（分析化学专业论文）二维色谱质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用.pdf

二维色谱质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用 摘要 在蛋白质组学研究中，目前采用的技术主要有二维凝胶电泳( 2 d p a g e ) 一 质诺( m s ) 方法和多维色谱( l c ) 一质谱方法。随着全自动割胶、酶解、点样 仪的出现，2 d - p a g e 技术自动化程度相对提高，整个分析时间也有所缩短，但 是对于等电点极端的蛋白或膜蛋白仍无法达到很好的分离效果。近几年对该方法 进行了些改进，如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分离、分步提取以及对凝 胶的染色过程进行优化，但均未有实质性的进展。发展高通量分析技术平台是蛋 白质组学研究的需要和方向，强阳离子交换( s c x ) 色谱一反相( r p ) 色谱一 质谱( m s ) 技术是其中引人注目的技术平台之一。本论文以二维色谱质谱技术 为基础，优化蛋白的提取、酶解、前处理以及后继的二维分离条件和步骤，以求 在本实验室建立一个适用于复杂蛋白质混合物分离分析的高通量平台。 本论文的工作主要是围绕二维一色谱质谱技术来展开的。考虑到酶解步骤在 s h o t g u i i 技术中的重要性，首先利用标准蛋白来考察各种蛋白变性方法对酶活性 以及蛋白去折叠的影响，同时也讨论了蛋白还原烷基化的必要性和有效性。并且 考察了新型去垢剂a l s 在蛋白酶解中的应用，与s d s 相比，它具有很好的溶解 能力，对酶活性的影响远比s d s 小，它在酸性条件下可以自动降解，降解物质 不会影响后继的色谱分离，可以替代s d s 来溶解膜蛋白。根据溶液酶解的特点， 结合现有的顺序提取蛋白的方法，对用二维色谱质谱系统分离鉴定的蛋白提取 方法作了如下改进：将提取步骤分为三步，第一步用水提取偏亲水性蛋白，第二 步用含尿素和硫脲的溶液提取亲水性、中性和偏疏水性蛋白，第三步用去垢剂 a l s 代替s d s 溶解剩余的不溶物质。 第二部分主要是二维色谱一质谱系统的建立及应用。首先对强阳离子交换色 谱的实验条件进行优化，比较了流动相的p h 值、有机溶剂的含量等因素对色谱 分离的影响。根据优化实验条件的结果，以实验室现有的仪器装置为基础，建立 了离线二维系统和在线二维系统。通过肌红蛋白的酶解肽段的分离鉴定，对离线 二维系统中的反相上样时的传输溶液、组分收集时间以及在线系统中的进样盐浓 度等一些参数进行了讨论。并且比较了在线和离线系统，离线系统灵活性比较强， 可以分别优化每一维的实验条件，上样量不受第二维反相色谱的制约，能够富集 低丰度肽段：在线系统整合性比较强，适合于少量样品的分离鉴定，而且对控制 s c x 柱的色谱仪损害比较小。最后，利用离线二维系统分离d 2 0 裸鼠肝肿瘤组 织的水溶性蛋白，鉴定得到1 0 1 个蛋白组分，在大分子范围( 相对分子量 2 0 0 ，0 0 0 d a ) 及碱性范围( p i 1 0 ) 内均有蛋白被检出，蛋白数量也明显多于用2 d p a g e m s 技术鉴定出来的蛋白个数。另外，利用去垢剂a l s 溶解红细胞膜蛋白， 用在线二维系统分离鉴定出大量的膜蛋白，弥补了常规的二维凝胶一质谱技术对 膜蛋白的歧视效应， 关键词：蛋白质组学、多维色谱质谱技术、蛋白酶解、蛋白提取、强阳离子交 换色谱、离线二维系统、在线二维系统 t h e s t u d y o f2 d - - l c - - m sa n di t s a p p l i c a t i o n s t o p r o t e o m i c s a b s t r a c t i n p r o t e o m i cr e s e a r c h ，p r o t e i n s a r e t y p i c a l l ys e p a r a t e db y t w o d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i s ( 2 d p a g e ) ，t h e nd i g e s t e d a n di d e n t i f i e d b ym a s s s p e c t r o m e t r y ( m s ) 、h o w e v e r , t h et e c h n i q u ec a n n o tb ea p p l i e dt ot h o s eo f p r o t e i n s w i t he x t r e m e p la n dy i e l d sp o o rr e s u l t se s p e c i a l l yf o rm e m b r a n ep r o t e i n s i na d d i t i o n ， i ti sv e r yt i m ec o n s u m i n ga n dd i f f i c u l tt oh ec o m p l e t e l ya u t o m a t e d t h u s ，t h