（微生物学专业论文）黑色素的生物合成和性质研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：念垂旌日期：堂釜3 ) 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名避至叁导师签名：趣日期：御弘j ， 山东人学顺i j 学位论文 摘要 对不同来源获得的4 7 株菌株在酪素培养基、l t y r 发酵培养基上生长、 产色素情况进行了对比研究。其中从土样中分离得到的8 株菌株和从已有菌 种库中筛选到的1 株粗糙脉孢菌具有良好的产生黑色素的能力。 选取了t 4 和粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) a s3 1 6 0 2 ，比较了二者利用 5 种不同培养基产黑色素的能力。通过生理生化特性和1 6 s r d n a 比对，初步 鉴定t 4 菌株为奇异变形杆菌( p r o t e u sm i r a b i l i s ) 。 优化了粗糙脉孢菌( n c r a s s a ) a s3 1 6 0 2 生产黑色素的条件，结果表明， 葡萄糖o 5 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 48 0 9 l ，n a c l3 0 9 l ，c a c l 20 1 9 l ，酪氨酸取饱 和浓度时，有相对高的产量。 单因子实验初步确定了适合奇异变形杆菌( 尸m i r a b i l i s ) t 4 的发酵条件 为：葡萄糖1 0 9 l ，蛋白胨1 0 9 l ，n a c l3 0 9 l ，干酪素8 o g l ，c a c l 20 15 9 l ， 酪氨酸取饱和浓度。 对粗糙脉孢菌a s3 1 6 0 2 、奇异变形杆菌t 4 所产黑色素，从黑米提取的 黑色素以及化学合成黑色素的紫外可见吸收光谱、红外光谱进行了对比，并 做了电镜观察。其他理化性质以粗糙脉孢菌a s3 1 6 0 2 所产黑色素为例进行 了考察。 几种黑色素在紫外及可见光区光谱扫描没有极值。红外光谱表征显示， 在1 6 0 0 、15 0 0 c m “左右都有芳环a r o m a t i cn u c l e u s 骨架振动引起较强的吸收 峰；在8 6 0 6 5 0c m “范围内的吸收较弱，表明芳环被驳代，形成共轭体系， 芳氢含量较少。 反映烷烃a l k y la r o m a t i c 结构的c h 吸收区( 2 9 3 0 2 8 3 0c m 叫) ，存在相对 较弱的吸收峰；1 15 0 1 0 0 0c m 。处的吸收峰，部分由c c h3 的弯曲和骨架振 动吸收参与形成：另外在1 4 4 0c m “附近有烷烃的c h 变形振动吸收。 各样品在3 4 0 0c m 。附近都存在较强的共振吸收，是由一o h 、n h 2 的伸 展振动产生的。1 6 5 0 1 7 1 0c m 。附近较强的吸收峰说明分子中存在羰基结 山东人学舰i 学位论文 构，与3 4 0 0c m “处的吸收峰一起指示c o o h 结构的存在。另外各样品羰基 吸收频率红移，说明分子中的羧酸以芳香羧酸结构存在。 建立了奇异变形杆菌t 4 和粗糙脉孢菌a s3 1 6 0 2 产生、分离和纯化黑 色素的方法。后者所产黑色素对e c o l id h5o 和质粒p a j 4 0 l 的紫外线防护 作用做了研究。活细胞计数和凝胶电泳结果证明黑色素是一种良好的光保护 剂。处于稳定期的细胞对紫外线的敏感性低于对数期细胞。 通过邻苯三酚自氧化、肾上腺素自氧化、f e n t o n 反应、油脂过氧化等方 法考察了相糙脉孢菌所产黑色素的抗氧化能力。实验结果表明，黑色素具有 清除超氧阴离子自由基和羟基自由基以及可以抑制油脂氧化的功能，因此可 以开发黑色素药物和功能性食品。 关键词：黑色素，抗氧化，光保护 山东人学坝1 学位论义 a b s t r a c t t h eg r o w t ha n dp i g m e n tp r o d u c t i o no f4 7s t r a i n so nc a s e i nm e d i u ma n d l - t y rm e d i u mw e r es t u d i e dc o m p a r a t i v e l y e i g h ts t r a i n ss c r e e n e df r o ms o i la n d onen e u r o s p o r ac r a s s as t r a i nf r o ms t r a i nl i b r a r yh a v et h eg o o dc a p a c i t yo f p r o d u c i n gm e l a n i n s t 4a n d c r a s s aa s3 16 0 2w e r es e l e c t e df o rt h e i rc a p a c i t yo fp r o d u c i n g m e l a n i n sonf i v ed i f f