（发育生物学专业论文）盐芥和拟南芥硫氧还蛋白在氧化胁迫中的功能研究.pdf

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态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。但是，盐芥对多种胁迫的耐受 能力远远高于拟南芥，它在短时间内能耐受高达5 0 0 妇m 烈a c l 的冲击，在盐适应前后既不产 生盐腺也没有复杂的形态上的变化。因此，对盐芥硫氧还蛋白的功能研究对于研究植物氧化 性伤害的产生和应答机制，对了解植物胁迫状态下的代谢变化和代谢调节，揭示植物的耐逆 机理都具有重要意义。 蚴基因家族蛋白成员主要存在于植物细胞质中，但也存在于内质网、线粒体中，不 同的定位与其相应的功能相关。为了解n t 砌匝的生物学功能，我们首先构建了t h 蚴g s t 融合基因表达载体，转化至d e 3 大肠杆菌，完成t h l r ) ( 1 1 g s t 融合蛋白的表达，为下一步 研究盐芥硫氧还蛋白同靶蛋白的互作提供了条件。然后构建了t h t 嬲1 e g f p 融合基因植物 表达载体，并用花侵染法转化拟南芥，不同的盐、氧化胁迫对转基因株系处理一段时间后， 通过激光共聚焦显微镜检测不同胁迫对t h t 购l 亚细胞定位的影响。结果表明无论在胁迫条 件下还是对照实验中，t l 】t r 1 都定位于细胞质中，定位并未发生改变。然后我们订购了 t h t r 1 同源基因的拟南芥突变体，对拟南芥硫氧还蛋白突变体和转t l l t 脚l 基因株系进行 胁迫耐受性分析，为下一步做t h t 脚l 的表型互补实验奠定一定的基础。我们的结果显示拟 南芥硫氧还蛋白突变体萌发率明显低于野生型，转t h t r x h 基因株系萌发率高于野生型，这 l 山东师琴盔毫竺旁靛拳争叁 嚣冀耋冀薹萋薹薹| 耋茎囊i 爹耋f 薹翼耄鑫蓑蒌辇冀薹萎蠢耋芷袋萋主l i 蓁辇f 薹淫囊蕈萋霪雾囊霎隧蓁囊羹囊薹砸 ：鬃主萋毒垂囊孽萎筐 蓁薹霪连妻霜季雾 羹薹爹藿； i 萋荔孳謇墓；妻；章羹? 羹雯耋耋i 鋈：；妻； 彗譬妻雾雾i i | 摹鬈；! 蓁蚤! 耋l 妻；争! ；囊雩季萋! 茎! 童蓄妻姜重三蚕矿! | ；噬 山东师范大学硕士学位论文 t h ef u n c t i o n a ir e s e a r c ho f 劢扰口愕z 以趾 口j 印五觑zz 再矗a n d 彳r 口6 咖s 豇 砌口以矗以口z y 嘞 a b s t r a c t t h e p l a i l tw 鸽s u b j e c t e dt 0v a r i o l l ss t i e s s e si 1 1 e v i t a b l yi ni t sl i 托c y c l e ，s u c h 笛m es a l t ，d r o u g h t ， 1 0 wt e m p e r a _ c u r e e t c i nt l l ee 砌ys t a g e ，也ei o nb e c 姗ei i i l b a l 锄t t h ea g 笋a v a t i o no ft l l e s es n e s s e s w e r eo f t e na c c o m p a n i e dw i mr o sa 1 1 d 也es e c o n d a r ) ro x i d i z es 仃e s s t h el i 咖gc r e a t i 鹏 x 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 1 、细胞的胁迫应答 植物在其生活史中不可避免地要受到干旱【1 1 、低温或高温【2 ，3 1 、臭氧【4 】和紫外照射【5 1 、离 子辐射、重金属胁迫、病毒侵染等各种环境胁迫因子的影响，这些胁迫因子可以通过多种方 式影响植物的生长、发育和胁迫的延续或加重还常常会伴随活性氧( r e a c t i v e0 x y g e n s p e c i e s ，r o s ) 的产生加剧【h ，6 】和次生性氧化胁迫的发生，使细胞的氧化还原内环境发生改变， 并且会诱发包括硫氧还蛋白的表达增加在内的一系列应答氧化胁迫的应急反应，当细胞内产 生过量的r o s 超过还原缓冲体系的缓冲能力时则产生氧化胁迫，氧化胁迫是普遍发生在植物 对各种生物和非生物胁迫因子进行胁迫应答过程中的生理现象【7 一】，它会影响细胞的结构( 包 括膜脂、膜蛋白结构，细胞器结构，蛋白质分子、酶分子和脂分子等) 和功能( 包括代谢反应， 生长、繁殖等) ，使细胞稳定的氧化还原内环境受到破坏并产生氧化性伤害，从而影响细胞的 代谢、生存和繁衍。 当多种胁迫因子引起氧化胁迫时，生物体可通过多种调节途径和调节方式对生物体( 细胞) 的氧化还原状态进行调节，以避免氧化性伤害的产生，其中主要的调节方式包括：活性氧的 酶促和非酶促清除；与谷胱甘肽相关的氧化还原调节；以及与硫氧还蛋白相关的氧化还原调 节。