e r ei sa n i n c r e a s i n gd e m a n d i n g t oe s t a b l i s hn e wh i 曲t h r o u g h p u ta n dh i 曲a c c u r a c yt e c h n i c a l p l a t f o r m sf o rp r o t e o m i cr e s e a r c h t h e r e f o r e ，m u c ha t t e m p th a sb e e nt h r o w nt ot h e d e v e l o p m e n to f m u l t i d i m e n s i o n a l l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y _ m a s ss p e c t r o m e t r y o n e o f t h e r e p r e s e n t a t i v et e c h n i q u e i s 2 d s c x - r p l c - m s ，i nw h i c hp e p t i d e s a r ef i r s t f r a c t i o n a t e db ys c xa c c o r d i n gt ot h e i r c h a r g e a n dt h e ns e p a r a t e db yr ph p l c a c c o r d i n gt o t h e i rh y d r o p h o b i c i t y ，i nt h i st h e s i sw o r k ，b o t ho n l i n ea n do f f - l i n e s y s t e m sh a v eb e e nf u r t h e ro p t i m i z e df o rt h ea n a l y s i so fc o m p l e xb i o l o g i c a ls a m p l e s s u c ha st h ec a n c e rt i s s u ea n dt h ee r y t h r o c y t em e m b r a n ep r o t e i n s ，an e wt y p eo f d e t e r g e n t i ss t u d i e dh e r et oe n h a n c ed i g e s t i o ne f f i c i e n c ys oa st o i m p r o v e t h e p e r f o r m a n c eo f t h e w h o l e s y s t e m t h ef i r s tp a r to f t h i st h e s i si n v o l v e st h eo p t i m i z a t i o no f e n z y m a t i cc o n d i t i o n sa n d s a m p l eh a n d l i n g ，w h i c h a r ei m p o r t a n tf o rt h es h o t g u np r o t e o m i c s t h ee f f i c i e n c yo f t r y p s i nd i g e s t i o n a n dt h ea b i l i t yo f p r o t e i nd e n a t u r a t i o n ，t h ee f f e c to f r e d u c t i o n a l k y r l a t i o nw e r e d i s c u s s e db a s e do nt h ee n z y m a t i ce x p e r i m e n t sf o rs t a n d a r dp r o t e i n s i nt h i sp a r t ，u s eo f t h en e w d e t e r g e n t a l si sp r o p o s e d ，w h i c hi sd e g r a d e di n t ot w o p r o d u c t su n d e r a c i d i cc o n d i t i o n s t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t sd o n o ti n t e r f e r et h e l c m sa n a l y s i s c o m p a r e dw i t hd e t e r g e n ts d s ，a l sh a sag o o da b i l i t yo f d i s s o l v i n g p r o t e i n sl i k es d s ，a d d i t i o n a l ，i t d o e sn o ti n h i b i tt h et r y p s i na c t i v