（无机化学专业论文）具有dna拓扑异构酶抑制作用的钌Ⅱ多吡啶配合物研究.pdf

摘要 具有d n a 拓扑异构酶抑制作用的 钌( i i ) 多吡啶配合物研究 专业：无机化学 硕士生：王宇传 指导老师：计亮年院士巢晖教授 摘要 d n a 是生命体的重要组成物质，与生物的生长、发育等正常生命活动以及 癌变、突变等异常生命活动息息相关。而d n a 拓扑异构酶是近年来研究最多的 与染色质结构有关的核蛋白。它通过改变d n a 的拓扑结构，在d n a 复制、转 录过程中发挥着重要作用。许多抗肿瘤药物都是作为d n a 拓扑异构酶抑制剂起 作用，而这种抑制作用又往往与小分子键合d n a 的能力有关。本论文设计合成 了一系列新型的钌多吡啶配合物，研究了它们与双螺旋d n a 的相互作用以及对 d n a 拓扑异构酶的抑制能力，并以酿酒酵母系统为模型探索了钌多吡啶配合物 对人的d n a 拓扑异构酶i i 的靶向性。全文共分为四章。 第一章，绪论，主要介绍了关于d n a 、d n a 拓扑异构酶抑制剂的基本概念， 介绍了配合物与d n a 作用以及作为拓扑酶抑制剂的研究方法和进展。 第二章，设计合成了八个含有噻吩基团的手性钌配合物。对这些配合物以质 谱，元素分析、核磁共振和电化学等实验手段进行了表征，归属和分析。用光谱、 热力学、粘度、圆二色谱等方法研究了配合物与d n a 的作用，发现八个配合物 都以插入的方式与d n a 结合，但无明显的异构体选择性。 第三章，研究了八个手性钌( i i ) 多吡啶配合物对d n a 拓扑异构酶的抑制作 用，从配合物与拓扑异构酶的抑制研究结果来看，含有卤原子的配合物在浓度相 2 0 1 0 届中山大学硕士学位论文王宇传 对较低的情况下，就能对t o p o i 和t o p o l i 产生抑制作用，在高浓度的情况下能诱 导d n a 缩合。另两对手性配合物同样能对t o p o i 和t o p o l i 产生抑制作用，但i c 5 0 值较高。从抑制的机理来看，这八个配合物都是t o p o i i i 的双重毒剂。 第四章，将人的d n a 拓扑异构酶i i 基因转入酵母细胞，使其在酵母细胞中 得到表达。利用流式细胞仪、荧光显微镜以及c f u 记数等方法研究了本文涉及 到的配合物对人d n a 拓扑异构酶i i 的靶向性抑制。实验结果表明，这一系列钌 配合物在酿酒酵母体系中并没有针对人的d n a 拓扑异构酶i i 起作用。含有卤原 子的钌配合物在高浓度时对酵母细胞的存活影响非常明显，这很可能是配合物诱 导d n a 缩合的能力所致。 关键词：钌( i i ) 多吡啶配合物，d n a 键合，d n a 拓扑异构酶抑制，酿酒酵 母模型 摘要 t h es t u d yo fr u t h e n i u m ( i i ) p o l y p y r i d y lc o m p l e x e sa sd n a t o p o i s o m e r a s ei n h i b i t o r s m a j o r ： n a m e ：y u - c h u a nw a n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i a n g - n i a n j i ，p r o f h u ic h a o d n ai st h em o s ti m p o r t a n ts u b s t a n c ei nl i v i n go r g a n i s m s ，w h i c hi sc l o s e l y r e l a t e dt ot h en o r m a lg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ta sw e l la st h ea b n o r m a lc a n c e r i z a t i o n a n dm u t a t i o no fl i f e d n at o p o i s o m e r a s e sa l en u c l e a re n z y m e st h a tr e g u l a t ed n a t o p o l o g ya n da l eb e i n gp a i dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s t h e s ee n z y m e s a r ec r u c i a lf o rc e l l u l a rg e n e t i cp r o c e s s e s ，s u c ha sd n ar e p l i c a t i o n , t r a n s c r i p t i o na n d r e c o m b i n a t i o n m a n ya n t i t u m o rd r u g sa c ta st o p o i s o m e r a s ei n h i b i t o r s ，a n d t h e i n h i b i t i o n sa r eu s u a l l yr e l a t e