（植物学专业论文）辣椒应答uvb的转录组差异分析及相关功能基因的分离.pdf

福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 辣椒是我国重要的蔬菜以及工业加工原料作物，近年来发展辣椒生产已经成为我国各 地农业增效和农民增收的一条有效的途径，但在栽培过程中，各种生物与非生物产生的逆 境胁迫，对辣椒的产量与品质造成严重的影响，研究表明，u v - b ( u l t r a v i o l e t b ) 一方面可导 致植物伤害，另一方面也可像虫害、病害等一样诱导植物产生各类防御反应。虽然u v - b 对植物的伤害机制已有不少的研究报道，但人们对u v o b 诱导产生植物防御反应分子机制 的了解还相当有限本研究使用e d n a a f l p ( c d n a - a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g h p o l y m o r p h i s m ) 技术获得辣椒在u v - b 胁迫下的表达谱，从中分析、寻找与植物防御反应密切 相关的差异表达基因，并通过实时荧光定量p c r 对表达发生改变的t d f s ( t r a n s c r i p t d e r i v e df r a g m e n t s ) 相应基因的e d n a 进行分离、测序验证，主要结果如下： 1 、采用e d n a a f l p 技术，得到辣椒响应u v - b 胁迫早期差异表达的转录图谱，从中 发现了2 0 8 条有差异表达t d f s ，统计结果并将这些t d f s 的功能进行分类发现，上调表达 t d f s 有1 3 8 条，下调表达t d f s 有7 0 条；信号传导相关蛋白为1 0 ，防御反应相关蛋白 为2 2 ，光合作用相关蛋白为2 0 ，蛋白质代谢相关蛋白为5 ，碳水化合物代谢相关蛋 白为2 ，活性氧相关蛋白为1 ，其他及未知功能蛋白分别为1 1 和2 9 2 、采用s m a r t t me d n a 文库构建试剂盒，构建了辣椒响应u v - b 胁迫e d n a 文库， 其滴度达到了l 1 0 6p f u m l ，重组率达到9 9 以上 3 、采用基于p c r 技术的9 6 孔板e d n a 文库筛选法，利用测序得来的基因片段设计 引物，筛选e d n a 文库获得了两个应答u v - b 的亲环蛋白( e u 4 0 1 7 2 3 ) 和叶绿素a b 结合 蛋白( e u 4 0 1 7 2 4 ) 的全长e d n a 。 4 、应用荧光定量p c r 对亲环蛋白( e u 4 0 1 7 2 3 ) 和叶绿素a b 结合蛋白( e u 4 0 1 7 2 4 ) 基因的e d n a a f l p 结果进行了验证，并研究了它们在u v - b 、辣椒疫霉、j a ( j a s m o n a t ea c i d ) 、 s a ( s a l i e y l i ea c i d ) ，j a + s a ，n a c i 、4 c r 5 孟和机械损伤等逆境或外源激素作用下的表达， 定量的结果表明：a u v - b 处理下，两个基因的表达强弱及变化趋势基本上与e d n a a f l p 结果相一致，从而也验证了e d n a a f l p 结果的可靠性。b u v - b 处理下的辣椒亲环蛋白基 因表达量较对照基因相比呈总体下降的趋势；在n a c i 和机械损伤的诱导下，该基因的表 达量明显上升，表明该基因在应答盐胁迫和疫霉胁迫中，很可能参与了相关的防御反应。 c 叶绿素a b 结合蛋白基因在u v - b 处理的荧光定量p c r 分析中显示，在u v - b 处理的1 0 m i n i 福建农林大学20 0 8 届硕士学位论文 内其表达量有所上升，随着处理时间的延长，该基因的表达量较对照基因相比有所下降； 停掉u v - b 处理后的2 h 内，该基因的表达量明显上升，且随着处理时间的延长其表达量又 与对照基因的表达量持平。说明该基因很可能参与了应答u v - b 胁迫的防御反应与修复的 分子机制中。在疫霉，j a ，j a + s a 处理的1 2 h 时，该基因的表达量明显下降，其表达受 到明显抑制。 关键词：u v - b ；转录组；c d n a a f l p ；实时荧光定量p c r 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a b s t r a c t p e p p e r ( c a p s i c u ma n n u u m ) i sa l li m p o r t a n tv e g e t a b l ea n di n d u s t r i a lm a t e r i a lc r o p p e p p e r p r o d u c t i o nh a sb e e nr e c e n t l ya ne f f e c t i v ew a yf o rt h ea g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o na r o u n do u r c o u n t r y i nt h ec o u r s eo fc u l t u r e ，h o w