i t y a c c o r d i n g l y , a l s i sar e a l i z e dd e t e r g e n ta n dc a ns u b s t i t u t ef o rs d s t od i s s o l v i n gm e m b r a n e p r o t e i n s c o n s i d e r i n gt h e c o n d i t i o no fi n s o l u t i o nd i g e s t i o na n dp r o t e i ns e q u e n t i a le x t r a c t m e t h o dw h i c hi ss u i t a b l ef o r2 d - p a g e ，t h ee x t r a c t i n gs t e p su s e di n2 d - l c m s a r e m o d i f i e d i nt h es e c o n dp a r t ，w o r k i n gp a r a m e t e r so ft h eh o m e e s t a b l i s h e d2 d l c m s s y s t e mh a sb e e no p t i m i z e da n d t h er e s u l t sh a v eb e e n a p p l i e dt ot h ep r o t e o m i ca n a l y s i s m e a s u r e m e n t so fc o n t r o l l i n gt h ep ho fs o l v e n t ，a d d i n ga c e t o n i t r i l ei ns c xm o b i l e p h a s e ，d e s a l t i n gt h es a m p l ea n da d j u s t i n gt h eg r a d i e n to f s a l ta r eu s e dt oi m p r o v et h e p e r f o r m a n c e o fs c xc o l u m ni n p e p t i d es e p a r a t i o n s a m p l e c o l l e c t i o nt i m ea n d s o l v e n tf o rt r a n s f e r r i n gs c xf r a c t i o n st ot h er pc o l u m ni nt h eo f f i i n e s y s t e mo f 2 d - - l c - m sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no fs a l ti nt h eo n l i n es y s t e ma r et e s t e da n do p t i m i z e d c o m p a r e d w i t ht h eo n l i n es y s t e m ，t h eo f f i i n e2 d l cs y s t e mi sm u c he a s i e rt om a n a g e t h ec o n d i t i o n so fs c xa n dr pc o l u m n r e s p e c t i v e l y o nt h eo t h e rh a n d ，i n c r e a s i n gt h e q u a n t i t yo fs a m p l ew i l le n r i c ht h e l o wa b u n d a n c ep e p t i d e si nt h eo f f i i n es y s t e m ， h o w e v e r , t h i sa p p r o a c hi sn o ts u i t e df o rt h eo n l i n es y s t e md u et ot h el i m i t e ds a m p l e l o a d i n gq u a n t i t yo f t h es e c o n dd i m e n s t i o n i nc a s e ，t h es a m p l ei st o ol e s si nq u a n t i t y , t h eo n l i n es y s t e mi su s e dp r i o rt ot h eo f f i i n e s y s t e m t h eo f f i i n es y s t e mh a sb e e n a p p l i e dt ot h ea n a l y s i so f t h ep r o t e i n se x t r a c t e df r o mt h ec a n c e rt i s s u eo fn u d em i c e i n o c u l a t e db yah u m a n