e r e n tc u l t u r em e d i a t 4w a si d e n t i f i e da sp r o t e u sm i r a b i l i s p r i m a r i l yt h r o u g hp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e ra n d16 s r d n a t h ec o n d i t i o n so fm e l a n i np r o d u c t i o nb ync r a s s aa s3 16 0 2w e r e o p t i m i z e d 0 ，5 9 lg l u c o s e ，8 ，o g l ( n h 4 ) z s 0 4 ，3 0 9 ln a c l ，0 1 9 lc a c l 2 ，a n d s a t u r a t e dc o n c e n t r a t i o no ft y r o s i n e ，w e r ef o u n dt ob et h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp m i r a b i l i st 4w e r e1 0 9 lg l u c o s e ，1 0 9 l p e p t o n e ，3 o g ln a c l ，8 0 9 l lc a s e i n ，0 ，1 5 9 lc a c l 2a n ds a t u r a t e dc o n c e n t r a t i o n o ft y r o s i n et h r o u g hs i n g l e f a c t o r sa n a l y s i s u v v i sa n df t - i rs p e c t r ao fm e l a n i n sf r o mp m i r a b i l i st 4 c r a s s aa s 3 16 0 2 r i c ea n dm e l a n i ns y n t h e t i cw e r eo b s e r v e d t h eu v v i ss p e c t r ao f s a m p l e sw e r ec h a r a c t e r i z e db ya c o n t i n u o u si n c r e a s i n ga b s o r p t i o no v e rt h er a n g e 7 0 0 3 5 0n m f t 一1 rs p e c t r as h o w e dt h a tt h eb a n d si nt h er e g i o n16 0 0 、150 0a m 1h a v e b e e na s s u m e dt ob ed u et ot h ev i b r a t i o n so fa r o m a t i cn u c l e u s t h eb a n d sn e a r 1 6 5 0 1 7 1 0c m l la r ea s c r i b e dt ot h ef r e ec a r b o x y l i cg r o u pc o o ha n dt h eb a n da t 1 4 0 0c m 。1t ot h ei o n i z e dc a r b o x y l ig r o u pc o o 一t h eb a n d si nt h e s p e c t r a l r e g i o n s11 0 0 1 0 5 0c m a n d1 2 4 0 1 2 0 0c m a r ea s c r i b e dt o t h eh y d r o x y l i c ， a l c o h o l i ca n dp h e n o l i cg r o u p s ，r e s p e c t i v e l y a p r o c e s sf o rp r o d u c t i o n ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fm e l a n i np r o d u c e db y t h ef e r m e n t a t i o no fp m i r a b i l i st 4a n dn c r a s s aa s3 1 6 0 2h a sb e e nd e v e l o p e d t h ee f f i c a c yo fm e l a n i np r o d u c e db yn ic r a s s aa s3 16 0 2i nt h ep r o t e c t i o no f 3 山东人学坝i 。