e v e r , s e v e r a lb i o t i ca n da b i o t i cs t r e s s e sh a v en e g a t i v e i n f l u e n c eo np r o d u c t i o na n dq u a l i t yo f p e p p e r a st h ep r e v i o u sr e s e a r c hs h o w n ，o nt h eo n eh a n d p l a n t sm a yb eh a r m e db yu v - b ，o nt h eo t h e rh a n d ，p l a n t sw i l lb ei n d u c e dt op r o d u c es e v e r a l d e f e n s er e s p o n s e sa st h ei n s e c t sa n dd i s e a s e sd o s of a ri ti sn o tc o m p l e t e l yb eu n d e r s t a n d e d a b o u tt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fp l a n td e f e n s i v er e s p o n s e ，a l t h o u g ht h e r eh a sb e e nl o t so f r e s e a r c h e sa n dr e p o r t sa b o u tt h eh a r m f u lm e c h a n i s mo fu v - bt op l a n t s i nt h i sr e s e a r c h ，w ea r e b a s e do nu n d e r s t a n d i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fp e p p e rr e s p o n s et ou v - bs t r e s s ，a c q u i r i n g a n da n a l y z i n gi t st r a n s c r i p t o m eb ye d n a a f l pt e c h n i q u e ，f i n d i n gt h ed i f f e r e n t i a lg e n e st h a t r e s p o n s et ou v - ba n dp r o v i n gi tb yu s i n gr e a lt i m ep c r t h em a i nr e s u l ti sf o r m u l a t e di nt h e f o l l o w i n gp o i n t s ： 1 ，b yu s i n gt h ec d n a - a f l pt e c h n i q u e ，w eg o tt h et r a n s c r i p t i o nm a p p i n go fp e p p e r r e s p o n s et ou v - ba n df o u n d2 0 8d i f f e r e n t i a lt r a n s c r i p t d e r i v e df r a g m e n t s f r o mt h es t a t i s t i c a l r e s u l ta n dt h ef u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i o n ，i tc a nb ef o u n dt h a tt h e r ew e r e13 8u p - r e g u l a t e dt d f s a n d7 0d o w n r e g u l a t e dt d f s ，a n di n c l u d e d10 f o rs i g n a lt r a n s f e r m a t i o nr e l a t e dp r o t e i n ，2 2 f o rd e f e n s er e s p o n s er e l a t e dp r o t e i n ，2 0 f o rp h o t o s y n t h e s i sr e l a t e dp r o t e i n ，5 f o rp r o t e i n m e t a b o l i s mr e l a t e dp r o t e i n ，2 f o rc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s mr e l a t e dp r o t e i n , 1 f o ra c t i v e o x y g e nm e t a b o l i s mr e l a t e dp r o t e i n ，11 a n d2 9 f o ro t h e rf u n c t i o n a lp r o t e i n sa n du n k n o w n p r o t e i n s 2 ，w i t ht h