dt od n ab i n d i n g t h ea i mo ft h i sp a p e ri st od e s i g n c h i r a lc o m p l e x e sw i t hh i g ha f f i n i t yt od u p l e xd n a , a sw e l la su n d e r s t a n d i n go ft h e f a c t o r st h a tm i g h ti n f l u e n c ed n a - b i n d i n ga i t m i t yo ft h e s ec o m p l e x e s i no r d e rt o o b t a i nm o r ei n s i g h t si n t ot h ed n at o p o i s o m e r a s e i n h i b i t i o n p r o p e r t i e s o f r u t h e n i u m ( i i ) c o m p l e x e s ，as e r i e so fn o v e lm o n o n u c l c a rp o l y p y r i d y lr u t h e n i u m ( i i ) c o m p l e x e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e d i na d d i t i o n , t h eb u d d i n gy e a s ts a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a es y s t e mi su s e dt os t u d yt h ei m p a c to fm t h e n i u m ( i i ) p o l y p y r i d y lc o m p l e x e s t a r g e t i n gh u m a nt o p o i s o m e r a s ei i t h i st h e s i sc o n s i s t so f f o u rc h a p t e r s i nc h a p t e r1 ，a se x o r d i u m , i tf i r s ti n t r o d u c e st h eb a s i ck n o w l e d g eo fd n a a n d d n a t o p o i s o m e r a s e ，t h ec u r r e n ts i t u a t i o na n dr e s e a r c hm e t h o d so f d n a b i n d i n ga n d t o p o i s o m e r a s ei n h i b i t i o na r eb r i e f l yi n t r o d u c e d m 2 0 1 0 届中山大学硕士学位论文 王字传 i nc h a p t e r2 ，t h es y n t h e s i s , c h a r a c t e r i z a t i o n , e l e c t r o c h e m i c a la n dp h o t o p h y s i c a l i n v e s t i g a t i o no f8n o v e lr u t h e n i u m o dp o l y p y r i d y lc o m p l e x e sa r ep r e s e n t e da n d a n a l y z e d d n ab i n d i n gp r o p e r t i e so fr u ( i i ) c o m p l e x e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e dw i t h u v - v i s , e m i s s i o ns p e c t r a , d n at h e r m a ld e n a t u r a t i o n , c ds p e c t r aa n dv i s c o s i t y m e a s u r e m e n t s t h er e s u l t ss u g g e s tt h a ta l lt h e s e8c o m p l e x e sb i n dt oc t - d n av i a c l a s s i ci n t e r c a l a t i o nm o d e ，b u tt h e i ra b i l i t i e so fi n t e r c a l a t i n ga r en o ts os t r o n g ，a n dt h e aa n d 人i s o m e r ss h o w1 1 0o b v i o u sd i f f e r e n c e sb i n d i n gt od n a i nc h a p t e r3 ，t