（植物病理学专业论文）Pavon76抗叶锈性基因的鉴定.pdf

摘要 墨西哥品种p a v o n 7 6 具有良好的持久抗性，该品种在当地大面积种植至今保 持良好的抗叶锈性。我国从7 0 年代便开始利用p a v o n 7 6 做小麦育种亲本，培育了 一批优良的抗病小麦。目前只明确p a v o n 7 6 含有一占抗叶锈性基因，而对该品种 是否含有其它抗叶锈性基因尚不明确，因此明确p a v o n 7 6 所含抗叶锈性基因，为 了解该品种持久抗叶锈性、合理利用和推广种植提供科学依据。 本研究以p a v o n 7 6 为材料，研究了p a v o n 7 6 对小麦叶锈病的抗性特点，并进 行了抗病基因推导，分子辅助选择、抗叶锈病基因的a f l p 分析及系谱分析。 通过1 9 个菌系与4 6 个抗叶锈基因系和p a v o n 7 6 互作产生的苗期反应型及9 个菌系与8 个抗叶锈基因系和p a v o n 7 6 互作产生的成株期反应型，推导出p a v o n 7 6 中可能含有苗期抗叶锈性基因厶，、厶且厶，口、三r ，勿和未正式命名的上槽，并且 含有成株期抗叶锈性基因d 只厶j 彩、d 弧 选用b b d l 菌株对p a v o n 7 6 t h a t c h e r 的f 2 、f 3 代群体苗期和选用叻q s 菌株对 p a v o n 7 6 t h a t c h e r 的f 2 、f 3 代群体成株期分别进行抗性遗传分析，结果表明： p a v o n 7 6 至少含有两个苗期和两个成株期抗叶锈基因。 利用目前国内外及本实验获得的稳定的s t s 或s c a r 标记对p a v o n 7 6 进行分 子辅助选择鉴定结果表明，p a v o n 7 6 中含有d 口抗叶锈性基因，不含有耿厶9 、 三，以上，刀、上，弧厶j 7 抗叶锈性基因。 采用3 0 4 对a f l p 引物对p a v o n 7 6 、t h a t c h e r 及部分小麦近等基因系进行了分 析，经过初次筛选，选出1 7 对2 9 条特异性条带，是p a v o n 7 6 与t c l r b 、p a v o n 7 6 与t c l r l 、p a v o n 7 6 与t c l r l 3 、p a v o n 7 6 与t c l r l 4 a 共有的特带，未发现p a v o n 7 6 与t c l r l 4 b 、p a v o n 7 6 与t c l f 3 4 、p a v o n 7 6 与t c l r 3 的共有特异性条带。通过a f l p 分析得出p a v o n 7 6 中可能含有厶，、三檀、厶d 缸抗叶锈性基因。 系谱分析结果表明，p a v o n 7 6 中可能含有厶j 、打，口、厶且厶，锄、厶苏厶鲥 和d 筘抗叶锈性基因。 综合分析上述几种方法及前人已证明的p a v o n 7 6 含有三一日得出p a v o n 7 6 中 含有上，队上，文上r 彳占抗叶锈性基因；可能含有抗叶锈性基因三培；含有三r 厶上，勿 中的一个抗叶锈性基因。 关键词：p a v o n 7 6 ；小麦叶锈病；抗病基因：a f l p ：分子标记：基因推导：遗 传分析 i d e n t i f i c a t i o no fr e s i s t a n tg e n e st ow h e a tl e a fr u s ti np a v o n 7 6 a u t h o r ：h u a l i a n gl i “ s u p e r v i s o r s ：p r o f e s s o rd a q u nl i u p r o f e s s o rw e n x i a n gy 锄g m 萄o r ：m o l e a c u l a rp l a n tp a t h o l o 科 a b s t r a c t p a v o n 7 6p o s s e s s i n gp e m a i l e mr e s i s 锄c e ，i tt l a sk e p to ng o o dr e s i s t a n c et ow h e a t l e a fm s ts i l l c ei tw a sp l a n t e di 1 1m e x i c 0 p a v o n 7 6 、v a su s e da sp a r e n t st oc u m v 砒es o m e r e s i s t a n td i s e 船e sc m t i v a r si nc 1 1 i n as