et o t a lr n a ，ac d n al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e dw i t hs m a r t t me d n al i b r a r yk i t t i t e ro ft h ee d n al i b r a r yw a sm o r et h a nlxl0 6p f u m la n dt h er e c o m b i n a t i n gr a t eo ft h ee d n a l i b r a r yw a sa b o u t9 9 3 ，b yt h ep c rb a s e d9 6 一h o l es c r e e n i n gm e t h o d ，t h ec d n al i b r a r yw a ss c r e e n e dw i t h d e s i g n e dp r i m e r sf r o mt h es e q u e n c i n gf r a g m e n t sa n dt w og e n e sw h i c hm i g h ta r ec l o s e l yr e l a t e d w i t ht h eu v - bs t r e s sw e r e a c q u i r e d t h eg e n e sw e r e ：c h l o r o p h y l la bb i n d i n gp r o t e i n ( e u 4 0 17 2 4 ) a n dc y c l o p h i l i n l i k e ( e u 4 017 2 3 ) i i i 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 4 ，t h ee x p r e s s i o no ft w oc a n d i d a t eg e n e sw a sd e t e c t e da n da n a l y z e du n d e rt h es t r e s s e so f u v - b 、p h y t o p h t h o r ac a p s i c i ，j a ，s a ，j a + s a ，n a c l ，4 c ，m e c h a n i c a l d a m a g ea n ds oo nb y u s i n gr e a lt i m ep c r t h er e s u l tw a sd e m o n s t r a t e dt h a t ：a t h ec o n s e q u e n c e so ft h ee x p r e s s i o n a n dc h a n g e sf r o mt h et w og e n e si np e p p e ru n d e ru v - br a d i a t i o nw e r et o t a l l yi na c c o r dw i t ht h e c d n a a f l p , w h i c ha l s ov e r i f i e dt h er e l i a b i l i t yf r o mt h ec o n s e q u e n c eo fc d n a a f l p b t h e g e n ew h i c h e n c o d e dc y c l o p h i l i n - l i k ep r o t e i ni np e p p e ru n d e ru v - bw a se x p r e s s e dl e s st h a nt h e o n ef r o mc o n t r a lp e p p e rt o t a l l y , h o w e v e r ，o b v i o u s l ym o r et h a nt h a tu n d e rt h et r e a t m e n to fn a c l a n dm e c h a n i c a ld a m a g e ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ec y c l o p h i l i n l i k ep r o t e i nc o u l dr e s p o n s et ot h e s t r e s so fs a l t ya n dp h y t o p h t h o r ab l i g h ta n db ei n v o l v e di nr e l a t e dd e f e n s i v er e s p o n s e t h er e s u l t o fr e a lt i m ep c rw a sd i s p l a y e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fc h l o r o p h y l la bb i n d i n gp r o t e i nw a s a s c e n d i n gw h e nt r e a t e di n t h e10m i n u t e sa n