h ed n a t o p o i s o m e r a s e ( t o p e ) i n h i b i t i o no ft h ec h i r a lr u ( i i ) c o m p l e x e sh a sb e e ns t u d i e db yr e l a x a t i o na s s a ya n dd n ar e l i g a t i o na s s a y a l lt h e s e c o m p l e x e sa r ep r o v e dt ob ed u a lt o p oi f l ii n h i b i t o r s a a 一 r u ( b p y ) 2 ( p s c l ) 2 + a n d & k r u ( b p y ) 2 ( p s b r ) h a v el o w e ri c 5 0v a l u e sa n dc a ni n d u c et h ec o n d e n s a t i o no f o r i g i l l a l l yc i r c u l a rp l a s m i dp b r 3 2 2d n a t op a r t i c u l a t es t r u c t u r e sa tr e l a t i v e l yh i g h c o n c e n t r a t i o n i n c h a p t e r4 ，g e n eo fh u m a nt o p o l l aw a se x p r e s s e d i nt h ey e a s ts t r a i n j n 3 9 4 h t o p l i a , a n dt h er e c o m b i n a t n th u m a ne n z y m et o p o l l aa p p e a r st oc o m p e n s a t e t h ef u n c t i o no fy e a s tt 0 p 0 ，a n dd i s t i n c t i v e l yr e a c tt ot h ed r u g f l o wc y t o m e t r y , f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n ds t u d yo ft h ev i a b i l i t yp e r c e n t a g e ( e s t i m a t e db yc f u c o u n t s ) a r eu s e dt od e t e c tt h et a r g e t i n gi m p a c to fr u t h e n i u mc o m p l e x e so nh u m a n t o p o i s o m e r a s ei i o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a th t o p o l l as e e m sn o tt ob et h ec y t o t o x i c t a r g e tf o rt h e s er u t h e n i u mc o m p l e x e si ny e a s t o nt h eo t h e rh a n d ，h i g hd o s e so f r u ( b p y ) 2 ( p s c l ) 2 + a n d r u ( b p y ) 2 ( p s b r ) 2 + i n d u c ea p o p t o s i s 1 i k ec e l ld e a t hi n & c e r e v i s i a e ，w h i c hp r o b a b l yr e l a t e dt ot h e i rd n ac o n d e n s a t i o na b i l i t y k e y w o r d s ：r u ( i i ) p o l y p y r i d y lc o m p l e x e s ；d n a - b i n d i n g ；t o p o i s o m e r a s ei n h i b i t i o n ； s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a es y s t e m i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承 担。 学位论文作者签名：筠他 日期：洲。