i n c e1 9 7 0 s p r e s e i m y ，i th a so n l yb e e nd e f m i t c d t l l a tp a v o n 7 6p o s s e s s e sw h e a tl e a fm s tr e s i s t a n c eg e n e ，4 6 h o w e v e r ，i ti sl l i l d e f i l l i t e d t 1 1 a tw h e t l l c ri tp o s s e s s e so t h e rw h e a tl e a fn l s tr e s i s 乜n c eg e n e s s oi ti si m p o r t 锄tf o rm e r e a s o n a b l eu s i n go fr e s i s t a n tc u l t i v a r st oh l o wa b o u tt h ec o n s t i t u t e so fr e s i s t 蛐tg e r 他s a n d2 e n e t i cc h a r a c t e r so f w h e a tc u l t i v a ra n dg e n n p l a s m t h eg e n e t i ca i 】m y s i so fr e s i s t a n c e ，g e n ep o 咖l a t i o i l m o l e c u l a ra s s i s t e ds e l e c t i o n ， p e d i 田e e 锄a l y s i sa r l da f l pa n a l y s i so fp a v o n 7 6t ow h e a tl e a fm s tw e r ec o n d u c t e di n t h i sp a p e l t h m u g hs e e d l i n gm f e c 廿o nt y p e sd e r i v e df 如mm ei n t e r t i o no f19t e s ts 讹so f p “c c j 以胁护f r 耙f 刀口a n d4 6i 地a r - i s o 鸳e i cl i i l e sw i mi m o w 三r 窖e n e sa n dp a v o n 7 6 ，也c g e n c s 三，工r 3 ，三r j d ，d j 4 口，a n d 岫k n o w ng e i l e s 帅f b rl e a f m s tr e s i s t 姐c ei ns e e d l i n g s t a g eo fp a v o n 7 6w e r ep o 咖l a t e d t h m u g ha d l d ti i l f b c t i o nt y p e sd e r i v e df 如mt h e i m e r a c t i o no f9t e s ts 仃a i n so f 尸l f c c 加蛔一谢c f 阳a n d8n e a r - i s o g e i l i cl 访e sw 曲k n o w 三r g e n e sa n dp a v o n 7 6 ，山eg e n e s 上，j 3 ，三，j 4 6 ，工，3 4 觚d 三r ”f o r l e a fn l s tr e s i s t a l l c ei 1 1 a d u l ts t a g eo f p a v o n 7 6 、e r ep o s t m a t e d t h cr e s u l t so fs e e d l i n gr e s i s t a n c eo ff 2 ，f 3g e n e m t i o n s 行o mp a v o n 7 6 ，r h a t c h e r 趾d d a r e n t st ob b d l8 仃a i no f 户“拥胁护打耙加dm d i c a t e s 血a tt h e r ew e r ea tl e 黯tt w ow h e a t l e a fm s tr c s i s t a n c eg e n e st o 尸“c c 加胁护埘c 加口i i ls e e d l i n gp l a n t s t h er e s u l t so fa d u l tr e s i s t a n c eo ff 2 ，f 32 e n e 阳t j o n sf b