（分析化学专业论文）流动注射化学发光法在喹诺酮类药物分析中的应用.pdf

河北大学 学位论文独创性声明 jllillliflllllllllllllllllllllfllrlllr u l y 17 9 8 4 4 3 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 珏簪 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密囱。 ( 请在以上相应方格内打“ ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为魄沁圃蔚磁袈光藤莲诺酮黼栖争返缸曰 的学位论文，是我个人在导师( 孙很夫) 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：赶日期：卫1 2 年么月坦日 作者签名： 导师签名： e l 期：型! 里年五月丝日 日期：趁i 2 2 年月l 日 摘要 摘要 喹诺酮类药物是用于泌尿、呼吸道、胃肠道。骨关节及皮肤等多种组织感染的抗 微生物药物，近年来得到广泛的应用，但是滥用喹诺酮类药物，不仅增加了生物的抗 药性，还给环境造成了一定的影响，危害到人们的健康，因此，建立一种简单、灵敏、 快速、准确的测定喹诺酮类药物的方法非常必要，本文根据喹诺酮类药物的化学发光 行为，建立了流动注射化学发光测定喹诺酮类药物的分析方法，并对机理进行了探讨， 对以后的工作奠定了一定的基础。全文分为： 第一章：论述了化学发光分析法的历史及原理，并介绍了对喹诺酮类药物的研究 进展。 第二章：提出了测定恩诺沙星的化学发光新方法，采用恩诺沙星一k m n 0 4 一 n a 2 s 2 0 3 一h 2 s 0 4 化学发光体系，成功的测定了恩诺沙星注射液和片剂中恩诺沙星的 含量，回收率在9 7 3 1 0 5 1 和9 0 1 1 0 3 6 之间，结果令人满意。 第三章：研究了新的化学发光体系a g ( i i i ) 一h 2 s 0 4 ，并用于恩诺沙星的测定， 试验中不仅测定了片剂及注射液中恩诺沙星的含量而且对此体系的机理进行了探讨， 建立了快速灵敏的测定恩诺沙星的化学发光新方法。 第四章：利用诺氟沙星对a g ( i i i ) h 2 s 0 4 体系的增敏作用，我们建立了测定诺 氟沙星的化学发光方法，该方法检出限为3 0 9 7 x 1 0 一g m l ，对2 0 1 0 。7 9 m l 诺氟沙 星进行1 1 次平行测定，相对标准偏差为1 7 。回收率在9 5 0 - - 1 0 4 0 利用该方法 测定了血清，尿液和胶囊中诺氟沙星，结果令人满意。 关键词 化学发光流动注射喹诺酮a g ( i i i ) a b s t r a c t a b s t r a c t q u i n l o n e sa r et h en e wg e n e r a t i o nb r o a d s p e c t r u ma n t i b i t i e su s e di nt h et r e a t m e n to f i n f e c t i o n so fu r i n a r yt r a c t ，r e s p i r a t o r yt r a c t ，g a s t r o e n t e r i t i s ，s k i na n ds k i ns t r u c t u r e si n f e c t i o n s ， t h e ya r ed e v e l o p e dq u i c k l ya n dw i d e l yu s e df o rc l i n i ci nr e c e n ty e a r s ，b u tt h i sr e s u l ti nn o t o n l yt h ee n v i r o n m e n tt ob ec o n t a m i n a t e d ，b u ta l s o t h er e s i s t e n c et ob ei n c r e a s e d ，e v e n e n d e n g e rf o rt h eh u m a nl i f e t h u s ，i ti sn e c e s s a r yt os t u d i e da n df o u n d e dt h eq u i c ka n d s e n s i t i v ea n a l y s i sm e t h o d so fq u i n l o n e s t h i st h e s i ss t u d i e s t h ec h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) b e h a v i o ro fq u i n o l o n e s ，a n du s