年c 月7 i e i 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交 论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量 复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或 其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：搦1 乏 日期：加c - 年6 月1 日 导师签名： 园 日期：年月 车夕 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下 完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识 产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专 利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以 任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：王自位 霉吵 日期： 加f 。年易月7 日 第一章绪论 i i 引言 第一章绪论 无机物与生物大分子的作用，主要表现为金属离子及其配合物对蛋白质和 d n a 的作用。金属配合物与d n a 相互作用研究的开展有助于人们从分子水平上 了解生命现象的本质，为设计和寻找有效的治疗药物提供有力的理论指导。生物 无机化学是在无机化学、有机化学和生物化学的交叉点上发展起来的边缘学科， 主要研究各种微量金属元素在生物体内的作用，活性的化合物的结构、物化性质 及与生物活性的相互关系等等。近年来随着该领域的不断发展，生物无机化学的 原理和实验方法在各种重要研究领域得到了广泛的应用。如将生物无机化学的原 理直接应用于临床，通过研究活性化合物的种类和数量对人体健康影响的机理提 出药用的金属配合物。有统计表明近年发现的具有抗癌活性的无机化合物已逐渐 多于有机化合物【l 川。 自二十世纪六十年代r o s e n b e r g 等发现顺铂有抑制细胞增殖的作用以来，金 属配合物的抗癌活性就成为了科学家们的研究热点，现已形成以第一代顺铂、第 二代卡铂和第三代奥沙利铂为主的市场用药。癌细胞的d n a 是铂类药物作用的 主要靶点：铂与d n a 链上的g 碱基络合造成d n a 交联，破坏d n a 复制模板， 从而抑制癌细胞分裂【4 ，5 1 。在非铂系药物中，金属钉配合物是最有前途的抗癌药 物之一，其优势在于对正常细胞的毒性较小，易于被肿瘤组织吸收，并且对转移 瘤具有明显的效果。目前有两个钌配合物i m h t r a n s i m d m s o r u c h ( n a m i a ) 和t r a n s - t e t r a c h l o r o b i s ( 1 h - i n d a z o l e ) r u t h e n a t e ( i i i ) 】( 1 0 1 0 1 9 ) 作为抗癌药物已进入 临床试验阶段。此类药物被运送到肿瘤细胞后，r - u 3 + 被还原成r u 2 + ，与肿瘤细胞 d n a 发生作用进而诱导细胞凋亡【6 羽。可见，d n a 作为生命体的重要组成物质， 已成为抗癌药物作用的关键靶点。 脱氧核糖核酸d n a 是遗传信息的携带者和基因表达的物质基础，具有多样 性、稳定性和能够自我复制等特点，在生物的生长、发育、繁殖活动中起着十分 重要的作用。d n a 拓扑异构酶( t o p o i s o m e r a s e ，t 0 p 0 酶) 是近年来研究得较多的 2 0 1 0 届中山大学硕士学位论文王宇传 与染色质结构有关的蛋白。它通过改变d n a 的拓扑结构，解决在d n a 代谢中 出现的种种构象上的问题，如在d n a 复制过程中复制器前端出现的d n a 高度 螺旋化，单个人体细胞的d n a 双链过长等等。与正常细胞不同，t 0 p 0 酶在肿瘤 细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，因此许多抗肿瘤药物都是作为 d n a 拓扑异构酶抑制剂来发挥作用，而这些药物的抑制作用又往往与小分子键 合d n a 的能力有关【9 1 。2 0 世纪8 0 年代，b a r t o n 等【l o 】发现配合物【r 吣h e n ) 3 】2 + 能够识别d n a 的二级结构。进而，许多具有类似结构的钌( i i ) 多吡啶类配合物 与d n a 的相互作用得到了广泛而深入的研究，并取得了许多令人瞩目的成果 1 l - 2 1 。为了深入研究配合物与d n a 及d n a 拓扑异构酶的作用机理，首先了解 一些基本的理论知识。 1 2 金属配合物与d n a 相互作用的理论基础 1 2 1d n a 的基本组成 d n a 以脱氧核苷酸为基本组成单位，构成链形生物大分子，其中戊糖和磷 酸基团主要起结构作用，在其碱基对中储存着大量遗传信息。d n a 水解后生成 的戊糖是p d 2 脱氧核糖。单元脱氧核苷酸以肽键方式连接构成d n a ，主要由 腺嘌呤( a d e n i n e ，a ) ，鸟嘌呤( g u a n i n e ，g ) ，胞嘧啶( c y t o s i n e ，c ) 及胸腺嘧啶 ( t h y m i n e ，d 四种碱基组成。 p d - 脱氧核糖 h 嘌呤 幽0曲阴 4 回三 1 嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶 图1 1 脱氧核糖、嘌呤碱和嘧啶喊的结构 2 第一绪论 1 2 2d n a 的结构 核酸是遗传物质的载体，d n a 和r n a 通过核酸序列编码遗传信息，从而砒 定了蛋白质的组成和牛命的方式。