mp a v o n 7 6 厂1 1 1 1 a t c h e ra i l d p a r e n t st od d q ss t r a mo f p “c c 加缸f ，f f 把f mi n d i c a t e st h a tm e r e 、e r ea tl e a s tt w o 、h e a t l e a fr u s tr e s i s t a n c eg e n e st op “c c f f 口驴f f f c 加口i 1 1a d u l tp l 趾t s t 1 l r o u 曲s t a b l em o l e c u l a rm a r k e r s 上，9 ，工，j d ，工，9 ，三，2 d ，三，2 4 ，上，3 j 趾d 三，37 ，t h e r e s u l t so fm o l e c d a ra s s i s t e ds e l e c t i o ns h o w e d 血a tp a v o n 7 6p o s s e s s e s 三r 1 0 ，n o t r 9 ， 三r j 9 ，三，2 d ，上r 2 一，三一5a 1 1 d 三r 3 7w h e a tl e a f m s tr e s i s t a l l c e 窖e n e s 1 no r d e rt og e tr e l a t i v e l ys p e c i f i cb a n d sb e t 、v e e np a v o n 7 6a n d 上r j ，三心，上，j ， 三，j 钇，工r j 4 6 ，工，j 4a n d 工旭，3 0 4p a i r sp r i m e r ss c r e e n e df b ra f l pa 1 1 a l y s i s 1 7p a i r s o ft h e ma n l p l i f i e d2 9s p e c i f i cb a i l d sb e m e c np a v o n 7 6 趾dd j ，p a v o n 7 6a n d 上r j 3 ， p a v o n 7 6a i l d 厶，和，p a v o n 7 6a n d 上旭，w 1 1 i c hi n d i c 疵st l m tp a v o n 7 6p m b a b l y p o s s e s s e s ，j ，r ，3 ，r ，4 口，上旭，n o t 工，3 ，4 6 ，工r 3 4w h e a tl e a f l l l s tr e s i s t a n c eg e n e s t h r o u 曲p e d i g r c ea i l a l y s i s ，p a v o n 7 6p m b a b l yp o s s e s s e s r ，加，9 ，工，3 ，厶j 和， 三r 2 3 ，三，口4a n d 三，4 6 t os m u p ，p a v o n 7 6p o s s e s s e s 工r d ，d ，3a i l d r 4 6 ：p r o b a b l y 工帕：厶jo r r j 和 k e yw o r d s ：p a v o n 7 6 ；w h e a tl e a f m s t ；r c s i s t a l l tg e r l e ；a f l p ；m 0 1 e c u l a rm a r k e r ；g e n e p o s h l l a t i o n ；g e n e t i ca n a l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 疆究成祭。据我所知，除了文孛特别期以标注秘致谢的逡方终，论文孛不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些鸯些盘鳖或其他 教育机构魄学豫或证书惩使用道的材料。与我一同工佟的同志慰本磅究所傲的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：安堪华粱签字鼹期：基。占年f 月p 鲤 学位论文版权使耀授权书 本学位论文作者完全了解塑! 垦盛些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有鬏傺黎并惫国家骞关蘩门蕺毂 奄送交论文教复露 孛纛磁焱，完诲逡文技褒 阅和借阅。