e dt h ef l o wi n j e c t i o nc lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f s o m eq u e n o l o n e s t h ec lm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d t h i sdis s e r t a tio ni n c l u d e sf o u r c h a p t e r sa sf o l l o w s ： c h a p t e r1 ：t h eh i s t o r ya n df u n d a m e n t a lp r i n c i p l eo fc lm e t h o da r er e v i e w e da n d i n t r o d u c e dt h ec lm e t h o d sf o rq u i n o l o n e si nd e t a i l s c h a p t e r2 ：ac h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m - - e n r o f l o x a c i n k m n 0 4 一n a 2 s 2 0 3 一h 2 8 0 4 ，w a s d e v e l o p e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fe n r o f l o x a c i n t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fe n r o f l o x a c i nt a b l e sa n di n j e c t i o n sw i t hs m i s f i e dr e s u l t s a n dt h er e c o v e r yi s b e t w e e n9 7 3 1 0 5 1 a n d9 0 1 1 0 3 6 c h a p t e r3 ：t h ec h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o no fa g ( i ) - h 2 s 0 4s y s t e mw a ss t u d i e d b a s e do ni t ，an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fe n r o f l o x a c i nw a sd e v e l o p e d i nt h i s e n p e r i m e n t ，w ed e t e r m i n e dt h ee n r o f l o x a c i nt a b l e sa n di n j e c t i o n sa n dd i s c u s s e dt h et h e m e c h i n i s m c h a p t e r4 ：n o r f l o x a c i nc a ne n h a n c et h ec ls i g n a l so f a g ( i i i ) 一a 2 s 0 4s y s t e m ，an o v e l r a p i d f l o wi n j e c t i o nm e t h o d 、i t hc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nw a se s t a b l i s h e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fn o r f l o x a c i n t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s3 0 9 7 x10 9 9 m l ，a n dt h er e l m i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n ( n = 1 1 ) i s1 7 a t2 0 x 1 0 g m l t h er e c o v e r yw a s9 5 0 - - - 1 0 4 0 ，t h i s m e t h o dw a su s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn o r f l o x a c i ni nt h es e r u m ，u r i n ea n dc a p s u l ew i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e