在众多的氧化还原调节途径及氧化还原调节方式中嘌呤核苷酸( n a d ( p ) h n a d ( p ) + ) 和含 巯基二硫键的化合物特别引人关注，因为它们与多条代谢网络、信号传导网络中的许多功能 性蛋白包括众多酶类、膜转运蛋白、转录因子等相连接并对其结构和功能具有氧化还原调节 作用；硫氧还蛋白是一种含有巯基二硫键的小分子蛋白，它广泛参与上述的诸多调节过程。 2 、硫氧还蛋白及硫氧还蛋白系统的结构与功能 2 1 硫氧还蛋白的结构构象 硫氧还蛋白( t h i o r e d o x i i l ，t 融( ) 是广泛存于原核生物和真核生物( 包括动物、植物、细菌和 古细菌等) 并参与生物体氧化还原调节的小分子蛋白质。最初由l a i l r e me ta 1 ( 1 9 6 4 ) p 】从细菌中 发现并描述为小的氧还蛋白，它作为核糖核苷还原酶有效的供氢体。t r x 的三维结构是一个紧 密的球状蛋白，都具有一个连续的共同二级结构：b 1 ，al ，b 2 ，q2 ，b 3 ，a3 ，b 4 ，b 5 ，a4 ，其 中4 个b 折叠形成一个疏水核心，3 个q 螺旋就位于该核心的终末端。它由1 0 4 个氨基酸组 成，分子量约1 2 妨a ，具有一个外露且高度保守的w c p c 活性中心，其中含有两个相互 邻近的活性半胱氨酸残基，可通过硫醇一二硫化物的相互转变参与生物体的氧化还原调节。 山东师范大学硕士学位论文 各种硫氧还蛋白都有类似的活性中心和立体三维结构。硫氧还蛋白的硫醇形式( 还原态) 是 非常有效的二硫化物还原酶，通过对靶蛋白进行翻译后调节实现对蛋白质的功能和信号传 导的氧化还原调节【1 1 ，1 2 1 ，从而参与多种细胞过程【1 3 】。 2 2 硫氧还蛋白的定位分类 硫氧还蛋白在生物体中广泛分布，为参与多种生命活动提供重要的调节作用。目前认为， 主要存在着三种类型的t r x ：这包括存在于叶绿体中的f 一型t r x ( t r x ，是植物中特有的) 和 m - 型t r x ( t r x ) 以及广泛存在于细胞质、内质网、线粒体中的h 一型t r x ( t r x 。) 。细菌和动 物中各存在一种类型的t r x ：细菌中的t r x 同植物中的m _ 型的t r x ( t r x j 类似，动物中的t r x 同植物中的h 一型t r x ( t r x 。) 类似【1 4 5 1 。 植物拥有复杂的硫氧还蛋白系统而不同于其它生物体【l6 1 。拟南芥基因组有8 个h 型、4 个m 型、两个型、一个x 一型硫氧还蛋白，分别定位在细胞质、叶绿体或线粒体中。还有一 些与硫氧还蛋白紧密相关的蛋白质【1 7 1 。 2 2 1 硫氧还蛋白h ( t r x ) 硫氧还蛋白h 主要存在于植物细胞质中，也存在于内质网、线粒体中，t r l 可能与细胞 膜结合，韧皮部汁液中也发现它的存在1 8 】。硫氧还蛋白h 在谷类作物种子中含量丰富。在种子 萌发早期阶段它能使水解酶抑制剂失活，激活q 淀粉酶、支链淀粉酶、丝氨酸蛋白酶，说明 硫氧还蛋白h 可作为种子萌发的信号而起作用，引起贮存的碳水化合物、蛋白质降解【1 9 ，2 0 ，2 1 ，2 2 ， 2 3 ，2 4 ，2 5 ，2 6 1 。对处于萌发和发育中的小麦进行进一步分析发现硫氧还蛋白h 在糊粉层和盾片细胞 中积累，这也与其使贮存物动员的作用一致，表明硫氧还蛋白h 可能与细胞核因子相互作用， 就象哺乳动物、酵母细胞中的情况一样。现有的证据说明硫氧还蛋白h 是单子叶植物种子生物 学的重要组分。t r l 可参与细胞通讯、种子萌发、繁殖等过程【2 7 】。 硫氧还蛋白h 的还原依赖于n a d p h ，由n a d p h 硫氧还蛋白还原酶q 汀r ) 催化，三者组成 n 俐t r x 氧化还原系统删t s ) 。硫氧还蛋白h 由多基因家族编码，目前发现拟南芥基因组中有8 个成员【2 8 2 9 1 一级结构序列分析表明它们的进化起源非常接近。它们在特异细胞中表达且表达 水平不同，表明它们有特异的功能3 0 1 。 2 2 2 叶绿体硫氧还蛋白( c p t r x ) 植物硫氧还蛋白最初是在叶绿体中发现的，它参与光合作用中一些关键酶的活性调节。 比起t r x 细胞质系统，硫氧还蛋白叶绿体系统要复杂得多，它包括两种主要类型的叶绿体硫氧 还蛋白：f 型硫氧还蛋白( t r x f ) 和m 型硫氧还蛋白( t r x m ) ，还有新近鉴定的x 型硫氧还 6 山东师范大学硕士学位论文 蛋白和y - 型硫氧还蛋白【3 1 ，3 2 ，3 3 1 ，以及依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白还原酶异源二聚体。 矸f 和m 调节光合作用碳代谢中的特定酶的活性，比如对果糖1 ，6 二磷酸酶( f b p 嬲e ) 和n a d p 苹果酸脱氢酶的调节【3 4 1 。f - 型和旷型t r x ：最初被鉴定为光依赖的光合作用关键酶 的调节蛋白，两者系统起源、一级结构、专性作用的蛋白各不相同。除了红藻m - 型硫氧还 蛋白是叶绿体基因组编码的，这两类蛋白都由核基因组编码。