本人授权塑热盛些基鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据疼进嚣检索，可以采用影零、缩印或超接等复毒l 手段保存、汇编学蹙论文。 ( 保密的学位论文在解密胼适用本授权书) 学位论文作者懿名：坟f j 牮粱 签字日期：山。6 年多月口日 学位论文雩# 者擎鼗蜃去囱： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：，五q 叫、竹。 签字同期：址巧年，月，- ，臼 电话： 邮编： p “o 矬7 6 抗时锈链基因的臻定 荸l 言 由枣麦时锈蓝( 恁o 妇妇 ，良j o 瓣) l 起浆小麦( 打矗j e 8 8 矗时锈瘸在毽弄主 的分布广泛，在美洲主要以荑国南部、墨西哥、加拿大和南美洲备国发生较熏：程诬洲，除 中国外以巴基斯坦发生较重；柱欧洲以东欧和饿罗斯发生较重；在菲洲默埃及的予三是渊悲 区稍埃塞阿比亚发生较重。小麦叶锈辅在中国备地均有分布，过裘以西南她区发生较重，近 年来在华北地区也逐渐严重起来，成为生产上一个重要闯题”。合理有效地治理植物病害是 农熊生产可持续发震中必须解决静重簧网麓，德是由于卧锈菌毒性基因的辐度变舅性和抗锈 品种的不合理使用，导致传统抗病品种的抗病性丧失，加上化学药剂造成的病原物抗性问题 秘环保阚题，镬其盛蠲受到越寒越多熬疆裁。遮藏遥韬娶求珞育耪裁瑶其翁持久藏经静多蘩 品种、慢锈性品种“，改变目前抗锈基因的单一化局面，提高抗病基因和抗病类型的丰富度， 并奄理利用抗瘸箍种。培育稚利用抗瘸晶稚是瘸害综合黪渣中最经滂毒效姻方法；翱强小麦 品种及其遗传资源的抗病性研究，对手辅害持续控制、确保小麦安全生产禁关重要。 小麦抗叶锈性基因的分析方法很多，可以依据不同的研究目的和试验条件等来选择合避 魏方法。小麦抗时锈健遭传骈究方法妻簧毽话蒸嚣推导滚、遗传分析法、染色体定位、遗传 标记等方法。 1 1 基因推导法 自从f l o r 州提出熬因对基因学说詹，人们很快就把它应用到了抗病遗传研究中。尤其是 成襄小麦抗时锈癜近等基因系( n e 弼辨轻 c - 强然篱嚣n 淞) 或擎蒺鑫系( m 嘴n 至cl i 辩s 篱 称m l s ) 的培育成功为基因推导方法的出现奠定了基础。该方法于1 9 7 1 年由l o e g e r i n g 【7 哗 提出- b r o w d e r ( 1 9 7 2 ) ”1 提出了初步的抗病基因推导方法，应用1 3 个按叶锈近等基霖系在5 个羹要品种中推导出上r j 和上0 两个麓因。1 9 8 5 年，l o n g 和r m l p 等开始用n i l s 作鉴别 寄生进行小种鉴定。l o e g e r i n g 等利用该方法对6 9 个品种的抗病基因进行了推导并攒出结果 对蠢静有焉。 9 8 9 年d 潮h 警在薪久工作基鹚主，通道静充和巍善，提出了根据寄主和病 原物相互作用产生的离低反应型格局和系谱分析相结合进行抗病基因推导的六条原则。在我 国躲万投”。”j 等久选耀不疑毒蠖基因缎会鳆时锈蓬系缝合k & s 壤鬻努辑了寒蠡毽赛 7 个莺 家的7 6 个小麦种质资源材料和我国4 0 个小麦品种所携带的抗叶锈病基因状况。王燮荣1 ”、 杨文香”“、原宗英【l 簿也应用基因推导方法对黄淮地区、湃l 省撼区、出裁省缝区的葶孛撞小 麦龋释进行了抗时锈罄困推导，为品种的合理布局奠定了基础。 i ，2 遗传分析法 蘧传分耩法即穰搬m e n 如i m o 唱a 1 1 遗传学的琢理分拼小麦品种的抗性基因。具体方法是 澍北农业大学硕士学能论文 将抗源与感病材料杂交，通过测定f l 代的袭型、f2 代群体的分离比例、f3 或b c f l 、b c f ：家系及& 、如的分离比例来搀数捷性基因的曼隐挺、基爨数疆帮芟作方式。霞嫂分褫法 矮有一定的局限散，要经过三个世代的研究，试验周期较长，当涉及抗性基因数目较多时， 分析起来比较困难，不能把抗性基因定位在染色体上。但是，应用常规遗传分析法一次可以 分析多个品静。耩戳酱前常用于重簧的抗源藏新导 抗性基因鼎种的基因分析。o e k e “等a 用b c f l 、b c f2 缩合亲本对春小麦品种a l s e n 和n o r h l 进行了抗叶锈基因遗传鉴定，初步确 定了镬遮两辛菇静表嚣持久捷洼静蠢效抗时锈基蠢。在我国巍渭常撬杂交法对予小麦品种抗 条锈基因的遗传分析研究的较多，如对品种贸农2 2 旧、大籽糙| 1 8 1 、小麦京核8 9 1 。1 i ”、新品 壤y w 2 4 3 等的秘究，应躅戴方法黠子晶转撬时锈篓因兹研究在我国遴未觅摄遴； l + 3 染色体定位 就是剃用非整供体技术，将小麦的抗病基因定位予染色体上的一弹细腿遗俦学方法。