h e p a t o c e l l u l a r - c a r c i n o m ac e l l l i n ed 2 0 t h ee x t r e m eb a s i c p r o t e i n s ( p l 10 ) a n dl a r g e rp r o t e i n s ( m w 2 0 0 ，0 0 0d a ) ，w h i c ha r ed i f f i c u l tt oi s o l a t e b y2 d p a g e ，h a v eb e e ni d e n t i f i e di nt h ep r e s e n tw o r ki na d d i t i o n ，t h ee r y t h r o c y t e m e m b r a n ep r o t e i n sa r ed i s s o l v e db yt h ep r o p o s e dd e t e r g e n ta l s ，a n ds e p a r a t e db y o n l i n es y s t e m al a r g en u m b e ro fm e m b r a n ep r o t e i n sa r ei d e n t i f i e d ，w h i c ha r en o t s u i t a b l et ob ei s o l a t e db y2 d p a g e k e y w o r d s p r o t e o m i c s ： m u l t i d i m e n s i o n a l l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y ；s t r o n g c a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ；p r o t e i nd i g e s t i o n ；s e q u e n t i a l e x t r a c t ：o 母i n e2 d l c ：0 n l i n e2 d l c 4 第一章前言 第一章前言 1 研究背景 1 1 蛋白质组学概述 蛋白质组( p r o t e o m e ) 一词是由m a r cw i l k i n s i 】于1 9 9 4 年在意大利s i e n a 的 一次2 - d e 电泳会议上首次提出，最早见诸于1 9 9 5 年7 月的“e l e c t r o p h o r e s i s ” 杂志上1 2 。5 j ，它是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质组学旨在阐 明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存 在方式( 修饰形式) 、结构、功能和相互作用等。 蛋白质组的研究远比基因组复杂。一方面，蛋白质的数目远大于基因的数目， 这是由于基因的拼接和翻译后的修饰造成。人的基因组有2 5 0 0 0 4 0 0 0 0 个编码基 因c 6 j ，其表达的蛋白质可以达十几万甚至更多。另一方面，基因是相对静态的， 一种生物体仅有一个基因组，而蛋白质是动态的，随着时间、空间的变化而变化， 即使就是同一种细胞，它在不同时期、不同条件下，其蛋白质组也是在不断地改 变之中，而且在病理或治疗过程中，细胞蛋自质的组成及其变化，与正常生理过 程的也不同。一个细胞中的蛋白质可多达上万种，而它们的拷贝数可能相差几百 倍到几十万倍。组成蛋白质的氨基酸有2 0 种，加上修饰的氨基酸就更多，而d n a 仅由4 种核苷酸组成。从技术手段上讲，人们无法采用在基因研究中所普遍采用 p c r 技术来使蛋白质得到扩增，因此蛋白质组中含量低的蛋白质在大规模的分 离鉴定中很难被检测到，而有些对细胞功能产生重大影响的蛋白质其表达量往往 是比较低的。在基因组研究中，可以通过d n a 微阵列技术实现高通量的基因筛 选，而目前的蛋白质分析技术离工业规模的高通量还有较大差距。 1 2 传统的高通量蛋白分析手段二维凝胶电泳一质谱 二维凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 是目前唯一能将 数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。2 - d e 是由o f a r r e l l 和k l o s e 于1 9 7 5 年分别提出的【7 ，8 1 。在2 - d e 中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电 泳中分离，接着被转移到二向s d s 聚丙烯胺凝胶上，再根据相对分子质量大小 不同被分离。 早期双向电泳中第一向用载体两性电解质产生p h 梯度，使得2 - d e 重复性 很差。2 0 世纪8 0 年代初期出现的固相化p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t ，i p g ) 等电聚焦电泳技术，使2 - d e 的重复性和上样量大大改善【9 j 。