所有光合真核生物都有这两类 硫氧还蛋白；但是光合原核生物缺乏f 一型硫氧还蛋白【3 5 1 。x 一型硫氧还蛋白可能是原核起源， 蓝细菌有其同源基因。拟南芥有四个m _ 型、两个f 一型，而x 一型硫氧还蛋白只有一个。 t r xf 具有真核起源f 蚓，是果糖一l ，6 一二磷酸酶( f b p a s e ) 特异的激活蛋白，主要参与光 合作用的电子传递【3 7 】。t r x ，一级结构表现出广泛的序列同源性，双子叶植物中其氨基酸具有 7 5 _ _ 9 0 的同源性，而单子叶植物和双子叶植物间同源性为6 0 9 6 - - 6 7 。由于它具有一段附加 的n 一端肽链序列使它的长度比其它类型的t r x 要长，但c 一端序列部分同典型的动物硫氧还蛋 白有高度的相似性，这表现在它们都含有严格保守的第三位的半胱氨酸( c y s ) 残基( 在菠菜中 是c y s 7 3 ) 。尽管t r x ，的整体结构同别的类型的t r x 无明显区别，但其拓扑构象同其它的t r x 却存在明显区别 3 8 】。 t r xm 是c 4 和c 3 植物叶绿体中n a d p - 苹果酸脱氢酶的激活蛋白f 3 9 1 。t r _ ) c 广泛存在于进 行产氧光合作用的原核生物、藻类、单子叶植物、双子叶植物的叶绿体中，它同异养原核生 物和不产氧原核生物中的硫氧还蛋白类似，因此这种m _ 型t r x 被认为是细菌型。由于它们结 构相关、功能相似，细菌硫氧还蛋白和m 型t r x 可以互换使用。但是各种旷型t r x 其一级结 构序列相似性要比f _ 型t r x 低得多。植物和绿藻中t r ) ( - 是核基因编码的，而红藻叶绿体基因 组中有编码t r ) ( - 的基因【加】。t r ) ( - 同t r x ，的序列的相似性较低。菠菜中的t r ) ( - 衣藻 翻- a 田y 如册门a s 抬砌施耐芒f j 中获得的t r k 一样，都具有与ec d - j 中的t r x 类似的结构，并 且其二级结构极其相似【4 ，正是由于结构上的相似，因此它们的硫氧还蛋白能互相替换完成 相同的功能。m 一型硫氧还蛋白氧化态和还原态的活性位点的构型区别也很小，但在其活性位 点主链构型上的一些细小的变化使得还原态的t r ) ( 分子中的半胱氨酸残基( c y s 3 7 ) 同溶剂接 触的更容易。 t r xx 只在拟南芥中出现，且仅有一个。这种新的x 一型t r x 是叶绿体过氧还蛋白 ( p e r o x i r e d o x i n ，p r x q ) 有效的底物，它并不作用于其它两个目标蛋白：果糖一1 ，6 一二磷酸酶 和n a d p 一苹果酸脱氢酶。这表明x 一型t r x 与氧化胁迫抗性有关。 2 2 3 线粒体硫氧还蛋白 7 山东师范大学硕士学位论文 近来，植物线粒体硫氧还蛋白系统也由l a l o ie ta 1 ( 2 0 0 1 ) 【2 8 】鉴定出来，该系统包括旷 型硫氧还蛋白和n a d p h 一硫氧还蛋白还原酶。植物线粒体中的t r x 的作用可能是激活或稳定在这 些细胞器中2 一氧代酸脱氢酶复合体f 4 2 】或者是对植物电子传递链中抗氰化物交替氧化酶 ( a l t e r n a t i v eo x i d a s e ) 进行氧化还原调节【4 3 ，4 4 1 。 2 3 硫氧还蛋白系统的结构及组成 植物体内存在两类硫氧还蛋白系统，一类是依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白系统，另一类是 依赖于铁氧还蛋白的铁氧还蛋白硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白系统可催化还原氢过氧化物、 有机过氧化物以及一些被氧化的蛋白，是一个在自然界中普遍存在的系统h 射。 2 3 1 依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白系统 这类系统主要分布在细胞质、线粒体【4 6 1 ，与非光合细菌、动物中的类似。由硫氧还蛋白 ( t r x ) 、蛐p h 硫氧还蛋白还原酶( n t r 一种黄素蛋白) 和电子供体n a d p h 组成。 依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白还原酶( n t r ) ，是一种黄素蛋白，它的基本结构同五中 的n t r 具有高度的同源性，该酶是由3 5 k d a 亚基构成的二聚体。拟南芥细胞质n t r 晶体结构 已经测定，每个亚基有两个结构域：一个结合n a d p h ；另一个结合f a d 。n a d p h 结合结构域由 中央部分序列组成，f a d 结合结构域由n 端和c 一端组成。在两个b 链组成的铰链处这种蛋白 活动灵活，随着旋转，n a d p h 结合结构域接近f a d 中的异咯嗪环。n t r 有保守序列c a v c ，其 二硫键就位于异咯嗪环前面，并且两个半胱氨酸残基间的空间距离与c a v c 到t r x 的距离相同。 