d n a 之所以含有牛物物种的所有遗传信息， 是因为其结构所蕴含的变化非常之惊人，每个人体细胞的d n a 约含有1 0 0 亿个 碱基。d n a 分f 的结构般可分三个层次来描述。d n a 的一级结构即d n a 的碱基序列，是由数量很大的四种脱氧核精核苷酸，通过咒5 i 磷酸二酯键彼此 相连形成的线形或环状大分子。基因的功能取决于d n a 的一级结构，d n a 携带 的遗传信息是依靠其级结构中碱基排列顺序的变化而实现的。f 面重点介绍 d n a 的二级和三级结构。 1 2 2 1d n a 双螺旋结构 图i - 2b - d n a 的双螺旋结构及碱基互补配对 d n a 二级结构的虽基本形式是双螺旋结构。1 9 5 3 年，w a s t o n 和c r i c k 根据 d n a 晶体的x 衍射图谱和分子模型，提出了著名的d n a 烈螺旋结构模型，即 标准b d n a 的二级结构( 图l - 2 ) 。其丰要结构特征为：( 1 ) 两条脱氧核苷酸链反 向平行排列，绕同一螺旋轴向右盘绕，螺旋表面存在着大沟和小沟；( 2 ) 双螺旋 d n a 的直径为2n m ，螺距为34n m ，碱基对排列在双螺旋的内删，碱基对平面 与螺旋轴早近似垂直磷酸基通过磷酸酯键与脱氧核糖于外侧链接，形成d n a 骨架，碱基对平面问距离为o3 4n m ；f 3 1 两条多核苷碱基之间遵从碱基互补原 蘧叶 譬，h 蠢。，ili、卜、 唧一鳝 2 0 1 0 月中“j 人半顺i 学位论z i 字* 则按a - t 、g c 碱基相配对而连接在一起，a 与t 形成2 个氢键，g 与c 形成3 个短键。这种巨补配对原则具有非常重要的作用：当。条多核苷酸链的碱基序列 被确定之后，即可推知另一条互补链的序列：另外，d n a 的复制、转录、翻译 和逆转录等都以碱基互补配对原则为基础进行是遗传信息传递的分子基础。 a f o r mb f o mz f o r m 图1 3 不同构型d n a 示意陶 d n a 双螺旋结构在生理条件下处于相对稳定的状奁。维持这种稳定的园索 包括：碱基堆积力，由芳香碱基上两个电子之间的相互作 l 力产牛，双螺旋结构 内部形成的疏水区消除了介质中水分子对碱基之问鲺键的影响，为 要作用力； 介质中的阳离r ( 如n a + 、k + 和m 9 2 + ) 中和了来自磷酸摹的负电荷，降低r d n a 链之间的排斥力；两条d n a 链问形成的氢键：范德华引力等等。由于d n a 分 子的柔性，d n a 双螺旋结构可以采取不同的构象，常地的d n a 二级结构有a 、 b 和z 型，如图1 3 。b 型结构是虽常j i l 的d n a 构象，大量研究工作表明溶液 中的d n a 都是采取b 构象。a 型结构【2 2 ”1 同样是右于螺旋，但在某些方l i i 与 b d n a 明显不同：在a d n a 中，每圈螺旋含有1 1 个碱摹对，螺距为02 2 5n m ， 在长度上b d n a 显得更短；与b 型d n a 相比，a d n a 糖的堆积与折叠方式发 牛丁较大变化，使得碱基被迫推向“小沟”使“小沟”变浅，而“大沟”被深深 地推向骨架内部，使其在溶液中难以接受其它小分子。z d n a 为左手蝶旋，较 b d n a 更纤细。z - d n a 的两条磷酸骨架比b d n a 靠得更近，碱基对位于取螺 旋的外侧，受保护程度小，可能会成为某些化学致癌物的进攻靶点。近年来的研 第一章绪论 究结果表明，z - d n a 在生物体内起着十分重要的作用”，但z - d n a 构象并不 是一类稳定的取螺旋结构。因此对b zd n a 构型转换的调控和稳定z - d n a 的 研究也越来越多地引起了科研工作者的关注仁“。 1 2 2 2 四螺旋d n a g 四链体d n a 是近年来研究得比较多的一种二级结构的d n a 。g 4 d n a 的 基本结构单位是0 - 四联体( 图1 _ 4a ) ，每一个o - 四联体中的四个乌嘌呤之间通 过h o o g 女e e n 方式形成氢键。四联体与四联体之间通过堆积作用相互结合 在一起。富含g 的序列所形成的四链，其不同的序列具有不同的拓扑结构和链 的取向。与d n a 双螺旋结构相比较，o - 四联体螺旋有两个显著的特点：( i ) 它 的稳定性取决于口袋内所结合的用离于种类，已知f 的结合使四联体螺旋最稳 定：( 2 ) 它的热力学和动力学性质都很稳定”。 舍有多个g 碱基重复单元的d n a 序列可通过单链、取链、四链形成三种不 同的四螺旋结构，如图i - 4b 所示，所以四螺旋d n a 的结构可以分为单体、二 聚体和四聚体三种9 5 3 6 1 。研究表明含有不同g 序列形成的四螺旋结构是不同的， 即使是相同的序列也可以按照不同的方式进行组装。g 4 - d n a 链的走向、相邻鸟 嘌呤碱基的取向以及环( 1 0 0 p ) 的结构会受到多种因素的影响，从而形成不同的 g 4 - d n a 构型。因此，虽然他们在氢键的形成方式上相同，但在光谱和生化特征 方面却存在较大差异。 