为了提高电泳的分 辨率和蛋白的检出率，发展了窄i p g 技术o j ，即把i p g 胶条的p h 梯度范围缩小 至5p h 单位，通过多个连续p h 范围的窄i p g 代替单个宽范围的i p g 。利用 第一章前言 这种技术，对于高等真核细胞，可以得到超过1 0 ，0 0 0 个蛋白点 i l ，2 1 。另外，将 胶条的长度增加，使用2 4c m 的胶条可以增加分离的距离，提高分辨率。 图l传统二维凝胶电泳一质谱研究蛋白质组学流程图 随着自动点切割仪( 用于胶上蛋白质点切割) 、自动样品处理机( 用于胶上 蛋白质酶切、回收与点靶) 等仪器的出现，大大减轻了2 - d e 后样品处理的繁复 的手工操作，缩短了时间，提高了效率，更重要的是提高了样品处理的重复性， 避免了手工操作易产生的污染。另外，一种可同时运行1 2 块胶的二向s d s p a g e 电泳槽已经研制成功并商品化，使得二向电泳一次可平行分析的样品数量与一向 i e f 电泳相匹配( 一向电泳槽可乎行进行1 2 个样品的分析) ，从而大大提高了 2 - d e 分析的通量。 目前。胶上酶解的肽段主要是用m a l d i ( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ) 一t o f ( t i m eo f f l i 曲t ) 质谱仪1 1 4 来检测。该仪器操作方便，自动化程 度高，具有良好的质量精度、分辨率和灵敏度，可以通过肽质量指纹法( p e p t i d e m o s sf i n g e r p r i n t e i n g ，p m f ) 【j ”l 进行蛋白质鉴定。同时，它也可以进行串级质谱 分析，通过肽段的碎片信息来鉴定蛋白。 尽管2 - d e 在蛋白质组研究中已获得广泛的应用，但是以2 - d e 为基础的蛋 第一章前言 白质组方法体系还存在很多局限，重现性差、动态范围窄、蛋白质丢失( 疏水性、 高分子量、等电点极端的蛋白) 是该方法中存在的主要问题。另外，尽管2 - d e m s 体系的自动化作了很大的改进，特别是2 - d e 胶上蛋白质的识别、切胶、酶解、 点样以及鉴定技术基本实现了高通量和自动化，但是，2 - d e 分离后的图象分析 仍然是整个过程中较费时的步骤，成为整个体系高通量、自动化的瓶颈。【2 0 j 1 3 多维色谱一质谱实现蛋白质组的高通量分析 为了弥补以二维凝胶电泳一质谱为基础的蛋白质组技术方法的不足，很多实 验室致力于丌发新的大规模蛋白分离鉴定技术，并尝试建立新的蛋白质组研究技 术平台，其中以多维色谱( m u l t i d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 质谱技术最 为突出。这一技术将分离机理不同的色谱模式( 如离子交换一反相色谱、亲和色 谱一反相色谱) 结合在一起，实现高通量、高效率的多维分离，并进行质谱检测， 将获得的数据进行数据库搜索，可以大规模的鉴定蛋白质。 d e n a t u r a t e dp r o t e i nc o m p b x p e p t l d o g ( p h 3 ) 墅l o a d 三吗 c o m p u t a t l o n a i t r a n s i a t l o no f t a n d e mm a s ss p e c t r at oa m i n o a c i ds e q u e n c e su s i n gg e n o m l c s e n u e n c e i i d e n u f l e dp r o t d n s i i ic o m p l e x 豳2 。一二维色谱质谱研究蛋向质组学流程图 该技术的思路是先将混合蛋白酶解，经过适当的色谱分离手段之后，对肽段 进行m s m s 分析并据此实现蛋白的鉴定( s h o t g u n 技术) 【2 ”。目前，最具代表 谬k 撼 第一章前苦 性的色谱组合是强阳离子交换( s c x ) 色谱一反相( r p ) 色谱，肽段首先根据静 电作用在强阳离子交换柱上分组，然后利用阶梯梯度将从强阳离子交换柱上流出 的组分直接上样到反相柱上，按照肽段与反相基团疏水作用力的大小被流动相从 色谱柱上洗脱下来，最后用质谱检测肽段。 y a t e s 2 1 2 4 l 研究组将不同模式的色谱柱以串联的方式组合于同一色谱柱中进 行( 图3 ) ，即在毛细管的前半部分装填强阳离子色谱填料，后半部分填反相色 谱填料，并将毛细管后端拉尖作为喷头，用于纳喷雾。该方法已被成功地用于蛋 白质组研究，被称为m u d p i t ( m u l t i d i m e n s i o n a lp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g y l 。 