二硫键中的一个硫非常靠近f a d 活性中心，这就是m r 中起催化作用的半胱氨酸。f a d 一次 能转移两个电子，使得n t r 二硫键的还原机制简单得多。植物的n t r 同原核类型的n t r 的关 系要近于同哺乳动物的n t r ，哺乳动物的n t r 具有一段n 一端延伸序列和硒半胱胺酸。象许多 别的黄素蛋白一样，拟南芥中的n t r 也具有硫辛酸脱氢酶活性并能还原醌和硝基化合物。 2 3 2 依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白系统 在植物的叶绿体、真核藻类以及进行产氧光合作用的原核生物中，的电子供体是还 原型铁氧还蛋白( 还原型f d ) 。依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白系统只存在于叶绿体、蓝藻 中，由t r x 、依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白还原酶( f t r ) 和电子供体还原态的铁氧还蛋 白组成。在依赖于铁氧还蛋的硫氧还蛋白系统中，硫氧还蛋白的还原是间接通过光途径还原： 由光驱动的光合电子传递中产生还原态的铁氧还蛋白为f t r 提供电子，再由f t r 还原t r x 。 依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白还原酶( f t r ) ，是铁氧还蛋白硫氧还蛋白系统的核心酶， 它能将还原态的铁氧还蛋白接受的光合成电子信号转换成巯基信号并传给硫氧还蛋白，该酶 山东师范大学硕士学位论文 同细胞质中的n t r 不同，它是由两个不同的亚单位组成，两个亚单位分别起催化和变构作用， 催化亚单位在不同的光合生物中大小恒定为1 3k d a ；可变亚单位的分子量可在8 1 3k d a 之 间变化【4 7 】。在植物中两个f t r 亚单位都是核编码的，在紫菜( 助印厅舻r a p 泖“r 8 a ，一种红藻) 【加】 和一种隐藻钇j 黜h 拍p 招中发现，催化亚单位由叶绿体基因组编码。通过微孢藻 ( 5 肋p 拍d 哪芒j s 印) 的重组f ，i r 已得到了f t r 的结晶和晶体结构【4 8 1 ，晶体结构表明f t r 的 铁氧还蛋白附着位点含有4 个带正电荷的残基可同带负电荷的铁氧还蛋白特异性互作，而硫 氧还蛋白附着位点含有主要的亲水性残基，使得该位点能与不同的硫氧还蛋白相兼容。 铁氧还蛋白( f d ) 是基质可溶性的电子载体，从光系统i 获得电子。植物型的铁氧还蛋白 是可溶性的酸性蛋白，分子量1 2k d ，其2 f e 一2 s 铁硫中心氧化还原电位大约为一4 0o l i l v ，能携 带一个电子。其三维结构信息已从几种铁氧还蛋白中得到，表现出很大的相似性，它们有相同 的折叠方式在菠菜中，f d 和f t r 构成l ：l 的高度亲和体【4 9 1 ，在菠菜和绿藻的f d 中已确定 了参与复合体形成的负电荷残基的位点，铁硫中心的任何一面都暴露出两片负的表面电荷，这 是与其它蛋白相互作用所必需的，铁氧还蛋白与来自不同有机体的f t r 亲和力明显不同使得 这种负的表面电荷赋予与电子受体蛋白相互作用的专一性。 t i 的三维结构是一个紧密的球状蛋白，都具有一个连续的共同二级结构：b 1 ，q1 ，b 2 ， q2 ，b 3 ，a3 ，b 4 ，8 5 ，q4 。菠菜叶绿体t r xf 和t r xm 以及国_ ? 黝阳切蚴st r xm 的三维结构已 经测定，它们具有与原核生物、动物相同的典型空间结构，即中间有5 个b 一折叠片，四周环 绕着4 个q 一螺旋。m _ 型t r x 结构上与大肠杆菌硫氧还蛋白相似，并且围绕活性部位半胱氨酸的 表面也很相似，这些生化证据表明硫氧还蛋白功能上是可以互换的。t r xf 的整体结构与典型 的t r x 没有显著的差别，但其表面拓扑结构跟其它硫氧还蛋白明显不同。t r xf 带更多的正电 荷，一些正电荷处于活性部位周围或许保证t r xf 与目标蛋白的正确定向，而疏水残基也明显 分布在接触面上，这可能对与f ，i r ( 铁氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶) 的低特异性相互作用更为 重要，以保证f t r 对t r xf 和t r xm 两种硫氧还蛋白都能高效还原。一个显著的差异就是暴露在 表面靠近活性中心的第三位保守的半胱氨酸( 菠菜是c y s 7 3 ) 。结构分析表明低序号的半胱氨酸 残基( 菠菜是c y s 4 6 ) 处于水可及的表面，而与其形成二硫键的另一个半胱氨酸残基c y s 4 9 埋藏 在内部，这些生化证据证实c y s 4 6 与目标蛋白形成异源二硫键。同原核生物e 仍j j 中的原始型 t r x 相比较，植物中的t r x 。因为具有一段n 一或和c 一端扩展序列而长于原核生物的t r x h 。植物中 的t r x h 同哺乳动物中的硫氧还蛋白的亲缘关系要近于同仍7 j 中的t r x 的亲缘关系，这一结果 与一级结构分析相一致。 