学位论文 e c o l id h5da n dp a j 4 0 1a g a i n s th vl i g h ti r r a d i a t i o nh a sb e e ns t u d i e d r e s u l t s o b t a i n e db yt h el i v ec e l lc o u n t sa n dt h eg e le l e c t r o p h o r e s i so fd n as h o w e dt h a t m e l a n i ni sa ng o o dp h o t o p r o t e c t i v ea g e n t c e l l sf r o ms t a t i o n a r yp h a s ew e r el e s s s u s c e p t i b l et ou l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o nt h a nc e l l sf r o ml o g a r i t h m i cp h a s e t h r o u g hp y r o g a l l o la n de p i n e p h r i n ea u t o o x i d a t i o n ，f e n t o nr e a c t i o n ，a n d l i p i dp e r o x i d a t i o n ，t h ep r o t e c t i v er o l e so fm e l a n i nd e r i v e df r o mn c r a s s aa s 3 ，1 6 0 2w e r es t u d i e di nt e r m so f i t sa b i l i t yt oi n t e r a c tw i t ha c t i v eo x y g e ns p e c i e s a n da g a i n s tl i p i dp e r o x i d a t i o n o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tm e l a n i ncanb ea s c a v e n g e ro f a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n ds u s c e p t i b i l i t yt ot h ep e r o x i d a t i o ni s l o w e ri nt h eo i lc o n t a i n i n gm e l a n i na n dv c o u rd a t aa ls o s u p p o r t e dt h e h y p o t h e s i st h a tm e l a n i nc o u l dr e d u c el i p i dp e r o x i d a t i o n k e y w o r d s ：m e l a n i n ，a n t i o x i d a t i o n ，p h o t o p r o t e c t i o n 山东人学f ! j l1 学位论文 1 绪论 黑色素是一类广泛分布于动物、植物、微生物中的构造不规则的高分子 化合物。它是通过多羟基酚( 通常结合着蛋白) 氧化而成的类多酚聚合体， 具有荷负电的疏水性表面。这种色素虽然对于生物的生长、发育不是必不 可少的，但却能提高生物生存、竞争的能力。它是目前已知生物色素中最多 最广的一类色素。对于黑色素的研究已有逾半个世纪的历史，但由于黑色素 通常与蛋白质2 1 和多糖牢固地结合在一起不易分离以及黑色素对于可见光和 紫外光的吸收性质，使黑色素的研究遇到很大困难。因此有关黑色素的一些 基本问题，例如性质、提取纯化、来源和应用等，至今尚未完全阐明l j j 。 1 1 黑色素的分类 ( 1 ) 按照意大利化学家n i c o l l a u s 【4 的观点，可将黑色素分成三类：真 黑色素( e u m e l a n i n s ) ，主要是呈黑色或褐色的含氮色素，不含硫原子，由酪氨 酸、二羟基苯丙氨酸( 多巴) 、多巴胺、酪胺等氧化聚合而成；棕黑色素 ( p h a e o m e l a n i n s ) ，颜色较真黑素浅，含氮和硫原子，常呈棕色、红色甚至黄 色，是由酪氨酸经上述同样路径合成而来，其中有半胱氨酸的参与；异黑 色素( a l l o m e l a n i n s ) ，常呈黑色或棕色，主要存在于植物中，是在多酚氧化酶 ( p o l y p h e n o lo x i d a s e ) 存在下通过多酚的氧化聚合形成的。 ( 2 1 按产生部位可分为：壁结合( w a l l b o u n d ) 黑色素和胞外 ( e x t r a c e l l u l a r ) 黑色素。壁结合黑色素多存在于真菌的菌丝、分生孢子壁。 胞外黑色素则定义为在细胞壁外最终完成合成的黑色素。其合成有两种机 制：一是酚氧化酶分泌到外部环境中，氧化酚类化合物；二是酚类分泌到外 部后自氧化或者被胞外的酶氧化( 多发生在真菌自溶后) 【5 l 。 分泌酪氨酸酶的真菌或细菌往往会使含有蛋白胨或干酪素水解产物的 培养基颜色变深。向其培养基中添加酪氨酸变色会更明显。