l ) l o a da c i d i f i e dd i g e s t 2 ) e q u i l i b r a t l o n 3 ，s a l t s t y 9 4 w a s h 5 r p g 飕出e m 6 g o t o # 2 ，岬50ca岬pill剐ary50 f n s e d c a p i l l a r y f r o m h p l “c ll 1 0 0 u m p a c k e d l 岬 1 _ i l 删埘铷m “ 强嗣嗣蕊要国蔓望星渤曼娶釜丑蓦圈瞳甚 _l s c x r p g o l d i 蒯f o r e l e c t r i 1c o u t a e t w i t hl i q u i d ( 1 8k v ) c a p i l l a r yo p e n i n gi n t o m a s ss p e c t r o m e t e r 图3 双相柱分离系统。 但是，对于大量简单的样品并不需要如此复杂的二维色谱质谱技术，于是 d a v i s 【2 5 】等设计了一种比较简单的多维色谱一质谱分离鉴定技术平台( 图4 ) ，在 s c x 柱和反相柱之间插入一根t r a p 柱，它也是反相柱，但是比较短，在这里主 要起富集肽段的作用。其基本思想就是将从s c x 柱上流出的样品先富集在t r a p 柱上，然后通过六通阀切换，通过反相色谱的流动相将样品从t r a p 柱上洗脱到 反相柱上，最后用质谱检测。从装置上讲，该系统只需要一个恒流泵和一个二元 梯度泵。l cp a c k i n g s 公司推出的二维毛细管液相色谱( 图5 ) 在这个装置的 基础上略作改进，将s c x 柱接于十通阀上。通过阀b 的切换，可将s c x 柱游离 于整个系统之外，使得二维色谱装置不用作任何变化也能进行一维反相分离，园 第一章前言 此，该系统能够在一维色谱一质谱和二维色谱质谱之间进行转化以满足不同复杂 程度样品的分离鉴定。 幽4 ，d a v i s 等设计的一维色谱一质谱分离鉴定技术平台 图5 l cp a c k i n g s 公司的二维毛细管液相色谱。 另外，也有在s c x 柱之后通过十通阀并行连接多个反相柱，通过阀切换， 使得每根柱子处于不同的状态( 上样、洗脱、平衡) ，只将处于洗脱状态的反相 柱与质谱连接2 争2 7 ( 图6 ) 。这种系统装置也已商品化，是t h e r m of i n n i g a n 公司 第一章前言 的p r o t e o m e x t mw o r k s t a t i o n 。以上这些方法均是在线运行的。 图6 ，通过十通阀将s c x 柱与多根并联r p 柱连接的二维系统示意图。 但是，在在线的状态中，强阳离子交换柱难以处于最佳的分离状态。第一， 它不能在流动相中添加较多的乙腈，而实验证明，乙腈有利于肽段的分离2 8 】：第 二，它不能采用线性梯度，而它所采用的阶梯式梯度的效果没有线性梯度好2 9 】： 第三，在优化、改进仪器性能方面，它不够灵活。而在离线系统( 即先将组分从 s c x 柱上收集下来，然后再进样到反相柱上) 中，可以根据第一维紫外检测的 结果，调节上样量，这尤其有利于富集些低丰度的肽段。针对在线系统的若干 不足，已有研究组【2 w 开始尝试搭建离线的二维系统( 图7 ) 。与在线系统相比， 虽然其自动化程度稍低，但它可以通过分别优化各维的条件来进一步提高整个二 维系统的分离性能，因而对于高通量蛋自质组学的技术方法的发展具有十分重要 的研究意义及良好的实用前景。 第一章前言 a u t o s a m p l e r 图7 离线系统中，r p m s 部分的装置示意图。 将两种不同的色谱分离模式结合在一起，提高了整个分离鉴定系统的柱容 量。但是，对于低丰度蛋白的检测仍存在困难。这是由于低丰度蛋白的含量与高 丰度蛋白可以相差1 0 6 ，在高丰度蛋白的存在下，利用该系统很难将低丰度蛋白 的肽段分离鉴定出来。因此，有的研究组在二维系统之前，再加一维体积排阻色 谱( s e c ) 3 0 i ，将蛋白先预分组，然后再酶解、二维分离鉴定。 1 4 样品的预分离技术 对全细胞蛋白质采用预分离是提高低丰度蛋白质和减轻后续分离负担的有 效手段。一种是被称为“分步提取法”( s e q u e n t i a le x t r a t i o n ) 口l ，”】的蛋白质预分 离技术，其原理是基于蛋白质的溶解度不同，采用3 种不同的提取液对全细胞蛋 白质进行分步提取和分别电泳。采用分步提取法对细胞总蛋白进行预分离，实际 上是在2 - d e 根据蛋白质等电点和分子质量不同进行二维分离的基础上，增加了 溶解性能不同的第三维分离。实验证明，采用分步提取法，可以观察到的蛋白质 点增加了2 0 t 圳。 另外，也可以采用制备等电聚焦的方法3 5 1 ，蛋白质根据各自的等电点不同 而聚焦到相应的样品室中并被分别收集，将经过此种预分离的蛋白样品采用窄范 围i p g 胶条进行2 - d e 进行分离，与未经预分离样品的2 - d e 谱相比，分辨率和 胶的质量均明显改善。 同样，蛋白质可以通过体积排阻色谱【3 ”、强阳离子交换色谱等来进行分组， 将收集下来的组分酶解，然后进行二维分离鉴定。 1 5 膜蛋白的分离鉴定 第一章前言 在蛋白质组学高通量分析中，还可以通过亚细胞器分组，来简化整个系统。 其中，膜蛋白是属于比较特别的亚细胞器。从功能上来讲，它处于细胞的边界， 在细胞的各种生命活动中发挥重要的作用，如信号转导、细胞黏5 f j 和代谢、离子 交换、内吞等。