2 。4 硫氧还蛋白的亚细胞定位和组织特异性表达 9 山东师范大学硕士学位论文 硫氧还蛋白是广泛存在于动物、植物、细菌中的小分子蛋白质。植物组织含有多种形式 的硫氧还蛋白，它们的亚细胞定位、表达方式各不相同。植物细胞至少有四种类型的硫氧还 蛋白：硫氧还蛋白m 型和f 型在叶绿体中【5 0 】；d 型在线粒体【4 6 】；h 型位于细胞质中，可能与 细胞膜结合【5 1 ，5 2 1 ，h 型在内质网、线粒体中也有。每一类型硫氧还蛋白由多基因家族编码，拟 南芥基因组有8 个h 型、4 个m 型、两个f 型、一个x 型硫氧还蛋白。t m 1 、m 2 1 4 转录 本在绿色组织积累，而t r xm 3 转录本在花芽中最为丰富，它优先在非绿色质体表达【5 3 】。 p a g a n o 等( 2 0 0 0 ) 【5 4 】发现生长在正常光照下5 0 天的豌豆植株，其叶绿体矸m 和t r xf 在 光合组织和非光合组织中都表达，但是n m 在豌豆粒中表达多根中却很少，而t r xf 在非 光合组织( 豌豆粒、根) 高丰度表达。t r xh 基因家族成员的表达水平及表达模式各不相同， 表明各自具有特异的功能【5 5 】。拟南芥t i h 1 h 5 瑚r n a 在地上器官，如：幼叶、成熟叶、长 角果、花芽、花中丰度高，而茎中丰度低些。t r xh 2 、t r 】4 和t r x h 5 在根中表达量很低， h l 和t r 3m r n a 在根中根本检测不到。m o m r i c h a r de ta 1 【5 6 】研究h 各成员在豌 豆种子萌发时的表达情况，发现t i h 1 和t r xh 2 的转录本在萌发的种子中检测不到，在幼 苗生长的早期t r xh 1 和t l h 2 只在绿叶中发现，但是量很少。相反，在干燥和吸胀的种子 以及其它被检测的器官中，明显检测到t r xh 3 和t r x1 1 4 的表达。干燥种子中，t i h 3 和 1 i 1 1 4 的转录本在胚轴和子叶中都存在，n h 3 的转录水平要高于t r xh 4 。种子萌发阶段， t r xh 3 和n 1 1 4 表现出差异性表达，t r xh 3 的在胚轴和子叶中保持不变，而t r xh 4 只在胚 轴中检测到。 2 5 硫氧还蛋白的功能 硫氧还蛋白是普遍存在的小分子蛋白，含有具氧化还原活性的二硫键，是植物代谢中重 要的调节元件，t r x 中s h s s 的氧化还原变换可通过对蛋白质酶的影响进而对多种受氧化 还原影响的细胞功能进行调节：包括对转录因子的活性调节、对各种胁迫( 如病毒与细菌或真 菌侵染、u v 、离子辐射、渗透、低温干旱等) 的应答、对细胞内氧化物的清除、对细胞信号传 导的调节等，最终会影响细胞的氧化还原内环境、影响细胞的生存、生长、信号传导等多种 生理机能。 在不同类型的生物中，t r x 的生理功能涉及：细胞内和细胞间信号传导、转录因子活性、 叶绿体光合酶类和许多其它酶类活性【5 7 ，5 8 1 、多种生物和非生物胁迫应答和调控、细胞凋亡【5 9 1 和细胞生长、t 7 噬菌体d n a 复制、丝状噬菌体e c 0 1 i 噬菌体的组装【6 0 6 l 】等多个方面， 其功能涉及从一般基础反应到一些高度特化的功能。 2 5 1 硫氧还蛋白在植物细胞抗氧化防御中的功能 硫氧还蛋白对细胞的氧化还原调节是通过硫醇一二硫键的转换对细胞进行氧化还原调节， 它通过其分子结构中活性半胱氨酸残基的一s h 与细胞中活性因子( 包括n a d ( p ) h n a d ( p ) 十和一 1 0 山东师范大学硕士学位论文 凋亡是一系列由蛋白酶引起的受基因调控的级联反应。s a i t o h 等人证明n 能与细胞凋 亡信号调控激酶a s k l 的n 段直接作用，抑制a s k l 的活性，并且这种相互作用依赖于t r x 的氧化还原活性【铷。 2 5 3 硫氧还蛋白对细胞信号的传导作用 t r x 对转录因子活性的调节、蛋白质或酶的氧化还原调控是信号传递的过程，是将细胞 内外的各种胁迫信号、通过与氧化压力相关的信号传导通路转换成与酶的活性相关的细胞代 谢信号或与胁迫应答相关的基因转录信号的过程；对细胞凋亡和细胞生长的控制则是在细胞 或生物体这一更高层次上的信号传导所产生的调节结果的反映。t r x 通过与转录因子之间的 氧化还原转换使转录因子活化【9 8 ，9 9 1 ，调节转录因子同d n a 的结合活力。这使得t r x 在调节 细胞特异性靶基因的转录和细胞功能的作用中发挥着核心作用。迄今为止。已经报告过的受 t r x 调控的转录因子有a p 1 ( 激活剂蛋白1 转录因子由c f o s 和c j 吼亚基组成) 【1 0 0 1 ， n f - l 【b 瓜e b l 【1 0 1 1 ，c m y b 【1 0 2 1 ，b p v l 【1 0 3 1 ，u s f 【1 似】和n f y 【1 0 5 】等，它们的d n a 结合活力均 受氧化还原调节。 