相的色谱法。该方法创立于2 0 世纪6 0 年代初期，具有分离效能高、选择性好、检测灵敏度高、分析速度快等特点。 高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量 大、不同极性的有机化合物等等。与气相色谱相比，高效液相色谱使用多种溶 剂作为流动相，当进行分析时所需成本高，且易引起环境污染。 液相色谱常用的色谱柱有c 8 柱、c 1 8 柱、氨基柱、硅胶柱等，常用的检测器 有紫外检测器( u v d ) 【2 0 1 、二极管阵列检测器( p d a ) 。“、荧光检测器( f d ) “，选择 合适的色谱柱、检测器、流动相及其流速等条件对实验结果的分离效果、灵敏 度非常重要。杨方。3 等利用二级管阵列检测器切换波长同时检测样品中氯霉素、 甲砜霉素和氟甲砜霉素残留，解决了氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素由于最大 吸收波长不同所产生的响应值差异问题。荧光检测器属专属性检测器，检测限 一般在n g g 水平，比紫外检测器灵敏度高1 0 2 0 倍，色谱图基线稳定，干扰峰较 少，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质且价格较高。 磺胺类结构中带氨基，有弱碱性，其中性分子和离子形式在有机相与水相中 的分配性质不同，有机溶剂和p h 对磺胺的保留有着重要影响，因此在键合相反 相液相色谱的情况下，以含水相为流动相时，调节含水相的p h 值，即用酸性流 动相来抑制弱碱的离解将导致保留行为的改变，达到组分分离的目的。应h p l c 第一章引言 测定磺胺类药物残留中常用的流动相为甲醇、乙腈、水、磷酸盐缓冲溶液的多 溶剂体系，对于多组分残留分析大都采用流动相梯度洗脱，常用的检测器为紫 外检测器( u v ) 。曹芳。”等采用高效液相色谱法分离鸡肉中七种磺胺类药物残 留，鸡肉样经乙腈提取，正己烷除脂，碱性氧化铝s p e 柱净化后用h p l c 测定， 流动相为0 0 1 7 m o i lh 3 p 0 4 + 乙腈( 8 0 + 2 0 ) ，紫外检测。李俊锁。4 1 用同样方法测定 了鸡肝中七种磺胺类药物残留。吴银良。”等建立了一种鸡肝中7 种磺胺类药物残 留量固相萃取一反相高效液相色谱分析方法，样品经乙酸乙酯提取后，氨基固相 萃取小柱净化，采用i n t e r s i lo d s 3c 1 8 柱，以甲醇一乙腈一水一乙酸为流动相梯度 洗脱，高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测。 ( 4 ) 色谱一质谱联用技术 质谱( m s ) 法的发展大大推动了兽药残留分析向痕量、超痕量分析发展的速 度。色谱与质谱的联用技术不但灵敏度高而且能提供详细的结构信息，是目前应 用最广泛的确证方法。 m t c o m b s “3 等采用高效液相色谱大气压化学电离质谱( h p l c a p c i m s ) 分析了鸡肝组织中八种磺胺类药物，在完整的扫描模式下，离子色谱图显示八 种磺胺药物中有六种的检测低限为0 8 r i g 。在选择离子监控模式下，磺胺二甲基 嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶的检测低限为5 0 p g ，而其它几种磺胺药物的检测 限稍高。t i t u s a m m s a g a t i 牌3 等研究了多种生物样品中1 6 种磺胺类药物的支撑液 膜提取浓缩，高效液相色谱一质谱分离测定方法，研究发现该方法检测限低，其 中牛肝脏以及肾脏组织中磺胺胍和磺胺二甲基嘧啶的检测限可达1 8 p p b ，其它 1 4 种磺胺残留物的检测限在3 3 1 0 p p b 之间。d a l h ok i m 1 等将液相色谱一大气压 化学电离质谱应用于牛肉中五种常用磺胺药物的测定，以磺胺嘧啶、同位数标 记的磺胺甲嘧啶( 1 3 c 6 s m z ) i 乍为内标物，内标法定量，该方法相对标准偏差为 1 8 ，磺胺甲嘧啶的检测低限为7 5 n g g 。李鹏1 等采用气相色谱一负离子化学电 离源质谱同时测定了动物组织中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量，样品 用乙酸乙酯提取，正己烷去脂，再用f l o r i s i l 柱进一步净化，衍生化，内标法测定。 随着科技的进步，串联质谱方法在l c m s 、g c m s 的基础上发展起来，并 逐步应用到实际检测中。此类技术选择药物的分子离子作为母离子，进行二次 碰撞解离后，待测组分的二级质谱图和杂质的二级质谱图有了本质的区别，有 利于提高灵敏度和选择性，避免样品中共存杂质的干扰。 8 第一章引言 秦燕1 等建立了动物饲料中1 0 种常用磺胺的高效液相色谱一串联质谱检测 方法，样品经甲醇0 i m o l l 盐酸( 体积比2 0 ：8 0 ) 提取，s p e 柱净化，稀释， h p l c 分离后进行质谱分析，在多反应监测模式( m r m ) 下进行特征母一子