逡今 为止，篼丈多数甚定名的小麦抗叶锈基因都悬利用此方法进行染色体或染色体臀定位的。萁 中1 0 个熬因被定位于a 染色体组，2 1 个位于b 染色体组，2 1 个位于d 染色体组。根据所 借魏煞耱辩不同分为单体分析、缺体分轿、端体分蓉亍等一系列方法。 1 3 单体分析法 是指利用某一单体系统将待测品种的抗性基因定位于特定染色体上。具体方法是以2 l 巾单嚣为蹲本与被溅熬魏瘸l l 鑫静杂交，霜黠挽病品静炎毒性戆瘸磊蓥攀稳藩系接种签定杂 交组合的杂种f l 单体植株和来自f l 单体植株的f 2 代家系，根据其抗性分离表现确定抗性蔟 阂所在蛉染色体。攀俸分辑法震要岱助于缨激学鼹察梭测出整簇攀髂系捌终为母零，捡溅爨 f i 代单体植株进行自交，工作量较太，而且鬻经过两个世代，簿次只能研究一个材料。但该 方法能对抗性基因作较全磷的研究势将其定彼在染色体上，便于基因的统一编号期命名，辩 爨导育种工作极为商乖j 。陈刀权口l 等引用中国眷全套单体系弼和抗婶锈病小麦近等基因系( 娥 婊基因系) 为材料，采用单体遗传分析和基因推导相结合的方法，对冬小嶷品种北京8 3 7 抗叶 锈病基嚣逑好染色体定链磷究。 1 3 。2 缺体分析法 2 即用缺体系统确定抗性藻因所在染色体。具体方法是以整套缺体系列为母本，以待测占矗 耪为父本杂交，让箕f ，单传攘拣垂交，鼹褰t 我静摅控分离，鼓确定挽瘫基霪掰在匏祭氇 体。与单体分析法相比，缺体分析不需染色体观察筛选单体，减少了许多工作量，缺体的筛 选也很直观，因为您缺少了一对染色体，在袭避上与二倍体有明显的差异。照是，缺体撞株 生活力极弱，常常毵亡t 弼靓许多缺体结实率极低，罐戡形成稳定的自交系，给成用带来困 难。此外，用缺体分析隐性撼因时，有时很难测出关键染色体。所以有关单独应_ l 缺体分析 貔掇遂缀少。毽透凡年痘裂缺俸结合s s r 等势子方法避行染色体定位应蠲的较为背遍。薛秀 ：警：! 篓兰篓堡鉴雪整鉴塞 一一一一 摩渊等粥黼勃小燮稳定爨交结实铰侮藏统获麦8 9 3 撬祭锈摹因避 亍竣 搴分辜舞礤炎。 3 3 壤搭分耩法 罄煲辫端蒋誊| 辩萼箨嚣禄蒺鞠定掇亵染色傣静禁一簿瓣方法。箕骰法楚：虢双浚椿藏强为鸯 零岛待溺麓耱象交声篷fl 代，褥羯镣_ l 黉| | 燕耱溅交，然嚣驻器形二髂鞠难卷二髂麓缫臌举标记， 对溅交爱代遴行缨熬学箍宠，谯避嚣绷鼹槐熬豹褒鳖魄馕，褥蒺霸定缀纛荣谯髂蘩一是。它不 仅霹萼孥撬毪蒸嚣宠露亵袋恕体蒋上，嚣艇j 荟可毅掇攥黧缌裘墼穗瑷夔 铡，诗舞溅谖嫠戮露 蓉熊赢戆辐黠燕褒。大多数穗定名豹抗痍基因酆已逶_ 避壤体分毒簟悫傻崧潦魏镭蘩上。 l 。哇遗健标记 霹慕一蒺因进行标记蠢多辨方法，惫旗形态稼憾( m o 喇嘛l 嚼c a lm 8 缘# 螃、纲藏轹记 科辩l o 醉氇l 辩a 砖玲、艇纯拣识b i o e m 垂c 蕺| 珏嬲玲露分予糠 云f 摧持l e 嘲甜揩8 癔e 螃。瓣耱麓予枣 澎靖锈摭瞧蒸困豁诡静方法祷形态搽键、生铯标记和分予标记。 形态繇键静巅鹅德秘象挺孛戆， 帮特毪舔悫蒸嚣豹器在。谈方法簿攀纛鼹，稼影态躲诞 徒缝专嵌：特魏苓强，耱受邵壤条撵瓣影璃。在小麦撬蜂锈瞧蒸鞠熬定串，滚穗霹攀l 掰蕊形态 拣键擐少。秘慕发袋强骞如静往氇砖小麦时嚣灸罄瓣鲻鼹基戮涟镶，德程爱至l 步 癸生黪奄嚣 黛糖豹影穗瓣，葵豁惩蒸毽瓣裘这菸受彩确。 缨臆搽铤主蔡燕激彀体援型染魏髂数蠢、大小、隧体、饕熊赢辔爨等 秘辩鍪l ( c 鬻、n 謦、g 豢簿) ，这炎糠记瓣袋杰莛数鞭蠢鼹。 袅纯标键主溪德旗翳王酶秘稿藏灏鑫静椽记。该方法经济方便，镶拣诞瓣数瓣蠢隈。 锈n l e ”l 等髑蠲鸯寅扫z 9 豹夺麦拣孵锈瘗避镶蘩因臻袋究，发壤生豫舔记鬻王辩嚣器l d 瓣笼效等像熬嚣嚣p - 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1 9 蝼密连锁，重组僮为o o l + o 0 0 9 作圈单位，逡一结果鸯助子抗瘸基因r 弦的莛凝快速检测。 斯卡切曼( s c h h e m y f ，1 9 9 5 ) 等用1 1 5 个砌1 l p 搽针和3 6 0 个r a p d 引物对米自长穗冰 草的抗叶锈病基因加毋近等基因系进行分子标记和连锁分析，发现6 个r f l p 标记在近等繁 戳系之溺表现密多态槛，1 1 个r a 固弓l 耪在抗病檀株中扩增出特异性瑚q a 片段。遥过r 群 体的连锁分析表明，所有6 个r f l p 探针和1 1 个凡p d 标记与加尉紧镦连锁。除此之外， 一些学者芬舞震了抗瘀基因妇j 、扫! 反西舅释西露妻孽分子标记工蚱，均壤褥了较好浆避震。 应用这些技术已对和正在对小麦抗叶锈基因上r “”3 、r “、d ”“。