n 能参与多个信号传导途径实现氧化还原的调节，包括m a p k 信号传导通路、a s k l 通路、r o s 信号传导通路、r e 0 1 到转录因子的信号传导等。m p a k 系统参与生长、发育、 分裂、分化、死亡等多种细胞过程，n 旺q 、i l - 1 、等致炎因子经m a p k 系统的信号传导 也可被t i 调节。研究表明胞内t r x 的表达与细胞周期密切相关，这说明t r x 极有可能参 与细胞周期的氧化还原调控【1 响。适量的r o s 在生物体内参与胞内信号传导或从细胞表面受 体开始的信号传导途径的调控，活性氧基团在从细胞因子与受体间的相互作用，到转录因子 的活化这样一个信号传导途径中起信号信使的作用。对r o s 的清除和调节作用毫无异 议的会影响r o s 的信号传导。t r x 还能调节蛋白质酪氨酸激酶( p k t s ) 信号传导途径：蛋白 酪氨酸磷酸化酶( p t p ) 很可能是一个在外界氧化压力作用下负责完成酪氨酸磷酸化和激酶活 化的蛋白，因为它的催化位点有一个半胱氨酸，而且它的磷酸酶活性依赖于巯基还原剂【1 0 7 1 。 许多实验表明n h 是在水稻的韧皮部汁液中主要蛋白质成分之一【1 0 8 1 ，并且在单子叶植 物小麦和双子叶植物蓖麻俾f c 办伽淞幽加绷s 括，j 和南瓜( c k c “而f 纪) 的韧皮部汁液中也有砸存 在【1 0 9 】。由于成熟的筛管细胞是无核的，其i i 心a 的合成被定位于伴胞，经翻译后转运到筛 管分子【1 10 1 。此外，经过显微注射重组的t r x h 表明该蛋白质能经自我调节经过胞间连丝在细 胞之间转运【u ，这表明n h 是植物中的可转运成分，可能充当信使载体。白菜f c a 如拥p s 毋) 中描述过t r x 可对膜连受体样激酶进行调节【2 1 。人的t r x 可由淋巴细胞及其它细 山东师范大学硕士学位论文 盐芥和拟南芥的不同的盐耐受能力是由不同的离子内稳态决定的【1 3 4 1 。植物对离子的选择 性吸收能力是耐盐的关键因素，把某些毒性离子( 如n 矿) 排除在外，吸收或者保持其它离 子( 如k + ) f 1 3 5 1 。在离子转运方面，电生理技术、x 射线微区分析( a d ea l n i l a n ) 以及单细胞取 样技术( 、矾e l a n df r i c k e ) 的研究分别表明高盐下盐芥根和叶细胞有较高的王0 ，n a + 选择性。与会 者认为，盐芥与拟南芥相比之所以有较高的耐盐性，组织特异的k + 、n a + 转运蛋白可能起到重 要作用，特定的转运蛋白基因的组织定位及膜定位应当提上日程，而且，转运蛋白本身及调 控组分上可能存在与抗性相关的重要区别。 高度的d n a 序列同源性【1 2 6 1 3 6 】使得可以使用拟南芥微阵列平台来研究盐芥的表达谱。全 长c d n a 阵列【1 2 6 1 和以寡聚核苷酸为基础的阵列【1 3 7 1 来研究表达谱都得到了很好的结果：7 0 到 9 0 的探针产生了很好的信号强度( 1 3 4 1 。与之相比，用短的寡聚核苷酸效果不好【1 3 8 1 。最初的 转录谱表明盐芥与拟南芥相e 匕只有极少数盐诱导基因是处于同一水平的，然而在非盐处理条 件下盐芥基础水平高表达许多拟南芥中盐诱导表达的基因【坦7 ，1 2 8 1 。拟南芥中盐诱导表达的这些 基因是胁迫恐慌的一种反映而不是特殊的胁迫适应，胁迫敏感和耐胁迫品种的基因表达比较 可以鉴定出哪些基因是耐受胁迫的基础：这两点都强调了研究e x t r c i m o p l l i l e 删s 对于理解植 物耐盐的机制的重要性【”4 1 。用拟南芥序列作的微阵列只鉴定少量的同源序列和少数的新的胁 迫相关基因，c “e w o n g 等用盐芥( 【o n ) 的序列做探针，分析了盐芥对冷、高盐、干旱 及干旱后复水等条件的转录谱，在这些研究条件下有1 5 4 个转录本发生变化，并且发现冷反应 中涉及到了茉莉酸【1 3 9 1 。 ， 4 蛋白的原核表达及转化 原核表达是一种将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，达到表达大量蛋白质目的的 方法。这种方法大都应用在蛋白纯化、定位及功能分析等方面。大肠杆菌具有培养材料廉价、 生长易于控制、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择等优点， 适于做原核表达。但是在表达过程中容易形成包涵体，影响蛋白质的生物学活性及构象。 原核表达一般程序如下：获得目的基因 l 准备表达载体 l 将目的基因插入表达载体中( 测序验证) l 转化表达宿主菌( 如大肠杆菌d e 3 ) l 诱导靶蛋白的表达 i 1 6 山东师范大学硕士学位论文 表达蛋白的分析 l 扩增、纯化、进一步检测 5 定点突变技术 点突变是突变的一种类型，会使一个核苷酸替换成另一种核苷酸，一般也包括只有作用 于单一碱基对的插入或删除。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有 力工具，也是实验室中改造和优化基因常用的手段，对某个已知基因的特定碱基进行定点改 变、缺失或者插入可以改变对应氨基酸序列和蛋白质结构，可以进一步了解蛋白质结构和功 能之间的关系，探讨蛋白质的结构域。 