y w o r d s c h e m i l u m i n e s c e n c e f l o w - i n j e c t i o nq u i n o l o n e sa g ( i i i ) 1 1 目录 目录 第1 章绪论1 1 1引言1 1 2 化学发光简介1 1 3 流动注射化学发光分析法简介5 1 4 喹诺酮类药物研究进展5 第2 章流动注射化学发光法测定药物制剂中恩诺沙星的含量7 2 1 引言7 2 2 实验部分7 2 3 结果与讨论k 8 第3 章a g ( i i i ) - h 2 s 0 4 化学发光新体系测定恩诺沙星1 4 3 1引言1 4 3 2实验部分14 3 3 结果与讨论1 6 第4 章二( 氢过碘酸) 合银( i i i ) 配离子硫酸一诺氟沙星化学发光体系的研究2 3 4 1 引言2 3 4 2 实验部分一2 3 4 3 结果与讨论2 5 第5 章结论与展望3 3 5 1 结论3 3 5 2 展望3 3 参考文献3 5 附录4 1 致i 射4 2 i i i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1引言 化学发光( c l ) 是在化学反应中，反应物或者生成物吸收了反应中释放的能量而 被激发到激发态，然后从激发态回到基态的发光过程。化学发光分析则是根据此过程中 的发光强度或辐射总量与被测物之间的线性关系确定被测物含量的一种分析方法。由于 它不使用任何光源，避免了光源和杂散光的干扰，具有较高的灵敏度和较低的检出限， 此外，由于化学发光分析的仪器简单，尤其是与流动注射相结合后，更具有分析速度快， 容易实现自动化的特点，得到人们的广泛应用。 然而由于其选择性和重现性差的缺点，也限制了它在某些领域的应用。随着其他技 术的发展，化学发光联用技术逐步解决了上述问题，与高选择性的高效液相色谱联用， 克服了化学发光选择性差的缺点；与流动注射联用，解决了重现性差的问题。 从最开始在萤火虫体内发现了发光现象以来，化学发光迅速发展，并逐步成为了一 种分析方法。洛芬碱，鲁米诺和光泽精的化学发光行为的发现，让人们最初了解了化学 发光。随着发光试剂的发展，人们逐步建立了化学发光分析方法，并应用于各个领域， 例如：在无机物、有机物分析中的应用；生物体内活性氧的化学发光分析，化学发光免 疫分析，化学发光对药物的分析；化学发光在环境检测方面的应用；化学发光对微量金 属元素的分析等。为了提高灵敏度，人们寻找各种增敏剂，提高化学发光信号，降低方 法的检出限。一些稀土元素逐渐被人们发掘出来应用于化学发光中。 1 2 化学发光简介 1 2 1化学发光研究历史 人们最早发现发光现象是在萤火虫体内，由于它是在生物体内发出的可见光，因 此被称为生物发光。在自然界中，发光生物体约近千种。早期亚里士多德就在d e a n i m a ) ) 一书中描述了真菌类和死鱼的发光现象。后来，罗伯特波义耳证实生物发光 需要氧气的参与。1 9 世纪8 0 年代末，d u b o i s 使用荧光甲壳虫素的冷热水提取物进行了 试验，结果发现在氧存在的条件下，热水提取物和冷水提取物在混合时会发生发光现象。 他将这种热不稳定的冷水提取物和热稳定的热水提取物分别命名为荧光素酶和荧光素。 河北大学理学硕十学位论文 这些名称己逐步用于生物发光反映的酶和底物。到了1 9 世纪后期，人们发现简单的非 生物有机化合物也能产生化学发光现象。1 8 7 7 年，r a d z i s z e w s k i 1 1 发现洛汾碱( 2 ，4 ， 5 一三苯基咪唑) 在碱性介质中被过氧化氢等试剂氧化发出绿色的光，这种试剂至今仍然 普遍得到使用。 广泛用于血迹鉴定的鲁米诺( 3 - 氨基苯二甲酰肼) 发光试剂早在1 0 0 多年前的1 9 0 2 年由s c h m i m 合成而得，1 9 2 8 年a l b r e c h t 【2 】观察到鲁米诺在碱性介质中的化学发光行为， 这一试剂的合成和发光现象的发现，对于化学发光发展成一种分析化学重要手段起到重 要的作用。当前化学发光分析法已在生物体的组织成分、临床药物、环境污染等微量分 析中显示出极大的作用。1 9 3 5 年，g l e u 和p e t s c h 3 j 第一次报道了光泽精( n ，n 一二甲基 二吖啶硝酸盐) 与过氧化氢反应产生化学发光现象，在以葡萄糖测定为典型例子的许多 还原性物质测定中获得应用。以后吖啶盐化学发光现象的发现、化学发光标记试剂的合 成和化学发光免疫分析成为2 0 世纪8 0 年代的一个热门研究内容，促进了这一类分析方 法在人体成分分析中的应用。 但是，由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学发光研究进展一 直比较缓慢，几乎没有获得实质性的应用。1 9 4 5 年光电倍增管出现，1 9 5 0 年出现商品 化的化学发光测试装置。到了2 0 世纪6 0 年代，过去难以测试的微弱光的检测成为可能， 化学发光迈进定量分析研究的时代。