口日 图l - 4g 四联体的结构及0 4d n a 的四螺旋结构 4 固：毋毋，孕 2 0t 0 届中山大学硕士学位论文 王宇传 人体端粒d n a 末端由5 - ( t t a o g o ) n - 3 重复单元组成，在生理条件下可通 过鸟嘎呤碱基问的h o o g s t e e n 氢键形成0 - 四链体。端粒对于染色体的稳定及基 因组的完整性具有重要的作用。正常细胞每复制一次缩短一个t t a g g g 片段， 缩短到5 - 7 个碱基时细胞便不再复制而死亡，这就决定了细胞的分裂次数和寿命。 端粒的长短在细胞癌变和衰老中非常重要，而端粒的长短可由端粒酶进行调节 3 7 3 。在肿瘤细胞中，端粒酶的活性台被激活，使得它可发挥合成端粒的功能，补 偿正常的端粒丢失，端粒将达不到临界长度，从而雏持肿瘤的继续分裂、增殖和 生存。因此这个细胞不能进入正常的老化和衰亡。获得一种永久性f l s j 。端粒酶与 肿瘤细胞的恶性转化、分裂、增殖密切相关，而稳定g - 四链体可以有效抑制端 粒酶的活性。因此，寻求能够诱导、稳定g 四链体结构的小分予化含物是当前 研发抗肿瘤药物重要途径之一，并取得了可喜的成果 3 9 4 ”。 1 2 2 3d n a 的三级结构 双螺旋d n a 进一步扭曲盘绕形成d n a 的三级结构，超螺旋是d n a 三级结 构的主要形式( 图i - 5 h 丈多数原核生物的d n a 都是共价闭环分子，这种双螺 旋环状分子再度螺旋化即成为超螺旋结构。当d n a 处于“松弛”状态时，取螺 旋的两条链通常会延着中问轴，以每1 0 4 个碱基对放置一圈的方式进行扭转。 当d n a 扭转方向与双股螺旋旋转方向一象时，称为正超螺旋。此时碱基将更紧 密地结合。反之若扭转方向与双股螺旋方向相反，皿为负超螺旋，碱基之问的结 合度会下降。所有的负超螺旋都是由d n a 拓扑异构酶产生的。而自然界中大多 数d n a ，会因为d n a 拓扑异构酶的作用，形成轻微的负超螺旋状态州。 图i - 5d n a 的松弛结构与正超螺旋结构 6 一#绪论 1 , 2 2 4d n a 结台 d n a 分子从松敞的无规则卷曲态到紧密包装、高度有序的高级紧缩态的构 馨转变称为d n a 缩合( d n ac o n d e n s a t i o n 囤1 6 ) 。在病毒和真核细胞的细胞 核l i j ，高度缩合且有序排列的d n a 保持了基因组的稳定性，使复制得以顺利完 成。早期人们根据圆二色谱的数据推测，缩合状态下的d n a 处于b - 构象，但近 年来越来越多的实验事实表明，d n a 缩合也会导致d n a 的二级结构扭曲。而 d n a 的缩合对其二级结构的改变还墩决于d n a 的碱基序列及其超螺旋结构h 蚓，所以d n a 三个层次的分子结构间存在着一定的相互关联。 + ：觜帅 口s m h ) 咻。6 “4 。“”寰警出踹器黜嚣器。帅。 图1 _ 6 d n a 缩合示意图 将外源基因转运至目标细胞是人类基因治疗需要解决的首要问题。由于缩合 后的d n a 具有良好的跨膜特性扁发了研究者将其用于基因治疗领域从而设 计合成出新颖高效的d n a 载体。由于病毒载体具有许多潜在的牛物免疫性反应 和致癌作用，人们逐渐把目光转移至非病毒基凼载体的研究。这类载体包括聚胺、 阳离子表面浠性剂、阳离子脂质体、壳聚糖以及金属化合物等h ”。刘长林等州 撮近提出r 含笨并昧唑的双核金属配合物诱导d n a 缩合的一种台理模型( 图 1 7 ) 。配合物通_ i = f 插入作用和静电作用与d n a 结合，这些与d n a 结合的配台物 分r 问的m 相瓯作用是d n a 缩合的丰要推动力；而配合物与d n a 的静电 f i 瓦作用也是d n a 缩合的一个前提条件，呈电中性的化合物则不能诱导d n a 缩 合。 2 0 1 0 届中山人学硕 ：学位论文干字传 i g - - zj n t e r a c t i o n o r q西 c o m p l e x e s 图1 7 双核金属配合物诱导d n a 缩合的模型 1 2 3 金属配合物与d n a 的作用模式 金属配合物与d n a 的结合按化学键来划分丰要有共价及非共价键结合两 种方式。其中共价结合是较强的作用方式，非共价结合包括静电作用，沟面结合 和插入作用。 1 2 3 1 共价结合 共价结合主要指金属离子与d n a 碱基中的亲和位置之间形成共价键。软金 属离子如p t ( i i ) ，p d ( i i ) ，r u ( i i ) ，r h ( i i i ) 等与碱基之间可以产生配位结合。最早 发现的具有抗癌活性的顺铂p t ( n h 3 ) 2 c 1 2 ( c i s p l a t i n ) 以及后来发展出的一系列铂 类配合物与d n a 的作用是通过鸟嘌呤的n 7 原子和铂原子间形成配位键进行结 合【剐( 图1 - 8 ) 。对于钌多吡啶类配合物，一般含有易离去基团( 如氯离子) 的钌 配合物与d n a 采取共价结合的方式。如r u ( p h e n ) 2 c h 、r u ( b p y ) 2 c h 及 r u ( t p y ) ( b p y ) c l 等化合物【5 5 5 7 1 与d n a 结合时，首先通过水解，使氯离子离去， 金属中心r u 剩下的配位位置则由碱基的氮原子占据。 