但是在分离鉴定上，它又很难处理，主要是它在水溶液中的溶解 性很低。 在用二维凝胶电泳技术来分离膜蛋白之前，用有机溶剂1 3 6 ”】、非离子型去垢 剂或两性去垢剂来溶解膜蛋白。但是在第一向中，膜蛋白很容易在等电点 附近沉淀，因此，有的研究组直接用第二维s d s p a g e 来分离膜蛋白【3 6 _ 4 0 , 4 ”， 然后将割下来的条带用l c m s 分离鉴定。另外，为了提高膜蛋白在胶上的酶解 效率，采用c n b r 和胰蛋白酶( t r y p s i n ) 联合酶解的办法f 4 2 4 “，来提高肽段覆盖 率。 a 9 0 f o r m i c ：；托乞：目1 s o l u b i l 删m “n b m r 骨 d 广a 幛f n s 中9 p t f d e s i “一a ，z a t m 糖 j 8 i 。 c o ；。：l o a -：b l 搿牌；i r i g ：托乞 ：目 j 器端“” 图8 ，膜蛋白分离鉴定流程图。 d i 一目n - 一 与二维凝胶电泳技术相比，s h o t g u n 技术更具优势。目前，膜蛋白的溶解方 法主要有3 种。y 舐e s 工作组【列用含有c n b r 的9 0 甲酸水溶液来溶解膜蛋白( 图 8 a ) ，利用c n b r 将蛋白先切成大肽段，然后调节p h 值，在碱性环境下用t r y p s i n 将大肽段酶解成适合质谱鉴定的小肽段。利用该方法，鉴定酵母中的不溶组分， 得到1 3 1 个整合膜蛋白。d a v i d k h a n 等【4 5 j 则提出先用05 s d s 来溶解膜蛋白( 图 8 b ) ，然后将溶液稀释一定倍数再作酶解。另外，j o s i pb l o n d e r 等4 7 】提出膜蛋 白也可以用含6 0 甲醇的溶液来溶解( 图8 c ) ，在这个条件下，t r y p s i n 仍具有一 2 黧窍卜嚣霉谬 第一章前言 定活性 4 8 】，可以进行后继的酶解步骤。除此之外，y a t e s 研究组【4 9 ，5 0 1 又提出在高 p h 条件下，利用非限制性酶p r o t e i n a s e k 来切割暴露在水溶液中的肽段链( 图8 d ) 。 将该方法用于分析鼠的脑浆蛋白，鉴定出的l ，6 1 0 个蛋白中有2 8 2 是膜蛋白。该 方法与蛋白酶保护方法相结合，还能测定膜蛋白的拓扑结构。 2 本论文的研究内容和意义 本论文的工作主要是围绕二维色谱质谱技术来展开的。 第一部分研究和优化了蛋白的提取和酶解。在s h o t g u n 技术中，它是依赖肽 段的串级信息来鉴定蛋白，因此，酶解步骤在整个过程中至关重要，它决定了整 个实验的成败。所以，本工作首先利用标准蛋白来考察各种蛋白变性方法对酶解 实验的影响以及它们对蛋白的去折叠能力，同时也讨论了蛋白还原烷基化的必要 性和有效性。根据该实验结果来选定合适的酶解步骤，将其与蛋白顺序提取方法 相结合，希望能找出一条适合溶液酶解的提取方法。在该实验中，本文采用新的 去垢剂a l s ”i j ( a c i dl a b i l es u r f a c t a n t ) 作为第三步的提取溶液，对蛋白分步提取 步骤的改进作了些尝试。 第二部分一开始先研究了强阳离子交换色谱在蛋白质中的分离应用，并优化 了实验条件优化，比较了流动相的p h 值、有机溶剂的含量、梯度、样品等因素 对色谱分离的影响。根据优化实验的结果，以实验室现有的仪器装置为基础，借 鉴文献中已有的技术，建立了离线二维系统和在线二维系统。通过肌红蛋白的酶 解肽段的分离鉴定，对二维系统的一些参数进行了讨论，比较了在线和离线系统 各自的优缺点，提出它们各自的适用范围。最后，利用离线二维系统鉴定d 2 0 裸鼠肝肿瘤组织【5 2 郢】的水溶性蛋白，并将结果与2 d p a g e 相比较，证明二维系 统能在更广范围内鉴定蛋白质混和样品，而且歧视效应亦大大降低。同样，对于 红细胞膜蛋白而言，2 d p a g e 技术目前还不能对它进行很好的分离，将a l s 去 垢剂溶解膜蛋白的方法与在线二维系统相结合，能够鉴定出大量的膜蛋白，将它 与一维色谱质谱结果相比较，不论是在蛋白质的数量、序列覆盖率，还是蛋白 的可信度都有了很明显的提高。 纂器事 蚕奄简辫解条镣爨 窦艨蚕镐撵品确凌藏 第二章蛋白的酶解条件发实际蛋白样品的处理 第一节用标准蛋白优化酶解条件 在蛋白质组学研究中，高通量分析生物样品是关键所在。其中的一个方法就 是采用s h o t g u n 技术，它是先将所有的蛋白酶解，然后将获得的肽段用多维 l c m s 分离鉴定。除了优化多维l c m s 的操作条件来增加整个体系的柱容量和 灵敏度外，混合蛋白的酶解效率也不容忽视。为了尽可能多的得到体系中蛋白的 信息，要求所有的蛋白都被酶解，并且能够提供一定数量的肽段，但是每个蛋白 各不相同，最佳的酶解条件也不一样。因此，在本文中选取一些比较常见的酶解 方法，通过对比标准蛋白的酶解效果，找出一种较具普适性的方法。 本文选择肌红蛋白( m y o g l o b i n ，马心) 、细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，马一t l , ) 和牛血清白蛋白( b s a ) 三种标准蛋白作为实验对象。