以自由基为初始反应物的碳水化合物的自动氧化发 光，荧光素、曙红等具有荧光特性的染料与过氧化氢反应产生的化学发光等新体系，过 氧化草酸酯的过氧化氢体系等化学新方法的出现，对于测定超微量的氨基酸、儿茶酚胺、 族类等化合物的高灵敏度检测发挥着重要的作用。国外化学发光分析方面的研究在2 0 世纪六七十年代得到迅速发展，直至现在，化学发光分析的研究和应用仍然是痕量分析 领域的一个十分重要的研究方向。我国的化学发光研究工作起步较晚，到2 0 世纪7 0 年 代后期才有介绍文章【4 】，8 0 年代才有原始性的研究报道，林金明等人于1 9 9 0 年底发表 了我国第一篇用英文撰写的化学发光【5 】和电致化学发光m 3 研究论文，为我国的化学发光 研究走向世界迈出第一步。2 0 世纪的最后2 0 年，陕西师范大学章竹君教授和福州大学 张帆教授领导的研究小组在化学发光试剂，如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等的合成和化 学发光仪器的研制方面取得突破性的进展。廉价的化学发光仪器和相对比较方便的试剂 来源，促进了我国化学发光研究的进展，短短1 0 多年，化学发光分析的研究和应用在 2 第1 章绪论 我国得到普及，全国数百家科研院校、医院和企事业单位正在使用和不断研究化学发光 分析新方法。他们对鲁米诺化学发光反应的研究、偶合化学发光反应的研究都比较细致 深入。 从2 0 世纪6 0 年代的气相色谱、7 0 年代的液相色谱、8 0 年代的毛细管电泳到9 0 年代的微流控芯片等分离技术的出现，为化学发光这一高灵敏度检测技术提供用武之 地。近年来，高效液相色谱化学发光检测的分析方法、化学发光成像技术、化学发光免 疫分析法和生物的超微弱发光在生命科学、临床医学和环境化学等许多领域的应用都已 成为研究的热点。 1 2 2 化学发光原理 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，简称c l ) 是化学反应过程中，反应物或生成物分 子吸收了反应释放的化学能，其电子由基态跃迁至激发态，再由激发态返回基态时所产 生的光辐射。其过程主要有图1 2 2 中的两种可能：物质a 和b 反应，产生激发态 c ，- c ，c 冰为发光物质直接发出可以测量的光；物质a 和b 反应，同样产生中间体c 母， 当体系中存在另一种易于接受能量的荧光物质f 时，c 木把能量转移给荧光体，使得荧 光物质接受了能量由基态跃迁至激发态，当激发态分子返回基态时，产生光现象，其发 光体为荧光物质，发光波长与荧光物质的荧光发射波长一致。 或者 激发态 f c 基杏 f 图1 2 2 化学发光的反应过程 a4 - b c 。4 - d c 一c + h d ( 1 2 。1 ) ( 1 2 2 ) 河北大学理学硕士学侮论文 a + b 叫c t + d c t + f f t + c ( 1 2 3 ) ( 1 - 2 4 ) f 一f + h l ， ( 1 2 5 ) 广义的化学发光也包括电致化学发光。根据以上的反应过程，一个化学反应要产生 化学发光现象，必须满足以下三个条件：第一，反应中可提供足够的激发能，并由某一 步骤单独提供，因为前一反应释放的能量将因振动驰豫消失在溶液中而不能发光；第二 有有利的反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；第三， 激发态分子具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个 分子使之进入激发态并释放出光子。 化学发光反应之所以能够用于分析测定，是因为化学发光强度与化学发光速率相关 联，因而一切影响反应速率的因素都可以作为建立测定方法的依据。既包括了一个发光 过程又包括了一个化学反应的过程。所以，化学发光强度( 昆l ) 取决于化学反应的速 率、激发态产物的效率和激发态物质的发光效率。 i c l = q ) c l d c d t = t 【p e x t p e m d c d t ( 1 2 6 ) 式中昆i 化学发光强度( 每秒发射的光子数) d c d t - 一化学反应速率( 每秒的反应分子数) t p c i 化学发光量子产率( 每一个参加反应的分子发射的光子数) q e _ 一激发态量子产率( 每一个参加反应的分子产生的激发态) q e 扩一发光量子产率( 每一个激发态产生的光子数) 对于一定的化学发光反应，q ) c l 为一定值。通常，可以用于分析化学的化学发光体 系的p c l 值在0 0 1 0 2 0 之间。化学发光测定易受化学反应条件，如p h 值、离子强度、 溶液组成、温度等的影响，影响反应速率或任意一个量子效率的因素都会改变发光强度。 因此，在一定化学反应条件下，通过测定化学发光强度就可以测定反应体系中某中物质 的浓度。