dw a sg r a d u a l l yd e s c e n d i n gi nc o m p a r et ot h e c o n t r a lo n ea st h ep r o l o n g e dt i m e b u ti tw a ss r o n g l ye x p r e s s e dw h e nt h eu v - bw a sr e m o v e d a f t e r2h o u r s ，a n dr e t u m e dt ot h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h ec o n t r a lg e n ea st h ef o l l o w i n gt i m e ， w h i c hs u g g e s t e di tm a yb ei n v o l v e di nt h em o l e c u l a rm e c h a n i c mo ft h ed e f e n s ea n dr e p a i ru n d e r u v - bs t r e s s o b v i o u s l y , t h eg e n e ，w h i c he n c o d e dc h l o r o p h y l la bb i n d i n gp r o t e i n ，w a si n h i b i t e d d u et ot h ed i s t i n c td e s c e n d i n ge x p r e s s i o nu n d e rt h et r e a t m e n to fp h y t o p h t h o r ab l i g h t ，j aa n dt h e c o m b i n a t i o no fj aa n ds a k e yw o r d s ：u v - b ( u l t r a v i o l e t b ) ，t r a n s c r i p t o m e ，c d n a a f l p ( e d n a - a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g hp o l y m o r p h i s m ) ，r e a l t i m ep c r 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究 成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外， 论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在 论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应 有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 徐一良 日期： 矽够，多 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学校有权送 交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： ：；鑫耀巳 日期：矽p 9 6 1 6 指导教师亲笔签名：彳m 日期：月背石。t f - 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第一章文献综述 1u v b 及其与植物之间相互关系的研究现状 1 1 地表紫外辐射的变化 随着现代工业的发展以及人类活动的干扰，环境恶化日益严重，其中人类活动产生的 氯氟烃( c f c ) 类和其他化学物质对臭氧层的破坏尤为突出。随着臭氧层变薄，到达地球 表面的u v - b 辐射显著增强【l 】许多研究表明，平流层臭氧的损耗，导致了近地表面太阳 辐射光谱中u v - b 辐射强度的增加【2 4 1 。按照现在的氯氟烃( c f c ) 逐步禁止计划，最近的预 测表明全球紫外线辐射水平将在近几年内达到峰值，说明平流层氯含量出现峰值与相应的 臭氧耗损是相互关联的，并可望在以后的几十年中逐步恢复到臭氧耗损之前的水平【2 5 ，6 1 。 地面紫外线能量占太阳总辐射的3 5 。紫外线的波长范围为2 0 0 4 0 0 m n ，根据其生物效应 又可分为短波紫外线( t r v ：- c ，2 0 0 2 8 0 n m ) ，中波紫外线( u v - b ，2 8 0 3 2 0 n m ) 和长波紫外线 ( u v a ，3 2 0 4 0 0 n m ) 臭氧能大量吸收太阳辐射中的紫外部分，其对紫外辐射的吸收量随波 长的减少而迅速增加，波长小于2 8 0 n m 的紫外辐射( u v - c ) ，由于大气臭氧层的保护作用而 被屏蔽，而臭氧u v a 的吸收很少，紫外线波段中受臭氧减少影响最大的是u v - b 波段。 虽然u v - b 辐射只占太阳总辐射中很小的一部分，但由于其能量高，对生物有巨大的潜在 伤害作用，即使极少量的增强也可能会对生物造成显著的损伤【7 】因此研究u v - b 辐射对 生物的影响以及制定有效的防护对策，己成为世界各国面临的一项重大课题。