彳 粼 第一章绪论 1 2 3 2 非共价结合 图1 - 8c 卸l a t i n 与d n a 的共价结合 小分子与d n a 非共价结合的模式主要有以下四种【”1 ： ( 1 ) 静电作用( e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n ) ：核酸是一种带负电荷的多聚阴离f ， 通常以钠盐的形式存在。金属离于及其配合物通常带有正电荷，它们能与核酸在 外层发牛静电作用这种静电结台力往往是非常弱的。 r u ( b p y ) 3 】2 + 与d n a 作用， 已被证实是静电作用【”i 。 ( 2 ) 沟面结台( g r o o v c b i n d i n g ) ：d n a 分子的大小沟区在氢键特征、电势能、 立体效应、水合作用上存在很大的不同。许多蛋白质与d n a 的特异性结合是通 过太沟区作用：一些小分子由于其自身独特的立方体构型，能够在小沟区通过氧 键或疏水作用与d n a 相结合( 图i - 9a ) 。许多多酰胺粪的小分子药物是以氢键等 作用方式结合祚d n a 的小沟处。从轮枝链霉菌( s t r e p t o m y c e sv e r t i c i l l u s ) 巾分离 得到的金属博来霉录是一种广泛使用的抗牛素，也是唯一一例与d n a 在小沟 处进行结合的天然产物1 6 + , 6 1 l 。过渡金埔多毗啶类配合物能与d n a 小沟处的碱摹 对边缘发牛直接的相互作用，通过疏水作用结合于d n a 的沟面。如配合物 c u ( d m p h + ( d r o p = 2 , 9 d i r e c t h y l - l ，1 0 p h e n a n t l u o l i n e ) 是通过两个d m p 配体依靠 疏水作用嵌入d n a 的小沟处1 6 2 6 3 ) 。许多小沟结合试剂在过氧化氢的存在下，也 2 0 1 0 辅中m 人 颐i 学位论空 j 宇传 会致使d n a 断裂【“i 。 ( j i _ m - t - r - 图1 - 9 金属配合物与d n a 的结合模式示意图：( a ) 沟面结合；( b ) 插入结合：( c ) 嵌入结合 ( 3 ) 插入结合( i m e r c a l a t i v ei n t e r a c t i o n ) ：插入作用是指含有平面芳香稠环的 配合物通过配体的半面芳香杂环捅入到d n a 碱基对之问，丰要依靠氢键、范德 华力和大环的哑堆积力而稳定( 图1 9b ) 。对于d n a 来说，配合物的插入会 使碱基对分开，螺旋解旋，导致螺旋扭转角减小。一些药物分子正是通过插入 d n a 使其构象发生改变造成d n a 不能复制，而显现出抗肿瘤、抗病毒活性的。 阜期发现的有机小分r 溴化乙锭具有平面芳环结构能以插入作坩与d n a 相结 合，是种强致癌物质【6 们。 ，_ l ”。吲黧r ， 口断_ 谰 r m n m r r3 * u m 目+ 图1 - 1 0 配合物a 一 p h ( p h e n ) 2 ( p h i ) ”和a - r u ( b p y h ( d p p z ) 2 + 的结构式 由于配合物具有有机小分子所不具备的庞大体积和特殊构型，插入时萱 ! 律比 有机小分子具有更好的d n a 序列选择性m “i 。八面体多吡啶类配合物是一类重 第一章绪论 要的d n a 插入试剂，由于其具有手性中心，还能对d n a 进行手性识别【6 9 ，7 0 1 。 其中p l l i ( 9 ，10 - p h e n a n t h r c n c q u i n o n ed i i m i n e ) 和d p p z ( d i p y r i d o 3 ，2 一a ：2 9 ，3 9 一c 】 p h e n a z i n e ) 是两类研究得比较广泛的插入配体( 图1 一1 0 ) 。配合物与d n a 的插入 结合也会引起配合物本身的物化性质产生一系列变化：如配合物的紫外可见吸 收光谱强度减弱，最大吸收峰值向长波方向移动，荧光强度增强等现象【7 1 们1 。 ( 4 ) 嵌入结合( i n s e r t i v ei n t e r a c t i o n ) ：嵌入结合( m s c r t i o n ) 是l c r m a n 在1 9 6 1 年提出的【5 引，虽然从字面上并不能和插入结合( i n t e r c a l a t i o n ) 很好地区分开来， 但嵌入结合是小分子与d n a 结合更紧密的一种模式，通常是小分子与含有碱基 缺陷的d n a 采取的结合模式( 图1 - 9c ) 。配合物从小沟处进攻含有缺陷的碱基 对，将原来的两个碱基挤到大沟处，插入配体自身的大平面就取代了原来的碱基 堆积，所以这种作用模式要求插入配体具有比较大的平面。b a r t o n 等在研究含有 碱基错配d n a 的过程中，发现了一系列金属r h 配合物与碱基错配d n a 采取此 种模式进行结合【7 4 1 。 