原则上讲，对于任何化学发光反应，只要反应是一级或假一级反应，都可以通 过式( 1 2 6 ) 进行化学发光定量分析。例如，在上述化学发光反应式( 1 2 1 ) 中，如果反应 物b 保持恒定，而物质a 的浓度发生变化可视为一级或者假一级反应，则 ii c l ( t ) d t = l c l d a ( t ) d t d t = 矽c l c , ( 1 2 7 ) 4 第1 章绪论 即化学发光强度i c l 与a 的浓度成正比。 化学发光分析测定的物质可以分为三类：第一类物质是化学发光反应的反应物；第 二类物质是化学发光反应的催化剂、增敏剂或者抑制剂；第三类物质是偶和反应中的反 应物、催化剂或者增敏剂等。通过标记方式利用这三类物质还可以测定人们感兴趣的其 他物质，进一步扩大化学发光分析的应用范围。 1 3 流动注射化学发光分析法简介 流动注射分析( f i a ) 是把要测的样品按一定体积注入到载体溶液中，从而随着载 体溶液被推进到反应管道中，样品在向前运动的过程中，与载流中的物质发生化学反应 而形成能够用于检测的物质被带入到检测器中进行检测，检测信号由计算机或者其它记 录仪记录。 流动注射技术提高了测定方法的重现性，因此得到了广泛的应用。现在随着我国社 会经济发展，国家、地方政府及企业等对科技进步日益重视，加大了对检测分析仪器的 资金投入，使检测手段不断进步，仪器设备不断更新【7 j 。 由于它具有分析速度快，精密度好，设备和操作简单，节省试剂及适应性广等优点 【8 1 ，流动注射分析方法现在已经应用到分析化学的各个领域，也促进了分析的自动化。 而且流动注射作为一种自动化，简便易操作的进样技术，能够与多种化学分析手段如吸 光光度法、原子光谱法、电化学以及发光分析法等联用【9 1 。 流动注射化学发光分析是把化学发光与流动注射结合起来的一种分析方法，它既具 备化学发光分析的高灵敏度的特点，又具备流动注射分析的速度快、仪器设备简单的优 点，是当前分析化学领域中研究的热点【1 0 】。 1 4 喹诺酮类药物研究进展 喹诺酮类药物是一类分子中具有喹诺酮或萘啶结构的人工合成的抗菌化合物。具有 广谱抗菌活性，它既可以抑制细菌d n a 解旋酶，从而达到抑制细菌的作用，又可以和 参与细菌d n a 复制、转录和修复所必需的拓扑异构酶作用，阻碍细菌的d n a 复制。 至今为止，喹诺酮类药物分为四代： 第一代喹诺酮类药物包括萘啶酸，只对大肠杆菌、痢疾杆菌、克雷白杆菌有效，但 因治疗不佳，现已少用或不用。 第二代喹诺酮类药物包括吡哌酸、西诺杀星和甲恶喹酸，其在抗菌谱方面较第一代 s 河北大学理学硕士学位论文 有所扩大，对枸橼酸杆菌、铜绿假单孢菌、沙雷杆菌也有一定抗菌作用。 第三代喹诺酮类药物中国内主要品种有诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟杀 星、依诺杀星、环丙沙星等，其抗菌谱进一步扩大，是目前临床应用最多的一类喹诺酮 类抗菌药。 第四代喹诺酮类药物在结构和药理特性上都有很大改进，除了保持第三代药品抗菌 谱广、抗菌活性强、组织渗透性好等优点外，抗菌谱进一步扩大到衣原体、支原体等病 原体，而且对革兰阳性菌和厌氧菌的活性作用显著强于第三代的诺氟沙星、环丙沙星等， 但对铜绿假单胞菌的作用较差【1 1 1 。 由于喹诺酮类药物的毒副作用小，而且与其他药物没有交叉性耐药性，所以被广泛 用于水产养殖和畜牧业中，但是，这些喹诺酮类药物的广泛应用势必导致了动物性食品 中喹诺酮类药物的残留，导致了对人体的危害，欧盟( e u ) ，联合国粮农组织( f a o ) ， 世界卫生组织( w t o ) ，食品添加剂与污染物联合专家委员会( j e c f a ) 1 9 9 0 年就规 定了几种喹诺酮的最大残留量，所以开发灵敏、高效的喹诺酮类药物检测分析方法具有 重要的经济效益和广泛的社会效益【1 2 】。 目前关于喹诺酮类药物的分析方法很多，k r l t l a n “1 3 】等报道了用改进的欧洲四平皿 法( f p t ) 检测食用肉中恩诺沙星和环丙沙星的含量。黄晓蓉等 1 4 】利用微生物法测定了 鳗鱼及其制品中残留的喹诺酮类药物。1 9 8 0 年吴秀梅等【1 5 j 用衍生化气相色谱法测定了 药片中萘啶酸的含量。姚如心等【1 6 】用衍生化气相色谱法技术，测定药物制剂中培氟沙星 含量的。j e f f e r r yrm 等【17 】用l c 法测定沙拉沙星在海峡鲇鱼中的残留。谢恺舟等【1 8 1 采 用h p l c 法测定鸡组织中环丙沙星残留。刘靖靖等【1 9 】采用h p l c 法同时检测8 种喹诺 酮类残留。d u a mjh 等【2 0 1 建立了检测环丙沙星残留的c i e l i s a 方法。曹立民等利 用生物免疫技术，以牛血清蛋白为载体蛋白，检测食品中氟喹诺酮类药物的残留。 m a t t h i a sf 等皿2 】采用毛细管电泳法分离了9 种喹诺酮类药物。k a t a r z y n am 等2 3 1 采用毛 细管区带电泳分析法分离和检测了环丙沙星及其混杂物。