定点突变技术适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比p c r 随机突变更有目的性，也更为 精确、简单。由于定点突变技术在蛋白质组学中有着非常广泛的应用前景，相信这个技术在 不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多的人熟悉应用。 6 绿色荧光蛋白g f p 简介 无论是在原核生物还是真核生物中，报道基因都己作为一种便利的标记广泛应用于观察 体内基因表达和蛋白定位。然而，。常用报告因子，如多一g l u c u r o n i d a s e ( g u s ) 【1 删， 一g a l a c t o s i d a s e ( l a c z ) 【1 4 1 1 ，氯霉素乙酰基转移酶( c a t ) 【1 4 2 1 ，荧光素酶( l u c i f e r a s e ，l u c ) 【1 4 3 】 或者需要外源底物伴随因子或者需要抗体。因此，它们的应用有时受到底物吸收、产物渗漏、 细胞固定和细胞渗透等问题的限制，在多细胞有机体中尤为明显。尽管一个玉米调控基因r ( l c ) 通过激活活体组织内花青素生物合成通路已被用作一个细胞自发标记，这一调控因子在不同 植物体内似乎受到细胞类型和发育阶段的影响f 1 4 4 】。因此，一种本身具有信号的惰性报道因子， 如生物体发光蛋白才有可能成为一种通用的细胞水平的标记因子1 4 5 1 。 g f p 是来源于水母( 彳p 口，d 渤玎c 芒删动的绿色荧光蛋白，由于具备许多突出特点，因此 被广泛应用于活体细胞作为报告基因。例如，g f p 的表达是细胞自发性的，而且没有细胞类 型特异性和细胞定位特异性：g f p 的激发只需要蓝光或者紫外光以及氧分子，而不需要任何 其他外源的底物【1 4 6 】：构建g f p 与目的蛋白的融合蛋白非常方便，而且加了荧光标签的目的蛋 白的原始功能和定位不会被破坏【1 4 7 1 。目前，水母g f p 已经在许多异源生物体内，如大肠杆菌、 酵母、线虫、果蝇、哺乳动物1 4 6 】和高等植物 1 4 8 】得到了表达。 g f p 在植物体中的应用 在活体植物细胞中g f p 能够正常表达，利用荧光显微镜或者共聚焦显微镜都可以检测到 它的自发荧光，而且可以有效地与液泡和叶绿体的自发荧光区别开来。g f p 的检测快速、简 山东师范大学硕士学位论文 单、经济，而且不需要额外的基因产物、底物或协同因子。利用g f p 可以直接测定报道蛋白 的表达水平，而不必间接地去检测酶活性或抗体。就目前蛋白在植物细胞中的表达水平而言， 利用荧光计从细胞提取物( 1 0 0 0 0 0 细胞) 中定量荧光是很困难的。然而，利用成像系统即可完 成这一任务【9 j 。g f p 蛋白与c a t 和g u s 的稳定性相当，其绿色荧光在s d s p a g e 之后仍然可 见 1 5 0 】。另外，g f p 对于光致漂白具有明显的抗性，因此可以很方便的用于荧光激活的细胞类 型。蛋白在细胞中的自发表达避免了底物吸收和渗透的相关问题。作为一种蛋白标记，g f p 消除了其他标记存在的小的渗漏的产物对蛋白的亚细胞定位和转运的干扰。在玉米叶肉原生 质体中大量表达g f p 对细胞的毒性影响非常小。 为了发射出明亮的绿色荧光，g f p 蛋白要进行翻译后修饰以形成一个环化的三肽生色团： 丝氨酸一脱氢酪氨酸一甘氨酸。这一三肽与g f p 多肽共价结合【1 拍】。g f p 的绿色荧光在多种异源 有机体中都曾检测到，因此推测在所有的有机体中都存在一种通用的酶参与生色团的形成 【1 4 6 1 。然而，最近对大肠杆菌的研究表明，该三肽自身具有环化和氧化的催化活性【1 5 1 1 。显然， 生色团的自我催化形成进一步促进g f p 成为一种通用的报道因子。 s h e e n 等以g f p 为报道因子检测植物细胞中的热诱导基因表达情况，很方便的在单个细 胞中看到了基因的热激应答反应。同时，他们还将g f p 与光诱导的和a b a 诱导的启动子融合 在一起，看到了光和a b a 对g f p 表达的影响【m 引。所以g f p 可作为一种强大的工具来研究植物 细胞的基因调控和信号传导途径。g f p 的分子量相对较小，利于同其他蛋白相互融合来研究 蛋白的运输和亚细胞定位。如果将多个目的蛋白与不同的荧光标签相互融合，可以检测体内 的蛋白一蛋白相互作用或者蛋白的构型变化。g f p 的表达是一种快速的简单的无伤害方法，可 用于评价瞬时转染和稳定转化的效率。同时，当研究其他基因的功能时，g f p 还可用作内标。 在转基因植物中，尤其是像拟南芥根这种相对比较透明的幼苗组织中，它也可用作增强子和 基因陷阱、检测基因表达、细胞系和蛋白运输的重要的标记。 尽管g f p 在瞬时表达系统如电转化的玉米原生质体和基因枪轰击的拟南芥组织中是一种 不错的标记，但是在转基因植物中仍需要进一步提高蛋白的表达水平。