1 3 金属配合物与d n a 相互作用的研究方法 金属配合物与d n a 的相互作用从两方面入手进行研究：一是d n a 的加入 对金属配合物的光、电、氧化还原等化学物理性质的影响；二是金属配合物对 d n a 的粘度、热变性、稳定性等物理、化学、生物属性方面的扰动或改变的影 响。物理、化学、生物实验技术，是从分子水平上研究金属配合物与d n a 相互 作用的有力工具。 1 3 1 光谱检测方法 阱s 吸收光谱：核酸分子由于其碱基具有共轭双键体系，在紫外区2 6 0 2 9 0 n m 有特征的吸收，因此我们可利用紫外一可见吸收光谱对上述核酸分子结构的形 成作初步判断。当过渡金属配合物与d n a 发生作用时，由于金属配合物所处的 环境发生变化，吸收光谱波长和吸收强度也相应地有一系列改变。当配合物插入 d n a 碱基对时，对应的吸收峰产生减色效应( h y p o c l l r o m i c i t y ) ，并伴有一定程度 的红移( r e ds h i f t ) ；当配合物与d n a 通过静电作用相结合时，其吸收光谱受d n a 2 0 1 0 届中山大学硕士学位论文 王宇传 的扰动较小，无明显的减色效应和红移现象r 7 5 】。 稳态和时间分辨荧光光谱：金属多吡啶配合物的m l c t 激发态在失活的过 程中，会发生辐射跃迁，产生荧光。当此类具有荧光的配合物以插入方式与d n a 作用后，因受到d n a 碱基疏水环境的保护，其发光强度一般会增强，因而可以 根据强度变化来判断配合物与d n a 键合的强弱。当配合物与d n a 键合的方式 不只一种时，可通过分解其时间分辨荧光光谱，得到不同的激发态寿命，进而推 断出配合物与d n a 可能的键合模式【7 6 1 。 圆二色谱：在圆形光中，光的电场矢量轨迹为螺旋线，该螺旋线的轴平行于 光束的传播方向，顺时针放置的电场矢量为右旋光，逆时针旋转为左旋光。以分 子或结晶结构中缺少对称性为特征的大多数透明物质具有旋转偏振辐射面的特 性，即旋光性。当一束偏振光通过具有旋光性的介质时，左旋和右旋圆振成分出 现相位差。圆二色谱通常用来检测旋光物质的存在，或者比较左、右旋物质含量 的不同。如通过已拆分的化合物异构体键合d n a 前后其c d 谱的变化，可获得 化合物与d n a 键合模式方面的一些信息【7 6 1 。 1 3 2 流体力学方法 粘度测定被认定是在缺少晶体数据的情况下，检测配合物与双螺旋d n a 是 否以插入模式进行结合的最有效的实验方法之一。应用流体力学技术可检测 d n a 双螺旋的长度变化：当小分子配合物以经典的插入方式与d n a 发生作用 时，d n a 相邻碱基对之间的距离会增大以容纳插入配体，导致d n a 双螺旋的伸 长，d n a 溶液粘度增加；当以静电、沟面结合等非插入模式与d n a 发生作用 时，d n a 溶液的粘度基本无变化；以部分或非经典插入模式与d n a 发生作用时， d n a 双螺旋则可能发生扭结或弯曲，d n a 溶液粘度减少。 1 3 3d n a 热变性技术 测定解链温度是考察核酸及核酸与其它物质相互作用的稳定性时广泛使用 的一种方法。d n a 双螺旋在受热的过程中会逐渐解旋，配合物与d n a 的作用模 式不同，d n a 熔点温度( ) 的变化程度就不同。一般死增加越多，配合物与 第一章绪论 d n a 的作用力越强；当配合物与d n a 以插入方式结合时，d n a 熔点的温度变 化最大。有文献报道，一般来说，升高7 以上，可认为是以插入的模式与 d n a 发生作用 n , t s l 。 1 3 4 凝胶电泳法 棱酸电泳通常在琼脂糖凝胶( 水平电泳) 和聚丙烯酰胺凝胶( 垂直电泳) 中进行，不同浓度的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可 用于分离不同分子量或相同分子量不同结构的核酸片段。核酸电泳技术操作简 便、快速，可分辩用其它常规方法无法分离的核酸片断，已经成为一种较常用的 手段，广泛用于配合物对d n a 的断裂能力研究。 质粒d n a 般有三种构型( 图1 1 1 ) ：第一种是闭环超螺旋型d n a ( f o r m i ) ， 结构比较紧密；第二种是开环缺刻型d n a ( f o r mi i ) ，此为超螺旋d n a 的一条链 上出现一个缺口时的构型，结构较松散；第三种是线形d n a ( f o r m i u ) ，当超螺 旋d n a 的两条链在同一部位被切断时，d n a 便不能成环，完全开放形成线状。 三种构型的d n a 分子量都相同，但是由于立体构型不同，决定了它们在琼脂糖 凝胶中的迁移率不同。超螺旋的f o r mi 构型由于结构贤密，通过凝胶向正极移 动，走在最前面，其次是线形结构f o r ml l i ，而缺刻型结构的f o r mi i 由于向正 极移动受到抑制走在最后面。纯度较高的质粒d n a 主要有两种成分：超螺旋型 f o n n i 和缺刻型f o r m i i ，其中以f o r m i 为主。 鸯o f l咖f o r m m 图卜1 1 质粒d n a 的三种构型 2 0 1 0 届中山大学硕士学位论文王宇传 1 3 5 核磁共振波谱法 随着人们对金属配合物与d n a 作用研究的不断深入，高磁场核磁共振 ( n m r ) 技术，特别是二维n m r 技术已应到用于配合物与寡核苷酸作用的机理 研究中。