2 0 世纪7 0 年代以来，国外在u v - b 辐射影响植物生理、生化和生长发育等方面的研究比较活跃，已 取得了一定的研究成果；我国在这方面的研究工作刚刚起步，有关报道较少。下面就近年来 国内外关于u v - b 辐射增强对植物生长、生理生化及分子机制等方面的研究现状做一评述。 1 2u v - b 辐射对植物外部和内部的影响 吴鲁阳研究表明葡萄幼苗生长在u v - b 辐射条件下，其生长受到抑制，叶面积变小、 植株矮化等，且其抑制程度与辐射量的累积成正比，田继远研究也表明u v - b 辐射对藻的 生长以及光合速率有抑制作用，并且时间越长，抑制作用越明显【8 1 ，张娜研究表明u v - b 辐 射对窄叶野豌豆的形态建成，生物量积累和繁殖有负作用 9 j 0 1 u v - b 辐射增强明显抑制了 水稻，小麦的生长，延长其生育期，降低其生物产量和经济产量，并影响籽粒的品质等【1 l - 1 4 1 。 福建衣林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 b a r n e s 等人的研究表明，在u v - b 辐射增强的胁迫下，小麦、野燕麦的株高、冠幅受到明 显抑制f ”】。水稻上的实验也表明：在增强的紫外照射下，处理植株的高度较对照植株下降 了2 2 8 【1 6 】。在u v o b 辐射下，部分欧洲的8 个玉米品种也表现出株高降低的现剽1 7 , 1 8 】。 z h e n g 等发现增强的u v - b 辐射对植物株高的影响随着生长阶段的不同而改变，随着植物 的生长，u v - b 辐射对几种作物株高的影响逐渐减弱【1 9 1 。 u v - b 辐射在短期内对银杏的光合作用有促进作用，但随着u v - b 辐射时间的延长， u v - b 辐射表现出对银杏光合作用的抑制，其主要表现为光合色素( 0 0 括c h l a 、c h l b 及c a r ) 含量下降等【2 0 1 。u v - b 辐射的增加对仙客来叶片光合色素的含量也具有影响【2 1 1 。牛传坡研 究也表明u v - b 增强能显著减少小麦叶片中叶绿素a 含量【2 2 1 。另外，u v - b 暴露时间的延 长可使藻类，小麦等的可溶性糖含量降低【1 0 , 2 2 】。s t r i d 等指出，暴露于增强的u v - b 辐射下 的豌豆幼苗的p s i i 活力、a t p 合成酶及r u b i s c i o 含量急1 t , j 下- 降【2 3 1 。刘清华等研究表明， u v - b 辐射增强下银杏叶内活性氧产生量增加并逐渐积累，对其细胞膜系统造成伤害，出 现膜脂过氧化【2 4 】。仙客来叶片质膜透性随u v - b 辐射强度的增加而增加【2 1 1 。 u v - b 辐射会对遗传物质和基因表达产生影响，遗传物质d n a 对u v - b 辐射非常敏感， 对u v - b 的吸收会引起光致转换，生成环丁烷嘧啶二聚体( c p d s ) 2 5 , 2 6 。由于d n a 和r n a 聚合酶无法识别这些光生产物，因此清除这些光生产物对d n a 的复制及转录以至对于整 株植物的存活都非常重要【2 7 1 李韶山等研究了水稻在u v - b 胁迫下环丁烷嘧啶二聚体的累 积与生物量的抑制呈显著正相关【2 8 1 ，q u a i t e 等研究了u v - b 辐射下大豆叶片内环丁烷嘧啶二 聚体的产生与修复，认为高剂量的u v - b 能诱导高的二聚体率【2 6 】。d n a 中二聚体的比例越 高修复就越困难，叶绿体自身d n a 的转录与复制也会由于d n a 二聚体的形成而受阻或降 低【2 9 1 。吴颖等研究了6 个拟南芥株系的查耳酮合成酶( c h s ) 基因转录对u v - b 照射的响应。 结果表明15 p m o l m 2 s u v - b 照射2 h ，c h s 基因转录产物明显增加【3 0 1 ，j o r d a n 等报道了生长在 不同辐射条件下叶绿体基因的表达，发现u v - b 辐射会降低r n a 活力和光合作用中几个关 键酶的活性，认为在叶绿体内编码的p s b a 基因的转录比在核内编码的p s b a 基因的转录有 更强的耐u v - b 辐射的能2 d i , 3 2 】。方兴等研究认为短期内一定程度增强u v - b 辐射可以加 强诸葛菜叶片p o d 和c y t 同工酶的基因表达【3 3 1 。s t r i d 报道认为u v - b 能诱导谷肤甘肤还 原酶基因及苯基苯乙烯酮合成酶基因的表达，而使s o d 基因的表达活性降低【3 4 】。 1 3 植物对u v - b 辐射的敏感性及其响应机制 不同的物种或同一物种不同阶段等对u v - b 辐射的敏感性是不同的，即使是同一物种 2 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 的不同栽培品种间或是不同的基因型之间也有很大的差异 3 5 - 4 1 j 。王传海等研究比较了大田 群体条件下，小麦不同生育期对u v - b 增加反应敏感性的差异表明：小麦不同生育期对u v - b 增加反应的敏感性存在显著的差异【3 5 1 。王悠等在实验室条件下研究了u v - b 辐射对7 种海 洋微藻生长的影响。结果表明7 种海洋微藻对u v - b 辐射的敏感性也存在一定的差异【4 2 】。 