“1 ，z r j ”7 - 删，打，“、 三r l 妒“”1 、三，删“，矗舅”“，三r 别”1 ，扫删、口岔“、三，”1 、鼢彰”j 、r 对1 、 r 谚“、n j 产“”，d 谢7 1 ，三r 拶4 7 “、跏7 “、五r ”、加材7 、二，括7 “、上r 豁“7 9 7 ”、 上r g ，、r 、上r 尉”1 和r 以。”等抗叶锈基因进行橱记。这些标记的获褥为分予标记辘助 选择罐供了可行蛙，笼其是依据r p ”、融p d 、a f l p 等标记转化丽来的p c r 标记如s t s ( s e q u e n c et a g g e ds i l e ) 、s c a r ( s e q u e n c ec h 甜a c t e r i z e da m p l 城e dr e g i o n s ) 、c a p s ( c l e a v e d 4 p a v o n 7 6 抗时镄性熬齿的躲定 a m p i i a e dp o l y m o r p h i cs o q u e n c e ) 标记特异性强且为共显性，为实现对基因型的直接选择提供 了可黥。刘志勇等8 ”利用p c r 方法对抗时锈基因扫9 和如0 9 进行了分子标记的诊断，证明了 p c r 标记猩小麦抗痫基因的标记辅助选择和基因累加中有很好的潜力。魏新燕”用三，j 互的 s l s 及s e a r 标记餮定了1 3 5 个农家品种。l u k a s z 芬埔6 个s i 、s 标记貉定了正在欧潮种横 韵s 3 个晶释。分子标记辅勘选择的优越佼是鋈定简便，准确，无需考虑伟物艇长阁期，尤箕 对予基因熬累搬具考重簧作翅。 s 下s 、s c a r 、s s 寝技术是鸯方倭搜耀、不接触散射蛙浆质、挟遮露麓攫量不受攀繁影嫡 等的优点，为快速检测和利用分子标记辅助选择投术，选育抗病品种创造了条件。对乎利用 分子标记辅助选择援术，加快推广品辫的抗癌性改照，及摭瘸基因的克隆均具骞重要驰意义。 a f l p 扩增片段长魔多态性标记( a m p l i f i e d 疗a g m e n tl e n 珂hp o l y m o r p h i s m 。简称a f l p 标 记) 魑出z a b e a u 等”8 发明的一项专铡技术，基本原理燕将基困缎d 】性缀限制性内切酶( 邋 常一个含6 碱蒸识别位点，如船d r j 或肌n 或龇i ，另一个含4 碱旗识勇位点，如胁“城e i ) 双酶糍形或零鬻分子爨的疆概陵露l 片段，褥将特定酌接头连接在这艘片莰静两端，形蓐炱一个 带接头瓣特异片段，箱接头| 物滋李亍托r 扩增，护灌产物缀聚嚣烯酰胺凝腔魄泳籍就可鏊怒 限制性片断长发的多杰性( 见图1 ) 。a f l p 的关键是a f l p ；l 物的设计。a f pg 黪毽摆3 个部分期引物援心序列、限制辩识别廖副秘0 3 个选择蛙扩增廖列，摇岛鼢龌f 酶相对应的a f l p 引物为：5 - g a c l i g c o t ac c a a l l l c b i n n 一3 ，墩最3 个n 碱基即为选择 性扩增碱基，遴常在预扩增时不搬或只选用1 个，以富集戳铡性扩壤片段，鼠不弼凰馒素标 记。第二次扩增反应时，a f l p 引物通常选用含3 个选择性扩增碱基，需用间位素标记。这样， 不翔的d n a 模扳之溺静差弄哥在稻同的隧锎谴内仞酶黪切鞫随后的a f l p ； 物作用下所扩增 形成静a 跣p 豳谱上褥到反映。a 轧p 标记实际是r f l p 和p c r 相结合的一种产物，所需d n a 量少，不震s o u 搬e m 杂交，势且枣象s s 瓢i s s r 那样嚣簧羧先鲡道瓣煞基溺静亭歹蓿患，实 验缕豢稳定霹靠，重囊熬强，受典溅戆嚣德尔遗镥，每个a f t 器爱瘫霹潋检测豹谴熹雾这5 0 1 0 0 个，多态性很强，非常适念遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位、快速构建遗传嬲谱等 研究。如在r f l p 多态瞧银差的大麦中迸费a f l p 分辑，只用1 6 个g 物就定位了1 1 8 个位点 ”。2 0 世纪9 0 年代中期，该技术应用于小麦基因的标记。在小麦叶锈基因标记中，l o t t e r r i n g 羽a 瓯p 技术对小麦抗时锈基戮n 露”遂行标记。2 0 0 1 年p “n s 等阕a f l p 技术将d 矽”成功 标记，并将之转讫为s 髑标记。同窜，w m i 蝴簿用a f l p 技术获得了1 个胁“的 p - a a g ，m - c 弛标记；“端g 簿残功遮掭记7 互瞧尸1 。