g u i d oep 等【2 4 】采用电化学生 物传感器对牛奶中的喹诺酮类药物残留进行检测。m a g n o a gt 等【2 3 】建立了测定药物制 剂和生物体液中莫西沙星含量的方波伏安法。 6 第2 章流动注射化学发光法测定药物制剂中恩诺沙星的含量 第2 章流动注射化学发光法测定药物制剂中恩诺沙星的含量 2 1 引言 恩诺沙星( e n r o f l o x a c i n ，简称e n r ) ，化学名称为：卜环丙基- 7 - ( 4 - 乙基- 1 - 哌嗪 基) 一6 一氟一1 ，4 一二氢一4 一氧代一3 一喹啉羧酸，属第三代氟喹诺酮类药物，主要用于治疗 细菌和支原体感染2 6 1 ，其含量测定方法已收载于中国兽药典2 0 0 0 年版一部【2 7 1 。文 献报道测定药物制剂中恩诺沙星的方法主要有紫外分光光度法【2 & 3 2 1 、液相色谱法 3 3 , 3 4 】、 酶联免疫分析法【3 5 】、荧光光谱法3 q 和原子吸收法【3 7 】。化学发光法具有灵敏度高、线性 范围宽、操作简便等优点，已广泛用于药物分析3 8 ，3 9 1 ，但未见有关测定恩诺沙星的文 献报道。本文建立了一种流动注射化学发光法测定注射液和片剂中恩诺沙星的新方法， 其检出限为1 1 x l o g m l ，相对标准偏差为2 7 。 2 2实验部分 2 2 1 仪器和试剂 i f f m e 型流动注射化学发光分析仪( 西安瑞迈电子科技有限公司) 。 恩诺沙星标准溶液5 1 0 4 9 m l ：准确称取0 0 2 5 9 恩诺沙星( 中国兽医药品检查所， 批号h 0 0 8 0 3 0 6 ) ，用1 5 m l0 1 m o l l 的氢氧化钠溶解，定量转移至5 0 m l 棕色容量瓶中， 用二次水稀释至刻线，即得浓度为5 x 1 0 4 9 m l 的标准溶液，于冰箱中保存，使用时用 水稀释至所需浓度。 高锰酸钾溶液，5 x 1 0 弓m o l l ：硫代硫酸钠溶液，5 x 1 0 一m o l l ；硫酸，2 5 m o l l ；其它 试剂均为分析纯，水为二次去离子水。 2 2 2 测定方法 按流路图2 2 2 安装仪器及管路，将定体积的恩诺沙星标准溶液或样品溶液与硫 代硫酸钠溶液混合后注入到高锰酸钾和硫酸混合液的载流中，进行化学发光测定，以峰 高定量。 7 河北大学理学硕士学位论文 图1 流动注射化学发光分析流程图 f i g 2 2 2s c h e m a t i cd i a g r a mo f f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c ea n a l y s i ss y s t e m 卜蠕动( p e r i s t a l t i cp u m p ) ；v - 一进样f 碉( s a m p l i n gi n l e tv a l v e ) ；c - 一流通池( n o w i n gc e l l ) ：p m t - 一光电倍增管 ( p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ) ：a m p _ 放大器( a m p l i f i e r ) ；h v 一负高压( h i 曲v o l t a g e ) ：r 一记录仪( r e c o r d e r ) ：w l 废液( w a s t e ) ； 咎一恩诺沙星溶液( e n r o f l o x a c i ns o l u t i o n ) ；b 硫代硫酸钠溶液州a 2 s 2 0 3s o l u t i o n ) ；o 一高锰酸钾溶液( k m n 0 4s o l u t i o n ) ； d 硫酸溶液( h 2 s 0 4s o l u t i o n ) 2 3 结果与讨论 2 3 1 流路参数的选择 实验表明，采样管长为1 4 c m ，内径为0 8 c m ，阀池距为3 l c m ，采样时主泵速度为 1 0 转r n i n ，副泵速度为1 0 转m i n ；测量时主泵速度为4 0 转m i n ，副泵速度为0 转m i n ， 此时具有最大的信噪比。 2 3 2 反应条件的选择 2 3 2 1 反应介质及其浓度的选择 在4 x 1 0 4 m o l l 硫代硫酸钠、5 x 1 0 4 m o l l 高锰酸钾和5 x 1 0 6 9 m e 恩诺沙星浓度条 件下，分别以相同浓度的硫酸、磷酸、盐酸、硝酸为反应介质，测量化学发光强度( 如 图2 3 2 1 所示) 结果表明，在硫酸介质中发光强度最大。随着硫酸浓度的增大发光强 度也增大，当硫酸浓度达到o 0 2 m o l l 时，发光强度达到最大值，当继续增大硫酸浓度 发光强度反而降低。所以硫酸浓度选为0 0 2 m o l l 。 