c a l d w e l l 等定义u v - b 辐射引起的植物生长、形态或产量的相对改变为植物对u v - b 辐射 的敏感性【3 7 1 。植物对u v - b 辐射的敏感性不同而分为敏感型，中度敏感型和耐受型三类【1 9 1 。 植物茎叶表面蜡质的改变和某些叶面结构特征的变化可以减缓u v - b 辐射对植物组织的穿 透。上表皮蜡质层是植物响应环境胁迫的一个重要的表面特征【4 3 ：4 1 。d a y 等发现叶片表面 反射了大约1 0 投射到表面的u v - b 辐射。与对照相比，增强u v - b 使棉花上表皮的蜡质 含量提高2 0 0 ，且使同等叶面积的大麦、蚕豆的蜡质分别提高2 3 ，2 8 【4 5 4 引。在u v - b 处理下，随着u v - b 强度的提高，曼陀罗属植物单位叶面积重量不断而增加，这在一定程 度上增加了叶表皮与叶肉细胞之间的距离，减少了对d n a 的损伤【4 9 】。 植物对u v - b 辐射的另一种适应机制是增加代谢物质紫外吸收复合物的量。u v - b 辐射 可以诱导植物叶片中如黄酮类化合物的增加，减少了紫外线对叶肉内部器官的损伤，是植 物抵御紫外线的重要屏障【5 0 - 5 3 1 。田向军等研究了u v - b 辐射对灌浆期小麦叶片中黄酮类化 合物含量日变化的影响，发现，u v - b 胁迫条件下，黄酮类化合物含量含量明显上升，无紫 外线照射线，其含量下降，合成黄酮类化合物的关键性酶苯丙氨酸解氨酶活性的变化也表 现出大致相同的趋势【5 4 1 另外冯虎元等对1 0 个品种的大豆研究也表明：增强的u v - b 辐 射使所有品种大豆的类黄酮类化合物含量增加【5 5 】此外，植物对于u v - b 辐射引起的d n a 损伤可以通过一系列的修复过程得到缓解【5 6 1 。p a n g 和h a y s 报道了多种植物存在光修复， 如最早在高等植物拟南芥中证实存在c p d 光复活酶活性【5 7 】。除了可以直接修复u v - b 辐射 所引起的损伤外，植物还可通过u v - b 诱导抗性基因的表达以增强抗性【5 8 5 9 1 。如在多种植 物中证实苯基苯乙烯酮合成酶( c h s ) 基因的表达受u v - b 诱导【6 0 , 6 1 1 。s a f r a n y 等通过基因敲 除技术研究发现u v - b 辐射作用诱导了拟南芥中a n a c l 3 基因的表达f 6 2 】。w a n g 等研究发 现在u v - b 辐射诱导w r k y 8 9 基因表达强烈，并认为w r k y 8 9 基因在生物及非生物胁迫中 起到非常重要的作用 6 3 1 血红素加氧酶可以保护哺乳动物避免氧化的胁迫，但研究发现大 豆中的血红素加氧酶的含量在u v - b 胁迫下也大量增加，表明大豆中的血红素加氧酶可能 参与了应答u v - b 的某种修复和保护机制 6 4 】m a e d a 等研究了u v - b 等胁迫诱导了胡萝卜 中d c p a l l 基因的表达，并发现了d c m y b l 是d c p a l l 基因的主要调控因子，而d c m y b l 因子调控着植物组织器官发育过程中次生代谢的基因表达，如类黄酮类物质生物合成途径 福建农林大学2 0 0 8 届硕士字位论文 中一些酶的表达等，这对植物防御u v - b 胁迫至关重要【6 5 1 。 虽然前对u v - b 辐射处理引起植物细胞损伤、代谢途径和信号转导途径改变等的报道 很多，但用分子生物学手段来研究u v - b 辐射下植物某些基因的表达情况以及某些基因在 细胞中的相关功能的报道还处在形成阶段。因此，本文拟通过分子生物学的手段来揭示 u v - b 作用下植物内在的分子机制，并希望能为这一研究阶段的进一步成熟提供参考。 2e d n a a f l p 在植物研究中的应用 e d n a a f l p 是b a c h e m 等于1 9 9 6 年于a f l p 基础上发明出的用于r n a 指纹分析的 方法【矧。以其重复性好，可靠性高，所需设备简单，且较基因表达序列分析和微阵列可更 广泛应用于生物体基因表达特性的研究，而被广泛应用于包括植物在内的各类生物的基因 表达的研究q b 6 7 , 6 8 1 。其原理是对双链e d n a 用限制性内切酶消化后，扩增，消减，富集， 然后电泳分析样品中的基因表达情况【6 9 1 。 范敏等利用e d n a a f l p 技术从抗旱马铃薯中分离得到了s o f t s h 基因，并论证了该基 因在马铃薯抗旱中起作用【7 们。r i t t e r 等将e d n a a f l p 技术应用到马铃薯的连锁图谱研究 中【7 1 1 。危文亮等采用e d n a a f l p 技术研究了甘蓝型油菜的基因差异表达谱，回收、克隆 了可能与花药育性相关的差异条带，并获得了4 1 条阳性差异条带( t d f s ) 【7 2 1 李浩等对2 种不同品质的小麦的灌浆期以高温胁迫处理，通过e d n a a f l p 分析分别获得了2 2 个来自 与小麦的热激蛋白等同源的热诱导表达基因，以及2 5 个来自与乙烯合成酶、等同源的热 抑制表达基因 7 3 】。祝传书等应用e d n a a f l p 方法研究了蚜虫诱导的两个不同抗性水平的 小麦品种的基因差异表达情况，分离了1 0 个与十八烷酸途径和病菌相关蛋白的基因 7 4 1 。 