榜文香等豁记了知彰、西? 五鑫嚣 国遗， 学者夔褒铡用a f 己p 技术栋记打秘、d ? 始、点r 巧，扫糟等摭瘸基西。簿蓠，聚鬻应蔫 于小麦的分子橼记主浆霄r f l p 、r a p d 、a f l p 、s s r 、l s s r 、聪a 等”4 “，具体特点见黔 表舭 我阐拥有丰富的抗小麦叶锈瘸资源，阎时引进了许多谢价值的资源，膝产墨鹾毋的一些 品种，在我萄谣南和牮南冬麦区、北部舂舞区也有定的适废性，兮另4 推广了一定的聪糨； 5 翌i ! 查兰盔警鐾圭兰簦丝兰一 5 一g a a l 叮c 1 1 a a 一3 3 e r 妫a p a 埘p 一5 ( 酶切) a 椰c 一 十妇d r i 、 蠡b 1 a a l t 四卜州1 1 氇r _ 1 t 1 蛐 g n _ 州a 斌l 一 j r 一 鬏扩增) 互袋l 捌m 酗a 、矗岳潞 - p 一摧臻睁e 57 a a c a 删a - 峭下口 一r 酗 g 卜r c 解 上圳一 一 _ ( 选扩增) + 嫩i - p r i m e r s + 3 、胁口i p r j m 叶3 a r r c a a p 1 r g r r a 一厂一一口 变佳聚秀烯酰按凝艘电泳 c = 胁# ，接头】攒序 一点幻r ，接头版彦 露1a f l p 标记技术的原蠼示意图 f i glas i m p l i 矗e ds c h 啪时i cr c p r c s e n 诅t i o n0 f a f l pm a r k e rt e c h n 岫e 潮俸杂交亲本也取褥了初步成粟”。冀中p 8 啪n 7 6 在篓褥哥种撩2 0 多年”，抗性仍然表现很 好，我国从7 0 年代便开始利用p a v o n 7 6 做亲本，培育拭病小麦，但对于该品种含有的抗小麦 拜 锈基因港不鹱确。嚣藏，魉强小麦磊秘及冀蘧传资潦撬牲研究，对予该病害豹持久控裁、 确保小麦的安全生产，避免含有单一抗源品种的大面积推广至芙重要。馏此，准确了解小麦 晶静的抗瘸基因对于小麦哮镌痍的有教茨渗十分必要。 国际玉米小麦改良中心( c i 埘y t ) 田问试骏表明摄西哥品种p a v o n 7 6 对叶锈病有持久 抗性，自该品种在墨蹰哥大联积种植膳，从1 9 7 8 年以来爨嚣哥尚求出现小麦时锈瘸的大滚杼。 a p 。r o e l f s 蹲士在明尼苏达大学、r a m c i n t o s h 在澳大利程c a s t l eh i l i 的锈病实验室对 c l m m y t 商代品系进行分析的结果表明，c i m m y t 品蓉具有工r 朋复合体”1 。由c i m m y tj 鼹 避蒸爱难导褥遗p g n 7 8 可糍含有妇l 、矗j 反三r 帮及束知馒锈基因。1 9 9 8 年s i n g h ”等鳎 p a v o n 7 6 和两个感痫晶种j u p a t e c 0 7 3 s 殿a v o c e t s 杂交，并对其n 和f s 代避 行分析，得知该晶 静含毒d 4 6 抗b 。锈慕匿。在拣性基霹熬染色体定位璎究孛，媚擎体分据法将西锘定链手l 器 上。s i n g h 等在同一研究中，发现p a v o n 7 6 还存在另外一个慢锈性基因，假未能将之定位于染 6 搂胁酊接= 一甲 蔷1 c 一 p a v 。n 7 6 抗时锈往蕊崮的骚定 色体上。该撼圜与甜甜熟同存在增加了品釉的抗瘸性，同时肛硝基因与其它抗性基因的组合 应用媳可以提离品种的抗锈性。2 0 0 3 每出河j 农业大学静扬文鸯教授“7 通过基因捺导得出 p a v o n 7 6 中可能含有加，、d 执打限n 如、厶? 么三r 了，、上，舐 本研究的秘的越要进一步明确p a v o n 7 6 所禽抗时锈蛀基因的数翻和种类。 7 型i i 奎些盔登避：! ：兰燕篓苎一一一 2 试验材料与方法 2 1 试验材料 镤试懿夺麦韪辩p “赫7 6 为霆黼蠢米夺麦改受中心滚育鹣、器廷器捺广品种，其系港鲡 罄1 8 。p 粥孵6 履b 蝴疑r 熬、找及秘蘸c h e r 感瘸对照和餐试静4 8 个抗时锈辅小麦单基因 系撩别寄主由美国明尼苏达拳蛰类锈瘸研究室秘中国农业科学赡攘物镙护职究掰掩供、浮j b 农她大学繁宵收存。试验辨用鲢具鸯璧翅鉴别力豹王擘个藏拣秘暴露成拣抗瘫性蕤剖力熬9 个 菌株具有不同毒性基闲组仑，由河北农业大学免疫室提供，主饕从采岛金圈不同小麦区的标 样分离筛选礴来。致瘸类型按l o n g 等”的小麦叶锈蘸密码命名系统命名( 见附表b ) 。 2 2 主要佼器及供试试搠 2 。