胞外黑色素在放 线菌、细菌、人类致病真菌中多有发现。 山东人学顺l j 学位论文 ( 3 ) 按照不同初始底物( 图1 1 ) 可分为：多巴黑色素，g d h b ( y 一谷 氨酰基一3 ，4 - 二羟基苯) 黑色素，儿茶酚黑色素，d h n ( 1 ，8 - 二羟基萘) 黑色 素，杂合黑色素6 ，川。 i i o i 】o h 0 d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ( d o p a ) o i l n n 1 1 2 - g l u t a m i n y l - 4 - d i h y d r o x y b e n z e n e ( g h b ) o 0 nc c 心c h 2 一c h c o o h h n h 2 - g l u m m i n y l - 3 4 d i h y d r o x y b o n z c n e ( g d h b ) o h h o 介 。o 。v ” c a t e c h o l 1 , 8 一d i h y d r o x y n a p h t h a 】e n e ( d i - i n ) 幽1 1 黑色素生物合成的几种底物 多数真菌和其他微生物中的黑色素是由酪氨酸经多巴合成而来。 b a s i d i o m y c o t i n a ( 担子菌) 细胞壁中的黑色素由y 。谷氨酰基。3 ，4 一二羟基苯 ( g d h b ) 或儿茶酚作为中问酚类前体。a s c o m y c o t i n a ( 子囊菌) 和一些 d e u t e r o m y c o t i n a ( 半知菌) 通过五酰基酮亚胺途径，以1 ，8 - 二羟基萘( d h n ) 为黑色素的前体【引。 多巴黑色素是酪氨酸酶氧化酪氨酸而来。动物中的黑色素也是这种方式 山东人学坝小学位论义 产生。红色色素则是由半胱氨酸和多巴醌反应聚合生成的。黄色和褐色色素 则是多巴和半胱氨酰多巴聚合形成的。因为它们相似的生化来源，红、黄、 褐色色素统称为棕黑色素。 真菌中出酪氨酸或是含有酪氨酸的蛋白水解物形成的胞外黑色素无疑 与动物中的黑色素类似，因为动物和蘑菇中的酪氨酸酶都可以出多巴形成相 同的黑色素生物合成中间物。蘑菇和粗糙脉孢菌中的酪氨酸酶已经详细研究 过。其他真菌、细菌、放线菌中也含有酪氨酸酶9 ，1 0 】。 还没有证据证明酪氨酸和酪氨酸酶在真菌细胞壁外( 黑色素形成的地 方) 存在；多巴在胞外的氧化已经证明，但是催化的酶却是漆酶，而漆酶不 能容易的氧化酪氨酸。a l t e r n a r i a ( 链格孢) ，c u r v u l a r i a ( 弯孢霉) ， d r e c h s l e r a ( 德氏霉属) ，v e r t i c i l l i u ms p p ( 轮枝菌) 白化突变株可以在胞外 将1 - 萘酚转化为一种紫色色素。形成的地方与黑色素沉积的地方具有致的 超微结构。这一紫色色素是漆酶的特殊底物，进一步证明这一膜结合酶参与 了黑色素的合成。 ( 4 ) 按照碱解或氧化降解产物的不同，又可分为：以儿茶酚( 邻苯二酚) 及酚酸类物质为主的儿茶酚型黑色索：以吲哚、毗咯及其衍生物为主的吲哚 型黑色素l 。 最常见的分类方法是将黑色素分为真黑色素和棕黑色素两种，而真黑色 素又由d h i ( 5 ，6 一二羟基吲哚) 和d h i c a ( 5 ，6 、二羟基吲哚2 一羧酸) 两种黑 色素杂合而成f f 2j ，真黑色素和棕黑色素的颜色、溶解性和相对分子质量( m r ) 等方面都有差别( 见表1 1 ) 。 表1 1 不同黑色素的颜色、溶解性及分子量比较 t a b l e1 一tc o l o r ，s o l u b i l i t ya n dm o l e c u l a rw e i g h to fd i f f e r e n tm e l a n i n s 山东人学顺小学位论文 1 2 黑色素的生物合成 在人体中，黑色素是在黑色素细胞中的黑色素体内合成的。黑色素细胞 位于人体表皮的基底层内，在黑色素细胞内，黑色素与蛋白质基质结合形成 黑色素粒。黑色素的合成受细胞内、外多种因素的影响。 1 2 1 细胞内因素的影响 黑色素的形成是一个十分复杂的过程，受细胞内多种酶的催化，但主要 是酪氨酸酶，5 ，6 一二羟基吲哚一2 - 羧酸( d h i c a ) 氧化酶( t r p 一】) 和多巴色素互变 异构酶( d o p a c h r o m et a u t o m e r a s e ) ( t r p ，2 ) 等的影响。 酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，它普遍存在于人和动植物体内，是由 二价铜离子( c u 2 + ) 与酶蛋白结合的金属酶( 图1 2 ) 。在它的活性中心有两 个铜离子，这两个铜离子能与周围的氮原子和氧原子形成3 种不同的状态。 在黑色素细胞中，大部分( 大于8 5 ) 的酪氨酸酶是处于铜离子态( e 。) ， 只有一小部分( 小于15 ) 处于氧铜离子态( e 。) ，在反应过程中还能形 成一种亚铜离子态( e d e o 、。) 。酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，能 将单酚加氧成邻苯二酚，也可以将邻苯二酚等多元酚氧化成醌( 图1 3 ) 。 在反应( 1 ) 中，如果有氢供体存在，加氧反应会很快进行，否则酶促 反应速度很慢。在反应( 2 ) 中，若有充分的氧气，氧化反应速度很快。酪 氨酸酶的这种双重反应功能对黑色素的形成至关重要。人的皮肤在同光下曝 晒变成棕色或黑色，就是因为人体中存在的酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成真黑 色素的缘故。 山东人学倾i 。学位论文 图1 2 酪氨酸酶的空间结构 幽1 3 酪氨酸酶催化过程 关于真黑色素的合成，目前认为是酪氨酸( 半必需氨基酸) 在酪氨酸酶 连续催化下氧化成多巴，再氧化成多巴醌，后者经环化进一步氧化成某些中 间产物。中间产物经重排和脱羧生成5 ，6 一二羟基吲哚m 】，后者再氧化生成相 应的醌。吲哚一5 ，6 一醌是形成真黑色素的主要前体，它与上述一些中间产物聚 合生成真黑色素( 图1 4 ) 。关于真黑色素的结构尚不完全清楚，许多学者用 仪器分析方法，如x 一射线衍射法，红外光谱法，电子顺磁共振波谱法( e p r ) ， 电子自旋共振光谱法( e s r ) 对黑色素的结构进行了研究。而n i c o l a u s 4 】和 - 9 一 o 山东人学坝小学位论义 。陬。_ 芝。一娜 0 0 吲噪一5 f 无色多巴色素 ： h 一： k 。i 队。 5 ，6 - = 羟基吲哚一2 一羧酸 多巴色素 图1 - 4 真黑色素的合成 f i g 1 - 4s y n t h e s i so fe u m e l a n i n s 棕黑色素的形成过程中，由酪氨酸到多巴醌与真黑色素是一致的。但在 多巴醌以后的反应中有半胱氨酸( c y s t e i n e ) 参加，产生5 - c y s 一多巴和5 - c y s 一 多巴醌，后者经环化、脱羧成为苯并噻嗪的衍生物，这种衍生物经过聚合生 成分子量更大的棕黑色素( 图1 6 ) 。动物体内通过控制条件，二者的合成过 程可相互转变【17 1 。 o 山东人学坝i 学位论文 强) h 0 2 e c o ， 0 神b , i 纠， 一2 譬 蚓1 5n i c o l a u s ( a ) l ls w a n ( b ) 建议的真黑色素的结构模式图 f i g 1 5m o d e l so fe u m e l a n i n s 山东人学颂i 。学位论文 i 队。 多巴眦 棕 0 o 图1 6 棕黑色素的生物合成 f i g 1 - 6b i o s y n t h e s i so fp h a e o m e l a n i n s c o o h 苯骈噻唑衍生物 多巴色素互变异构酶，又称t r p 2 ，是一种与酪氨酸酶有关的蛋白质， 其作用机理是促使所作用的底物发生重排，生成底物的某一同分异构体，最 终生成另一黑色素。即在由多巴色素自发脱羧、重排生成5 ，6 二羟基吲哚 ( d h i ) 的同时，黑色素细胞内部分多巴色素正是由于多巴色素互变异构酶 的存在而发生重排生成5 ，6 - 二羟基引哚2 一羧酸( d h i c a ) 。因此该酶主要调节 5 , 6 一二羟基吲哚一2 一羧酸的生成速率，从而影响所生成的黑色素分子的大小、 结构和种类 旧1 。 5 , 6 一二羟基吲哚一2 一羧酸( d h i c a ) 氧化酶，又称t r p 一1 ，多年来一直认为 它催化如下反应： 5 , 6 一二羟基吲哚一2 一羧酸一吲哚一5 ，6 醌一2 一羧酸 最近的研究表明在人体中这个反应是由酪氨酸酶而不是由t r p 一1 催化 的，t r p 。l 在黑色素合成过程中的作用是稳定酪氨酸酶的活性，这一点是人 体的酪氨酸酶与老鼠、蘑菇等的酪氨酸酶不同之处。 另外，无机离子如c u 2 _ ，f e 2 十，c d 2 + ，n i ”，c o ”，z n 2 + 等都能影响黑色 眦三j多 卜 。呐 一 弋删 。屯 哆 c s q 弋么， c 山东人学坝i ：学位论文 素的合成，但它们的具体作用机理至今仍不太清楚。 参与棕黑色素合成的含硫化合物到底是半胱氨酸( c y s t e i n e ) 还是谷胱 甘肽( g s h ) ，或两者都参与了反应，直到1 9 9 9 年p o t t e r f 等人的实验爿给出 了答案：g s h 不能简单的扩散到黑色体，也没有膜通道允许g s h 进入黑色 体，而半胱氨酸可以通过专门的膜通道进入黑色体，并参与棕黑色素的合成， 因此，半胱氨酸才是唯一的参与棕黑色素合成的硫化物。 半胱氨酸与多巴醌的加成速度远远大于多巴醌分子内的环化速度，当半 胱氨酸存在时，即使量非常小，反应也是倾向于合成棕黑色素。 1 2 2 细胞外因素的影响 黑色素的合成也受细胞外多种生理刺激物的影响，例如，促黑素细胞激 素( m s h ) 、黑灰色信号蛋白( a s p ) 、内皮素( e n d o t h e l i n ) 、促肾上腺皮质 激素( a c t h ) 、雌激素和紫外线等，这些生理刺激物的作用机理到耳前为止 还不是十分清楚。 