张伟峰，张强，黄鹂，向殉等应用e d n a a f l p 技术分别从白菜中筛选获得了与晚抽薹性相 关的3 个特异片段；与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶相关的1 个基因；与花蕾发育相 关的差异表达基因；在早、中、晚花蕾中均稳定表达的基因b c b h l h o g u ，在早、中期花蕾 提早表达的m y b 家族推定基因b c m y b o g u l 7 5 。7 9 1 。魏源文等利用c d n a a f l p 技术分析研究 了乙烯利处理的甘蔗生长前期的基因表达差异情况，获得了与抗病、抗逆等相关基因有较 高同源性的部分差异片断【8 0 1 余梅等利用e d n a a f l p 技术对茶树花蕾发育期的基因表达 进行了分析，发现了3 5 条和8 7 条特异条带分别在茶树早期发育花蕾和晚期发育花蕾中表 达【8 。孙涌栋等以黄瓜叶片为研究材料，建立了a f l p 分析体系，为进行黄瓜的遗传多样 性分析、遗传图谱构建等研究奠定了g 蛐t s 2 , 8 3 1 。杨寅桂等采用e d n a a f l p 技术研究了黄 4 福建衣林大学2 0 0 8 届硕士学位论丈 瓜耐热性的分子机理，分离到与转录修复偶联因子同源的特异片段c h r r l 8 2 8 4 1 。李驰等利用 e d n a a f l p 技术分析研究了老化棉花种子的基因差异表达【8 5 。马小定等应用c d n a a f l p 得到了与棉花双隐性核雄性不育两用系的不育株和可育株花粉发育相关的1 7 个差异表达 片段，这些片断可能与信号转导，转录等过程相关【8 6 】。张富铁等采用c d n a a f l p 技术研 究了探讨了水稻对虫害褐飞虱和白背飞虱反应的分子机制，分离获得了4 4 个与已知或假 定功能基因有同源性的差异片断【8 7 】。 综上所述，e d n a a f l p 作为一种分子生物学技术方法，在植物响应生物与非生物胁迫 的分子生物学领域得到了广泛的应用，但在辣椒中鲜有使用，尤其是关于辣椒与u v - b 互 作的分子机制的应用中几乎未见报道。由此可见e d n a a f l p 技术已经成为差异表达基因 的研究的重要工具，并逐渐显示出它在基因功能的全面分析上的巨大应用价值。 e d n a a f l p 必将在后基因组时代发挥更大的作用，成为促进生命科学发展的新动力。 3 本研究的目的及意义 辣椒是我国重要的蔬菜以及工业加工原料作物，我国干制辣椒年产量高达2 8 0 0 多万 吨，约占世界总产的4 6 ，近年来发展辣椒生产已经成为我国各地农业增效和农民增收的 一条有效的途径然而，辣椒生产中频繁地受到u v - b 以及病害等多种非生物或生物逆境 胁迫，导致产量降低、品质下降、由于抗逆的高投入而导致生产成本的上升、或由于频繁 地应用农药导致环境污染。培育和推广应用高度抗逆的品种是实现辣椒生产从“高投入、高 产出”向“低投入、高产出、高效益”的可持续发展的生产模式转变的根本技术对策，现在一 般认为，在抗逆分子机制研究的基础上的基因工程是培育抗病品种的重要途径。 因此，本研究拟通过c d n a - a f l p 技术及9 6 孔板e d n a 文库筛选技术等分子生物学的 手段来研究并揭示u v - b 诱导下启动辣椒防御反应的重要相关基因，并分析鉴定这些重要基 因的功能，为响应u v - b 诱导的植物内部防御反应等的分子机制以及作物提高u v 毋抗性、 农产品的改良提供依据。 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第二章辣椒响应u v b 胁迫的c d n a a f l p 分析 本章利用e d n a a f l p 差异显示技术，用u v o b 对福建省辣椒品种l ll 在8 1 0 叶期进 行胁迫诱导处理，得到辣椒响应u v - b 胁迫环境5 个样本的转录图谱，针对转录图谱所展 示出的差异表达t d f 进行测序与分析研究，为进一步进行辣椒抗逆分子生物学与育种学研 究奠定基础。 1 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 供试材料 辣椒栽培品种l 1 1 ，为福建省地方辣椒品种，由福建农林大学生命科学学院植物生物 技术实验室提供。 1 1 2 主要试剂与仪器设备( 见附录) 1 2 实验方法 1 2 1 供试植株的培育 辣椒种子经表面消毒( 1 n a c l 0 2 ，l h ) 于2 5 c 下浸种2 4 h ，播种于灭菌土壤的盆钵中， 置于2 5 * 0 ，1 6 hf 巳8 h 暗的生长室中生长，待辣椒植株长到8 1 0 叶期取样用于诱导处理。 1 2 2 诱导供试植株 紫外灯垂直于植株上方2 0 c m 处( 紫外强度约为1 0 w i n - 2 ) 进行照射处理，样品处理时间 为：紫外灯照射2 h 停掉后的2 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 和4 8 h 。 1 2 3 辣椒总r n a 的提取 1 ) 取约o 2 9 叶片，液氮冷冻条件下将植物叶捣碎成粉末，移入1 5m l 离心管中。待液氮 自然挥发后，加入lm lr d ( t c p + 苯酚) 液，立即用移液器抽打5 次以悬浮样品。盖上盖 子，高速振荡2 m i n 。 2 ) 室温静置5 m i n 后，加入2 0 0 “l 氯仿。用力颠倒离心管以混匀后，室温静置使之分层。 