2 纹爨 t - 舭d i e n tt h e 姗觚c y c l e rp c r 扩增仪( b i o 叶n e t r a ) 、垂誊板电泳檬( 4 e 京嚣意机电) 、 w 5 0 黧电膝三懒多忍电泳仪( 北京露意机电) 、w h 一8 6 l 旋满演食器( 太谯市科教器械厂) 、 u v l p r o 綮外凝胶成像仪、b e c k m a nc s 1 5 r 高速冷冻离心机、e p p e n d o r f c e l m i f i 喧e5 4 1 5 d 商速 台式离心橇、隶浴锅、掰y l l i3 l 獾琮耱糖水平电泳稽、摇霖、b t 争2 0 。m 型凝腔成像仪、 ，l 、登囊空泵警。 2 。2 ，2 试翻 c 嚣转、n 8 e l 、r n 豁ea 、翱渊a 聚合酶、蜊、s s r 警 携、d d 2 0 、d l 2 0 m 越妇扎 黼3 0 0 0m a 癔# 、p 8 r 3 2 2 黯蠡蹦艇a 噍嚣、璩嚣藉、聚嚣烯醚胺、零踅等垂幽两金霸鸯物种攮有 限公司、上海生工生物工程和大连宝生物公司生产或合成。 尿素、冰乙酸、磷酸镶、3 7 甲醭、玉水碳酸铺、硫代藏酸镳、蘸傍、舞度静、不簿、攀 雠胺、过硫酸氨、滇酚蓝、二甲苯氰氟、溴化乙锭、b 巯熬乙醇、吐温一8 0 购自保定市化学 试裁科学仅器经营鄢。 2 。3 方法 2 3 1 蕾期抗病i f 生鉴定 将成套秘鉴裂赘主羁待测晶拳申 冀及辩照品种分剩编码登记，按颁净将乏播种予 2 5 c m 4 0 c m 的铁盘中，共计5 0 个材料，每个糖料援5 粒，接攫1 9 套。特跨一心瓣，每套 材料分别用翅有不赋毒性基因缀合瓣时锈菠鬈鼷擞羚法接转，在澄疫旁2 4 s ) ，光照 6 0 0 0 1 0 0 0 0 l u x 的温室中培养，1 2 1 4 d 后鉴定。 g 竺2 2 ：! 垫生堡丝茎望些鳖塞 2 3 2 成株期抗病性鉴定 采用盆栽法测试小麦品种p a v o n 7 6 ，标准品种为厶j 幺加j 文厶j 叠6 、打翻b 、r 肋、r 删、 加3 文r j ，以t h a t c h e r 为对照，每套1 0 个材料，共9 套。小麦生长至旗叶时，用撒粉法接种， 保湿2 4 h 后，在温室内培养，4 d 后开始观察病程，1 4 d 后记载侵染型。 2 3 3 侵染型的记载方法 按六级标准o 、；、1 、2 、3 、4 记载反应型，用c 和n 分别代表侵染型比正常侵染型褪 绿和正常坏死严重，“+ ”表示夏孢子堆比相应正常侵染型稍大、“一”表示夏孢子堆比正常 稍小。见附表c 。 2 3 4 抗病基因的推导方法 根据基因对基因理论和寄主一病原物互作关系，推导未知基因品种( 系) 可能含有的抗 性基因。具体方法如下： 1 如果待测品种( 系) 与已知基因的近等基因系对供试叶锈菌表现相同模式的高侵染型和低 侵染型，那么，可以认为待测品种( 系) 含有与已知近等基因系相同的抗性基因。 2 如果待测品种对某个菌系表现高侵染型，而某个近等基因系表现为低侵染型，可推断待测 品种( 系) 不含有该近等基因系含有的抗性基因。 3 如果待测品种( 系) 与某种近等基因系对同一菌系表现出不同的低侵染型，则它们含有的 抗性基因可能不同，但要根据环境条件和遗传背景进行综合分析。第一，如果待测品种( 系) 对某个菌系产生的低侵染型相对地高于近等基因系的低侵染型，则该待测品种( 系) 不含有 与近等基因系相同的抗性基因。第二，若该待测品种比近等基因系表现相对低的侵染型，则 它除可能含有与该近等基因系相同的抗性基因外，还可能含有另外对该基因有上位性的抗性 基因，也可能待测品种含有与近等基因系根本不同的抗性基因。 4 ，如果某已知基因系在适宜的环境条件下，对无毒力菌系产生特定的低侵染型，而待测品种 同样表现这种特定低侵染型时，可以认为它具有上述近等基因系所含有的抗性基因。 5 测试品种( 系) 含有的抗性基因也可以从某亲本系谱分析加以证实，如具有l b 1 r ( 或 1 b l l r s ) 血缘的亲本常常携带埘抗性基因。 6 测试品种( 系) 有叶尖坏死反应的，则它含有船4 抗性基因。 2 3 5p a v o n 7 6 苗期抗叶锈病遗传分析 将供试的p a v o n 7 6 t h a t c h e r 的f l 、f 2 、r 代群体，亲本p a v o n 7 6 、t h a t c h e r 种子经催芽 处理后，分别播种于2 5 4 0 c m 的铁盘中，其中f l 代3 5 0 粒，n 代8 0 0 粒，f 。代4 5 0 粒，p a v o n 7 6 2 0 0 粒，t h a t c h e r2 0 0 粒。待小麦生长至一叶一心时，用撒粉法进行接菌，选用的菌梓为b b d l 。 黑暗保湿， 1 8 2