黑色素的生物合成不仅在人和高等动物的皮肤、毛发和眼球组织中能够 进行，而且在一些植物和昆虫的表皮也可以进行。土豆、苹果、香蕉、甘薯 和蘑菇等被损伤后，暴露在空气中的创伤面会逐渐变为棕色，最后产生黑色， 其原因也是因为这些植物中含有酪氨酸酶，能发生上述的色素化反应，催化 酪氨酸或酚类物质氧化形成黑色素。由于酪氨酸酶在植物内部，反应需要分 子氧参加，所以，未暴露在空气中的内部组织就不会发生色素化反应。昆虫 体内也有酪氨酸酶，这对于昆虫表皮的硬化和黑化都起重要的作用。 在酪氨酸酶中，铜离子是必要的组分和催化活性中心，它在酪氨酸酶催 化酪氨酸氧化成多巴和多巴醌的过程中起关键作用，对黑色素的形成产生重 要影响。如果人体缺铜，会使酪氨酸酶含量减少或活性降低，出现局部性的 皮肤脱失症，即白癜风，或导致白头发。如果用铜类药物( c u s 0 4 等) 或紫 外光辐射治疗，会增加酪氨酸酶及其催化活性，促进黑色素的生物合成，使 病情缓解。但是，如果人体完全缺乏酪氨酸酶，就不会有黑色素产生，导致 皮肤、毛发乃至全身粉白。同时，因患者眼睛里没有颜色，以至血管也清晰 可见，看起来好像是红色的，对光线特别敏感，尤其害怕阳光( 紫外线) 的 山东人学坝小学位论奠 辐射。这种人就是我们在日常生活环境中偶尔碰到的“白化病”患者。“白 化病”是一种先天的遗传性疾病由于患者铜代谢发生异常和紊乱，体内缺 乏合成酪氨酸酶或酪氨酸的功能，因而不能在皮肤、毛发和眼睛中生成黑色 素，故全身粉白。此病目前还没有彻底根治的方法。 不同来源的酪氨酸酶有不同的分子特性，分子量、等电点都有较大的变 化。因而不同生物体产生的黑色素的性质也有差别。 1 3 黑色素的理化性质 ( 1 ) 溶解性 黑色素通常不溶于水、酸溶液和普通有机溶剂。少数情况下 黑色素的发色团与碳水化合物、蛋自质结合导致溶于水。纯的多巴黑色素和 d h t 黑色素几乎不溶于冷碱中：而棕黑色素则溶于冷藏。异黑色素也可溶于 稀碱液( 0 1 一1 o nn a o h ) 。 ( 2 ) 氧化还原性黑色素既可作为电子供体又可作为电子受体，故可用过 氧化氢或次氯酸钠氧化，也可用银离子或硫化氢还原。它能够有效地与活性 物质作用，如羟自由基和水合离子、单线态氧、超氧离子。它能捕获活性氧， 并且有抗氧化功能；它还能消除活性氧，具有类s o d ( 超氧化物歧化酶) 功 能，从而有效的防止心磷脂脂质体的过氧化。研究认为，在系统发育期闻， 黑色素分子的抗氧化功能优于实际的抗氧化酶系统。黑色索不仅充当类歧化 酶作用，同时还具有g s h ( 谷觥甘肽) 抗氧化功能，并在活体中参与将h 2 0 2 还原威h 2 0 【18 ，”1 。 ( 3 ) 超氧自由基 黑色素含有天然物质中少见的超氧自由基，并能吸收环 境中的超氧自由基。它还能清除自由基。在正常生理状态下，生命活动产生 自由基较少，并能及时清除，使其处于生理性低水平，对人体有利。自由基 浓度过高时，自由基和活性氧相互作用会导致d n a 链断裂、碱基破坏和 d n a 一蛋白质交联，对机体损伤很大。 山东人学删小学位论文 o r t h o - q u i n o n e e l e c 丁r o na c c e p t o r h y d r o q u i n o n e e l e c t r o nd o n o r s e m l q u l n o n e s d o n o ro ra c c e p t c o n j u g a t e dp o l y m e r p h o t o na b s o r 盯i o n 弋 d e c a r b o x y t a t e d i n d o l em o i e t y 图1 6 黑色素的功能基团 f i g 1 6f u n c t i o n a lg r o u p so fm e l a n i n s ( 4 ) 抗辐射性黑色素能吸收所有波长的光线，在紫外和可见光区域随波 长的增大，吸收值逐渐降低【3 ，在紫外波长下吸收值最大，能有效的保护紫 外辐射对蛋白质和d n a 等生物大分子物质的伤害【2 叭。所有黑色素由于有o h 和一n h 基团，导致它的红外吸收光谱在3 j a m 处有一个吸收峰。在近6 m 处 由于结合羰基基团也有一个吸收峰1 7 2 1 ，2 2 1 。黑色素是良好的紫外线吸收剂， 可以保护机体免受紫外线的辐射伤害。黑色素也具有抗日光、x 射线、r 射 线、宇宙射线、核辐射等多种辐射的作用。黑色素是目前所知的唯一保护皮 肤免受辐射伤害的天然生物聚合体【2 3 ，24 1 。 研究表明，天然黑色素、合成黑色素其电子白旋共振( e s r ) 波谱均是典 型的单线一次微商波谱，无超精细结构，其特征参数g 在2 0 0 3 0 2 0 0 4 4 之 间。 o o o 0 o o o o 厂lll，ll，llll 氓 山东人学付川。学位论义 1 4 黑色素的生物学功能 黑色素具有抗f 1 光、紫外线、x 射线、r 射线、宇宙射线、核辐射等多 种辐射的作用，因此，它具有保护体内细胞免受辐射损伤的功能，即黑色素 的光保护作用【25 1 。