肌红蛋白是一种水溶性的 球蛋白，它由8 个c c h e l i c e s 组成，基本上所有的疏水部分都在蛋白内部，而亲水 部分向外，因此它易溶于水，但是不容易被酶解1 4 8 l ，利用它来评价蛋白变性的方 法。细胞色素c 正相反，它不仅溶于水，而且很容易被酶解，对酶解的条件也很 敏感”，可以用它来评价胰蛋白酶( t r y p s i n ) 的酶解效率。b s a 含有1 7 个二硫 键，可以用来评价还原烷基化反应的必要性和有效性。 1 a 1 b 1 c 图1 ，蛋白的结构。( 1 a ) 肌红蛋白的结 构( o x y , p h8 4 ，s p e r mw h a l e ) ，( 1 b ) 细 胞色素c 的结构( c h r o m a t i u mv i n o s u m c y t o c h r o m ec d i m e r ) 。( 1 c ) 牛血清白蛋 白的结构。 1 实验部分 1 1 实验仪器和试剂 h p l l 0 0 毛细管液相色谱二元泵( 安捷伦公司) ，六通阀( 7 7 2 5 ，r h e o d y n e ) ， e s q u i r e3 0 0 0 电喷雾离子阱质谱仪( b r o k e r 公司，德国) ，a p p l i e db i o s y s t e m s 4 7 0 0 掺鞲 第二章蛋白的酶解条件及实际蛋白样品的处理 p r o t e o m i c s a n a l y z e r ( m a l d i t o f - t o f ，a b i 公司) 。 反相色谱柱( z o r b a x3 0 0 s b ，0 3 x 1 5 0 t u r n ，3 5u m ) 购自安捷伦公司。 肌红蛋白( m y o g l o b i n ，马心) 、细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，马心) 、胰蛋白 酶( t r y p s i n ，非测序级) 和c h c a ( 一c y a n o 一4 - h y d r o x y c i r m a m i ca c i d ) 购自s i g m a 公司，牛血清白蛋白( b s a ) 购自华美生物工程公司，甲醇( m e o h ，h p l c 级) 、 乙腈( a c n ，h p l c 级) 购自m e r c k 公司，甲酸( f a ，9 9 ) 购自a c r o s 公司，三 氟乙酸( t f a ) 购自t e d i a 公司，碳酸氢铵购自上海化学分析试剂有限公司， 二硫代苏糖醇( 1 , 4 d i t h i o t h r e i t o l ，d t t ) 和尿素( u r e a ) 购自上海博光生物科技 有限公司，碘乙酰胺( i a a ) 购自f l u k a 公司，p m s f ( 苯甲基磺酰氟，p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e ) 购自上海华舜生物工程有限公司，s d s ( s o d i u mn d o d e c y l s u l f a t e ) 购自c a l b l 0 c h e m 公司，a l s ( a c i dl a b i l es u r f a c t a n t ，r a p i g e s t r m s f ) 购自w a t e r s 公司。 1 2 标准蛋白的酶解 将肌红蛋白、细胞色素c 、牛血清白蛋白分别配成一定浓度的蛋白溶液( 2 g g p j 或4p 肚1 ) ，根据实验条件加入各种试剂( 含有8mu r e a 的蛋白溶液，采 用含5 0m mn h 4 h c 0 3 的8mu r e a 溶液来溶解蛋白固体) ，最后以底物，酶质量比 为4 0 1 加入胰蛋白酶，3 7 酶解过夜。 还原烷基化的实验条件 2 9 1 ：加入一定浓度的d t t ，3 7 。c 恒温lh ，然后再加 入i a a ，在室温黑暗处反应o 5h 。 用a l s 作为变性剂时，酶解时问相应缩短，酶解完后加入5 5 0m mh c i ( 加 入的体积为样品体积的1 1 0 ) 将样品酸化，然后3 7 恒温反应4 5m i n ，将样品 取出离心( 1 3 ，0 0 0r p m ) 1 0m i n ，取上清液保存。 1 3 干扰测试 取2p l 2 斗g p l 的c y t o e h r o m ec 和m y o g l o b i n 的酶解肽段( 含5 0m m n h 4 h c 0 3 ) 各2 “l ，分别与2 山的o 5 s d s 、o 1 s d s 、o 0 5 s d s 、8 m u r e a 、 4 m u t e a 、2 m u r e a 、5 0 m m d t t 、1 0 m m d t t 、l m m d t t 、0 5 a l s 、o 1 a l s 、0 0 5 a l s ( 蛆上溶液均用5 0 m m n h 4 h c 0 3 配置) 混合，然后用含0 1 t f a 的水溶液稀释4 0 倍，留待后面的质谱检测。 1 4 质谱的检测和鉴定条件 将肌红蛋白和细胞色素c 、牛血清白蛋白的酶解溶液用含