6 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 离心5 m i n 。 3 ) 小心移取水相至1 5m l 离心管中。加入一半体积的7 5 乙醇，彻底混匀后，全部移入 吸附柱，离心3 0 s 。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。 4 ) 加入5 0 0p l r p 液，离心3 0 s 。弃收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。 5 ) 加入5 0 0p lw 3 液，静置l m i n 后，离心1 5 s 。 6 ) 将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入5 0 0 肚w 3 液，离心1 5 s 。 7 ) 倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一个收集管中。离心l m i n 。 8 ) 将吸附柱放入另外一个干净的1 5m l 离心管中在吸附膜中央加入5 0 “l 纯水，室温 静置l m i n 后，离心l m i n 。将1 5m l 离心管( 总m , j a ) 贮存于一8 0 c 1 2 4 总r n a 质量的检测 。， 1 ) 琼脂糖凝胶电泳：取5 皿总r n a ，与l o a d i n gb u f f e r 混匀后上样于1 的琼脂糖凝胶中， 电泳2 0 m i n 。 2 ) o d 值的测定：取1 1 t l 总r n a ，加入9 9 i - t l r n a s e f r e ew a t e r 中，用核酸测定仪测定其浓 度( 1 0 d 2 6 0 = 4 0 u g l a l ) 计算它们的比值，分析r n a 浓度。 总r n a ( 1 x g ) 一( a 2 6 0 n m x 4 0 x 1 0 0 1 1 0 0 0 ) 总r n a 溶液体积( p l ) 1 2 5m r n a 的反转录 用s m a r t t me d n a l i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t 的试剂与方法： 1 ) 反应体系：( 混合后轻微混匀) 总r n a 1 1 t l s m a r t i vo l i g o n u c l e o t i d e 0 5 i t l c d si i i 3 p c rp r i m e r0 5j _ t l d e p cw a t e r 0 5 1 j l t o t a l 2 5 1 a l 2 ) 将上述2 5 p t l 溶液加入用d e p c 处理过的0 5 m l 离心管中 3 ) 混合溶液，轻轻地摇动离心管，于7 2 ( 2 静置2 m i n 。 7 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 4 ) 在冰上冷却2 m i n 。 5 ) 用掌式离心机离心使样品全部处于管底。 6 ) 再往离心管中加入以下试剂使得总反应体系达到5 p , l 。 5xf i r s t s t r a n db u 仃e r d t t ( 2 0 m m ) d n t p m i x ( 1 0 m m ) p o w e r s c r i p tr e v e r s et r a n s c r i p t a s e i i i l o 5 p l 0 5 “l 0 5 p l t b t a l 2 5 1 t l 7 ) 轻轻地击打离心管，使其混匀，再用离心机微离使样品全部处于管底。 8 ) 在p c r 仪中( 空气浴) ，4 2 ，l h 。 9 ) 将离心管放于冰上以终止m r n a 的反转录反应。( 将反转录产物放在2 0 。c 下可保存3 个月) 1 2 6 双链合成反应 上述反转录产物为单链e d n a ，要将其合成为双链e d n a ，以备后续实验所需，其反 应体系为( 混合后轻微混匀) ： f i r s t s t r a n dc d n a 1 0 x a d a n t a g e2p c rb u f f e r 5 0 x d n t pm i x 5 p c rp r i m e r c d s i 3 p c rp r i m e r 5 0 x a d a n t a g e2p o l y m e r a s em i x d e i o n i z e dh 2 0 1 5 “l 5 p l 1 f t l l “l 1 “l 1 l x l 3 9 5 1 x l t b t a i 8 5 0 1 x l 福建农林大学2 0 0 8 届硕士学位论文 p c r 循环条件如下： 7 2 9 5 9 5 6 8 4 1 0 m i n 2 r a i n 3 5 s 卜 6 m i n j 保存 1 循环 1 循环 1 8 循环 对上述p c r 产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照并分析。 1 2 7 双酶切反应 实验室采用酶切组合a p o i m s e i 进行双酶切 1 ) 先用m s e i 进行酶切，