h a s e l o f f 和他的同事 发现在g f p 的m r n a 中个隐蔽内含子的剪切会影响g f p 在有些转基因拟南芥株系中的表达。 目前，这种现象在其他的植物物种中是否普遍存在还不清楚。s h e e n 等的研究表明，在玉米 和拟南芥的瞬时表达体系中g f p 不被剪切或者只是部分剪切。在玉米的叶肉原生质体中g f p 没有被剪切，因为在这些转化细胞中只检测到了一条大小正确的多肽n 5 1 1 。基因枪轰激法会转 入细胞中大量的质粒d n a ，从而导致g f p 在拟南芥组织中高水平表达。现在还不清楚在这些 细胞中是否有部分g f p 的m r n a 被剪切。借助于一种转录或翻译增强子可以增加g f p 表达水平， 山东师范大学硕士学位论文 这更加确保了g f p 在单子叶植物细胞和双子叶植物细胞中的应用。 最近，几个实验室将g f p 标记进行了改进，使之更加敏感有效。例如，通过随机突变或 定点突变创造出许多g f p 新版本：具有蓝色荧光( c f p ) 的【1 5 1 1 ，具有单一激发峰和发射峰的，荧 光更强的，生色团形成更快速的e g f p 【”3 】等等。这些修饰增强了g f p 的敏感性，使得在一个 细胞或有机体中同时分析两个启动子或两个蛋白成为可能，而且与标准的滤光片更加匹配。 s e e d 等人人工合成了一种由哺乳动物偏好的密码子组成的g f p 。s h e e n 等人合成了一种由高 等植物偏好的密码子组成的、不含隐蔽内含子的g f p 。为了进一步增加g f p 在转基因植物体 内的强度，可构建具有多亚基形成或核定位结构域的融合蛋白，因为在这些区域不存在自发 荧光的背景( n i w a ，u n p u b l i s h e d ) 。g f p 将会成为种研究高等植物的基因调控、信号传导、 发育和细胞生物学的重要的、多功能的、有价值的工具。 1 9 山东师范大学硕士学位论文 第二部分实验论文 一、实验材料 1 1 植物材料： 拟南芥( 肌6 j 咖s j s 芒加j a 门a ) ，c 0 1 u m b i a 生态型。彳芒脚办突变体订购于s a l k 库。种 子播种于将土、蛭石、珍珠岩按3 ：2 ；1 比例混合的培养土中，培养条件是温度1 8 2 2 ， 光照1 6 h ，黑暗8 h ，光照强度为1 1 0 岬0 1 m - 2 s 一，用h 0 9 1 a n d 营养液每三天浇一次。无菌种 子播种于m s 培养基上，培养条件是温度2 2 2 5 ，光照1 6 h ，黑暗8 h ，光照强度为 1 1 0 岬0 1 m - 2 s 。 1 2 菌种： 大肠杆菌d h 5 a ，大肠杆菌d e 3 ；农杆菌似g 阳施c 盯f “mm 川乞历c 把淞) g v 31 0 l 。 质粒载体：p b k - c m v ，p g e x6 p 一1 ，p p k l 0 0 ，k s ，植物双元表达载体p c a m b l a 3 3 0 1 。 1 3 酶及化学试剂： 产品名称产地 t a q 酶实验室自制 限制酶及连接酶t a k a r a 公司产品 卡那霉素( k a n ) s i g m a 公司产品 氨苄青霉素( a m p ) s ig l i l a 公司产品 x g a ls i g m a 公司产品 i p t gs i g m a 公司产品 利福平( r i f )s i g m a 公司产品 其它化学试剂均为国产或进口分析纯，g e n e c l e a n 回收系统为本实验室自制。 所用引物由上海博亚生物公司合成。 1 4 培养基： l b 培养基： t y p t o n e y e a s te x t r a c t n a c l 1 0 9 l 5 9 l l o g l 山东师范大学硕士学位论文 用5 mn a o h 调p h = 7 o 一7 2 ，定容，高压灭菌1 5 2 0 m i n 。圆体 培养基加入1 5 的琼脂。 m s 培养基：见( m u r a a s h i g eta n ds k o o gf ，1 9 6 2 ) 1 嘲 1 5 主要设备： 仪器名称型号产地 p c r 热循环仪2 2 3 3lh a m b u r g德国e p p e n d o r f 公司 凝胶成像系统 t r a n s i1l u m i n a t o rt u 一2 0 超速冷冻离心机 j 2 2 1b e c k m a n 公司 台式冷冻离心机 p i c 0 1 7 t h e r m o 公司 超净工作台 h d 一9 2 0哈尔滨东联电子公司 振荡培养箱h z q x 1 0 0 型哈尔滨东联电子公司 超低温冰箱 m d f 一3 8 2 e 日本 紫外分光光度计 t 6s p e c t r o p h t o m e t e r北京普析通用仪器有限公司 光照培养箱 h p g 一2 8 0 b哈尔滨东联电子公司 共聚焦显微镜 t c ss p e德国l e i c a 公司 光学显微镜日本o l y m p u