黑色素的这一性质可用于外表修饰，目前己被广泛应用于 生产防晒霜、沈发剂、染发剂和各类防辐射眼镜等。另外，黑色素在作为无 定形的半导体和生物杀虫剂的光保护剂等方面也有着广阔的应用前景。 黑色素含有天然物质中少见的超氧自由基，并能吸收环境中的超氧自由 基。因此，它能清除自由基【z “。 黑色素除赋于生物体某些特殊防御作用外1 2 7 j ，还具有抗氧化的功能。 e r i c s j 等 2 8 1 认为真菌黑色素可抵抗高锰酸盐、次氯酸盐及其他氧化物的氧 化作用：m a l g o r z a t a 等【2 9j 认为由酪氨酸酶催化产生的黑色素能阻止心磷脂脂 质体的氧化。 黑色素还能作为新型的天然的药物载体，用来治疗某些与黑色素缺乏有 关的神经系统疾病，如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏 舞蹈病等。近年来，m o n t e f i o r i 等报道，化学合成的可溶性黑色素还具有抑 制艾滋病病毒( h i v 1 ) 感染宿主细胞的作用。推测其作用机理是黑色素可以干 扰h i v 诱导的合胞体的形成，阻止h i v 1 被膜表面的糖蛋白和t 细胞特异 单抗与淋巴母细胞的结合。此类黑色素有可能成为一种有效的抗病毒类新 药。 黑色素是使皮肤、头发、眼睛显示颜色的物质基础。它还可以吸收多种 形式的能量并将之转化为可再利用的能量( 声音、光和热) 【2 ”，且具有维持 体温平衡的作用。有研究者认为黑色素与痛觉、听觉、视觉亦有关。 人和其他脊椎动物中黑化的皮肤和毛发是伪装的重要来源，尤其是在森 林环境中。聚集和分散黑色素颗粒的精确系统使得动物在不同环境或是不同 季节改变颜色。鱿鱼、章鱼释放的墨汁是自身防御扑食者的屏障，其中就含 有相当量的黑色素悬浮液。无脊椎动物和昆虫中黑色素仍然充当伪装的角 色。另外，在无脊椎动物中黑色素还具对微生物产生免疫应答的作用。 真菌中的黑色素在抵受微生物攻击中也起着重要作用。透明的j ：色 子或菌 丝在土壤中很快就会被杀死或是溶解，然而黑化的细胞可以存活很多年。因 山东人学坝1 学位论文 此土壤中发现的大多数真菌都是黑化的。 黑色素和支路产物还有抗生素作用。黑色素前体儿茶酚、5 , 6 一二羟基吲 哚、l ，8 一二羟基萘是广潜抗生素。黑色素分子中的自由基可以导致直接毒性 作用；或者通过竞争铁、铜等微量元素而抑制生长。 黑色素另一重要功能可能是抵抗水解酶( 几丁质酶、b 一1 ，3 葡聚糖酶、 b 1 ，6 葡聚糖酶、纤维素酶混合酶) 作用。黑色素可以抑制多种酶混合物溶 解真菌细胞壁的作用1 3 0 l 。因为黑化的真菌细胞壁可以抵抗微生物损坏，所以 它可能是土壤中腐殖酸和胡敏素( 腐殖质的一种组分) 的主要成分或来源。 黑色素与腐殖酸的共性有：不易被微生物降解；高温可分解并被质谱检测； 还原分解后产生酚类物质；水解产生氨基酸和碳水化合物；紫外可见光谱、 红外光谱、核磁共振图谱具有类似特征。黑色素在腐殖质中可以抵抗营养的 流失。磷在黑化细胞中流失较透明细胞中慢；铁、铜等微量元素也会与黑色 素相结合【3 ”，从而防止过量丢失。 另外，黑色素对病理学、分类学的研究也具有重要意义 3 2 1 。 1 5 黑色素的分离纯化 黑色素的提取有赖于其在碱性溶液中的溶解性以及在酸性溶液中形成 沉淀的性质，且酸性溶液的水解作用可以去除与黑色素结合的蛋白质、碳水 化合物以及脂类物质3 3 ，3 ”。 提取可溶性黑色素的有效方法是先用冷或热的碱液抽提，然后在酸性条 件( p h 2 3 ) 下使之沉淀，再在浓酸溶液中长时间作用，以除去蛋白质、碳水化 合物和脂质。进一步纯化则需在乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂中反复抽提， 并加以热酸水解。剩余物就认为是纯化的黑色素1 35 1 。 1 ，6 天然黑色素资源 1 6 1 植物源黑色素 许多植物的果实或叶呈黑色，可用来提取黑色素。目前，已经研究过的 山东人学坝l 。学位论文 植物材料主要有：黑糯米、黑芝麻、黑豆、枫叶、樟科树叶、葵花籽皮、香 蕉皮、天然茶子。其中，天然茶子和樟科树叶内的黑色素被研究用来作为染 发剂，黑糯米和黑芝麻内的黑色素被研究用来作为食品添加剂。 1 6 2 动物源黑色素 乌骨鸡、动物毛发、乌贼和蝌蚪是研究的最多的动物黑色素材料。动物 内黑色素都与蛋白质紧密结合，提取其中的黑色素时必须先用酸水解使黑色 素游离并沉淀出来36 1 。 1 6 3 微生物源黑色素 微生物所产的黑色素主要分为胞内和胞外黑色素。当前，研究从微生物 胞外来生产黑色素的报道比较多” 。如彭方等 3 8 1 从土壤中初筛得到1 3 株能 分泌黑色素的菌株，进一步筛选得到一株产黑色素能力高、产黑色素快，而 且产量大的t 1 菌株，正在进一步作开发应用方面的研究。段晓红等【3 9 l 用固 定化细胞方法固定产酪氨酸酶的细菌，以酪氨酸为底物生产黑色素获得成 功，该技术目前在国内外处于领先水平。y u 等从杆菌培养基中提取分离和纯 化了一种黑色素，并证明该黑色素具有防止紫外线辐射的作用”3 。 1 7 黑色素的研究现状 18 4 0 年瑞典化学家b e r z e l i u s 提出黑色素( m e l a n i n ) 这一名词，但是直到 2 0 世纪4 0 年代才开始有大量相关研究文献涌现”。