第2 章流动注射化学发光法测定药物制剂中恩诺沙星的含量 u 0u 1u zu ju 40 5 硫酸浓度( m o l l ) 图2 3 2 1 硫酸浓度对化学发光强度的影响 f i g 2 3 2 1e f f e c to fs u l f u r i ca c i dc o n c e n t r a t i o no nr e l a t i v ec li n t e n s i t y ( 恩诺沙星：5 x l o g m l ； 硫代硫酸钠：4 x l o 。4 m o l l ；高锰酸钾：5 x 1 0 4 m o l l ) 2 3 2 2 高锰酸钾浓度的选择 由于高锰酸钾的浓度不仅影响测定的灵敏度，而且还影响测定的线性范围。以 0 0 2 m o l l 硫酸为反应介质，发光强度随高锰酸钾浓度的增大而增大( 如图2 3 2 2 所 示) ，但高锰酸钾的浓度超过l x l o - 3 m o l l 时，发光强度反而会减小。选用1 x l o - 3 m o l l 的高锰酸钾溶液为最佳。 j 。 u01 01 02 0 高锰酸钾浓魔1 0 4 m o l l ) 图2 3 2 2 高锰酸钾浓度对化学发光强度的影响 f i g 2 3 2 2e f f e c to fp o t a s s i u mp e r m a n g a n a t ec o n c e n t r a t i o no nr e l a t i v ec li n t e n s i t y ( 恩诺沙星：5 1 0 击g m l ；硫酸：o 0 2 m o l l ；硫代硫酸钠：4 x1 0 4 m o l l ；) q 侣 侣 他 伯 8 6 4 2 0 之 蜊矮米越亏l；晕 侣 ：2 侄 伸 8 6 4 2 o 之 莓矮米越扑芒 河北大学理学硕士学位论文 2 3 2 3 硫代硫酸钠浓度的选择 9 0 0 2 m o l l 硫酸为反应介质，当高锰酸钾浓度为l x l 0 刁m o l l 时，测定了不同浓度的 硫代硫酸钠所对应的化学发光强度( 如图2 3 2 3 ) 。结果表明，硫代硫酸钠浓度 5 x 1 0 4 m o l l 时，发光强度最大，信噪比最好。 z4口b1 u 硫代硫酸钠浓度( l o - 4 m o l l ) 图2 3 2 3 硫代硫酸钠浓度对化学发光强度的影响 f i g 2 3 2 3e f f e c to fs u d i u mt h i o s u l f a t ec o n c e n t r a t i o no nr e l a t i v ec li n t e n s i t y ( 恩诺沙星：5 x 1 0 巧g m l ；硫酸：0 0 2 m o l l ； 高锰酸钾：l x l 0 。3 m o l l ) 2 3 3 反应机理 为了研究k m n 0 4 - n a 2 s 2 0 3 一h 2 s 0 4 e n r 体系的发光机理，观测了该体系的荧光光谱 图( 图2 4 1 ) 和化学发光光谱图( 图2 4 2 ) 。从图中可看出，恩诺沙星的最大荧光发 射波长在4 4 6 n m ，化学发光光谱峰在3 9 3 3 n m 和4 1 4 3 n m 。s 0 2 + 的发光波长为3 0 0 4 5 0 n m 4 0 】，3 9 3 3 n m 处的化学发光峰与s 0 2 + 的发光波长相吻合。4 1 4 3 n m 处的化学发光可能是 由恩诺沙星的发光所致，其化学发光波长较荧光波长产生蓝移的原因有待进一步探索。 该体系的化学发光机理可作如下推测：s 2 0 3 2 在酸性溶液中可以生成h s 0 3 ，k m n 0 4 再 将h s 0 3 氧化成游离基h s 0 3 ，2 分子h s 0 3 形成1 分子s 2 0 6 二，$ 2 0 6 2 。分解产生激发态 s 0 2 + ，大部分s 0 2 + 通过分子间能量转移将能量传递给恩诺沙星( e n r ) ，使e n r 跃迁到 激发态( e n r + ) ，当e n r + 回到基态时发光。所以，该体系的化学发光机理可描述为： $ 2 0 4 2 。+ 旷一h s 0 3 + s m n 0 4 + h s 0 3 + i - i + _ h s 0 3 + m n 0 2 2h s 0 3 _ $ 2 0 6 2 。+ 2r v 1 n 寻 侣 5 o 毯慧米越外基 第2 章流动注射化学发光法测定药物制剂中恩诺沙旱的含量 $ 2 0 6 2 一s 0 4 2 。+ s 0 2 。 一1 s 0 2 一s 0 2 + 办v s 0 2 + + e n r e n r + s 0 2 e n r + 一e n r + h 1 ， 型 爱 呆 粼 o 4 0 04 5 0 波长( i 吼) 图2 4 1 荧光光谱 f i g 2 4 1 f l u o r e s c e n c es p e c t r a a ：n a 2 s 2 0 3 - h 2 s 0 4 ；b ：k m n 0 4 n a 2 5 2 0 3 - h 2 s 0 4 e n r ；c ：k m n 0 4 一h 2 s 0 4 - e n r ； d ：k m n 0 4 - e n r ：e ：日恨；入日= 2 8 0n m 3 5 04 0 04 5 0 5 0 0 5 5 06 0 06 5 0 7 0 0 波长( m n ) 图2 4 2 k m n 0 4 n a 2 s 2 0 3 h 2 s 0 4 e n r 化学发光光谱 f i g 2 4 2c h e m i l u m i n e s c e n c es p e c t r a 1 1 蓦| 狮 狮 懈 啪 啪 | 堇 啪 葶| 枷 垂| | 暑 伽 。 嚣米 河北大学理学硕士学位论文 2 3 4 校准曲线、精密度及检出限 在选定的最佳条件下，恩诺沙星的浓度在3 0 x 1 0 7 - 3 0 x 1 0 6 9 m l 范围内与发光强度 成良好的线性关系，校准曲线的线性回归方程为i = 1 0 8 0 8 1 c + 4 6 0 8 2 7 ，相关系数为 0 9 9 8 。对浓度为3 x 1 0 7 9 m l 的恩诺沙星溶液，进行1 1 次平行测定，相对标准偏差为 2 7 ，根据i u p a c 建议，计算得方法的检出限( 3 0 ) 为1 1x 1 0 1 9 m l 。 2 3 5 干扰情况 考察了恩诺沙星片剂中共存组分的干扰情况， 结果表明，对于8 0 x 1 0 刁g m l 的恩 诺沙星，1 0 0 倍的乳糖、d 半乳糖、柠檬酸、淀粉、蔗糖，5 0 倍的葡萄糖、聚乙二醇， 2 5 倍的糊精、苯甲酸钠，2 倍的抗坏血酸，1 0 0 倍的c a 2 + ，5 0 倍的m 9 2 + 、z n 2 + ，2 0 倍 的b a 2 + ，4 倍的f e 3 + 、c 0 2 + 、f e 2 + ，同倍量的c u 2 + 均不产生干扰；同倍量的i 、b r 有一 定干扰，但是由于样品中这些物质的实际含量均低于允许量，因此无需分离或掩蔽即可 直接测定。 2 3 6回收率试验与样品测定 对同一批号的恩诺沙星注射液随机抽取5 支加以混合，适当稀释，准确移取一定量 的注射液于2 5 m l 容量瓶中，加入不同量的恩诺沙星标准，加水定容，摇匀，根据相应 标准曲线方程计算注射液中恩诺沙星的回收率。取恩诺沙星片剂2 0 片( 每片含恩诺沙 星5 m g ) ，研细混匀，准确称取适量粉末，溶解后定容至1 0 0 m l ，干过滤，取适量滤液 配制溶液。进行加标回收试验。恩诺沙星的回收率和测定结果分列于表l 和表2 中。 表1 回收率试验结果 t a b l e1r e c o v e rt e s tr e s i a l t 样品含量加入量测得值平均回收率 ! q ：出生! q ：! 逝兰! q ：出生! 竺! ! 丝 片剂 223 9 59 7 3 注射液 2 4 6 2 0 7 9 5 4 2 0 6 5 4 7 9 6 1 0 5 9 9 2 9 0 1 1 0 4 9 2 6 1 2 第2 章流动注射化学发光法测定药物制剂中恩诺沙星的含量 表2 兽药制荆中恩诺沙星的测定 t a b l e2d e t e r m i n a t i o no fe n r o f l o x a c i ni nv e t e r i n a r yp r e p a r a t i o n s 本方法测定片剂和注射液，恩诺沙星的回收率在9 0 1 一1 0 5 范围内。与部颁标准含 量测定方法比较，结果无显著性差异( p 0 1 0 5 ) 。 河北大学理学硕士学何论文 第3 章a g ( i i i ) 一h 2 s 0 4 化学发光新体系测定恩诺沙星 3 1引言 恩诺沙星是第三代喹诺酮类药物，对大多数革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌有抗 菌活性h 1 1 。恩诺沙星能与细菌d n a 回旋酶亚基a 结合，从而抑制了酶的切割与连接功 能，阻止了细菌d n a 的复制4 2 1 ，由于它抗菌谱广和较强的组织渗透性，广泛用于兽医 临床。然而，由于这些药物在兽医领域的过度应用，导致了对环境的破坏 4 3 1 。药物剂量 的质量控制和对药物代谢的研究成为分析的重要任务。因此，建立恩诺沙星的分析方法 尤为重要。 测定恩诺沙星的大量方法已经建立，如分光光度法 4 4 1 ，荧光法【4 5 1 ，高效液相色谱法 ( h p l c ) 4 6 - 5 2 】，免疫法 5 3 , 5 4 1 ，和毛细管电泳法【5 5 , 5 6 】。然而，每一种方法都有弊端，仪 器昂贵，操作复杂，灵敏度低。 化学发光灵敏度高，线性范围宽，仪器简单，广泛用于生物，制药，临床和食品分 析5 7 5 9 1 。然而，却很少用于恩诺沙星的测定。毛细管电泳电化学发光测定牛奶中的恩 诺沙星及其代谢物环丙沙星的检出限为1 0 x 1 0 罐g m l 6 0 1 。我们用流动注射化学发光测定 恩诺沙星的检出限为1 1 x 1