当时黑色素泛指任何黑 色的色素，而今天黑色素则被定义为一类由酚类和或吲哚类物质经多步氧化 聚合形成的生物色素。 多年来，欧美等国家一直都有与黑色素相关的研究工作丌展。他们的工 作主要集中在对不同来源的黑色素的分离纯化、性质功能分析、元素组成的 确定、结构推导、化学降解研究以及一些与黑色素相关的免疫学、病理学的 研究。 i l j 东人学领l 学位论文 在我国，武汉大学以彭珍荣、沈薄为首的研究组在9 0 年代丌始了对微 生物产黑色素的研究，并将其获得的菌株的酪氨酸酶在大肠杆菌中克隆表 达，但未见他们对黑色素这一物质本身做深入细致研究的报道。另外，部分 研究者对从黑糯米、鱿鱼墨、头发、香蕉皮、枫香树叶中提取黑色素做了研 究。 1 8 本课题的研究目的和内容 目前，在化学工业中所用的黑色染料绝大多数是合成染料，其结构中的 特征基团为偶氮基，现已证实具这种结构的黑色染料有一定的毒性，能够致 癌。因此，很多国家已禁止将这种偶氮结构的染料用于与人体直接接触的消 费品上，如染发剂和皮革工业。在回归自然的趋势下，人们迫切需要安全无 毒，不会引起皮肤过敏的天然植物染发剂。日本、法国正在研制从天然植物 中提取臼发染黑剂。印度从苏木精中提取染发剂。我国地域广阔，有着极其 丰富的天然黑色素资源，必须抓紧充分利用这些资源，研制出具有实用价值 的产品。目前国内外已有这方面的专利报道，但在应用过程中发现用天然黑 色素做成的染发剂染发还存在不稳定的缺点，尤其是在流汗后更易脱落，因 此，还应进行配方方面的研究。 天然黑色素在食品工业上也有很广泛的用途，可将它作为酒类、饮料类、 婴儿保健品及大众食品等的添加剂。例如，提取黑芝麻、黑豆、黑米内的天 然黑色素，再配以山野果汁形成黑色饮料，更加丰富了营养成分，又保持着 天然本色。特别是近年来的研究表明，黑色素具有抗氧化和防止衰老等功能， 这将大大促进天然黑色素在日益受重视的保健食品工业中的应用。 天然黑色素具有防止紫外线辐射的功能，因此，可被用于日用化妆工业 制各防晒霜。此外，近年来发现一些可溶性黑色素在体外对艾滋病病毒有显 著的抑制作用，使天然黑色素将来有可能成为种新的抗义滋病药物。 我国地域广阔，有着极其丰富的生物资源，充分利用这些资源，研制出 具有实用价值的天然黑色素产品是我们可以也是我们应该做的工作。 目前，黑色素的生产主要用化学提取法和氧化合成法。前者提取率低， 后者工艺繁琐。微生物发酵工业有着长久的发展历史和自身的优点，本课题 1 j 东人学坝：1 学位论文 从筛选产黑色素菌种资源着手，对所得黑色素性质加以研究分析，对其光保 护、清除自由基、抗氧化等方面的生物学功能进行了较为深入的研究。 本论文研究的内容主要包括； 1 产胞外黑色素菌株的筛选和鉴定 2 黑色素发酵条件优化 3 粗糙脉孢菌发酵动力学初步研究 4 黑色素分离纯化和性质研究 5 粗糙脉孢菌黑色素生物学功能研究 山米人学坝j ：学位论文 2 产胞外黑色素菌株的筛选和鉴定 黑色素广泛存在于生物界中，植物、动物、微生物乃至人类都可产生此 类物质。在过去的研究中，多数集中在对真菌和动物黑色素的研究上。国内， 武汉大学对假单胞菌是否产黑色素进行了较为广泛和深入的研究。 本文对所采土样和部分己知菌种进行了筛选，得到了两株较好菌株。 2 1 材料和方法 2 1 1 1 菌种来源 从济南近郊土样中分离得到了1 8 株菌株；本实验室保存的2 1 株黑曲霉： 链孢霉( n e u r o s p o r a ) 3 4 9 ，黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 3 3 9 2 8 ，铜绿假单菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 1 15 ，蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u s c e r e u s ) 1 ，3 2 由微生物 技术国家重点实验室菌种室提供：粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s 5 ) a s3 15 9 8 ， 1 6 0 0 ，1 6 0 2 ，1 6 0 4 购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。 2 1 1 2 试剂 l 一酪氨酸购自北京经科公司；干酪素为上海政翔化学试剂研究所的产 品；其他试剂均为国产试剂。 2 1 1 3 仪器 u v - 2 4 0 紫外分光光度计；u v 一3 l o o 紫外分光光度计；s p e c t r am a x1 9 0 微板光谱仪；一s i g m a4 kj5 离心机；n i c o l e tn e x u s4 7 0f t i r s p e c t r o m e t e r ；h i t a c h ij e m 一1 0 0 c x i i 透射电镜；h i t a c h is - 5 2 0 扫描 电镜；m o d u l y o a 一2 3 0 冻干机。 2 1 1 4 培养基 ( 1