（光学专业论文）基于数字全息显微的正弦位相光栅数值重构.pdf

- 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中配，特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：窒堕堕 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：塑堕亟 指导教师签名： 签名日期： 刃年月弓日 一 h 一 l 一 一 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 基于数字全息术以及光学显微技术的数字全息显微术( d h m ) ，利用数值计算方法进 行全息重建，重建得到的相位相衬图像提供了显微物体表面相位分布的定量测量，是一 种同时再现显微物体振幅和相位的新方法。它在显微结构测量方面具有高分辨率、非侵 入性、非破坏、灵敏度及精度高等特点，使得数字全息术在微结构测量领域中具有很好 的应用前景。本文以显微正弦位相光栅为样本，用自编的数字全息再现程序模拟了正弦 光栅的相位结构分布。 本文的主要研究内容和特点包括以下几个方面： 1 基于马赫曾德干涉光路，设计了离轴数字全息记录显微物体的光路系统，采 用透射式记录光路，采集了光栅的全息图，并把全息图存储在计算机中。 2 论文工作重点是显微位相光栅相位分布的数值重建研究。论文完成了数字全息 记录和再现程序的编写。以显微正弦位相光栅为模拟样本，对样本的全息记录和再现过 程进行计算机模拟，制作了位相光栅的离轴全息图。自编程序用菲涅耳近似算法和快速 傅里叶变换，对单幅全息图进行了数值重建，计算比较简单。在图像处理方面，我们将 频域滤波法应用于程序中，滤掉了零级像和共轭像的频谱，获得了高质量的重建图像。 用相位解包裹算法，获得了正弦光栅的真实相位。该程序具有操作过程简便、计算速度 快、灵活性强等特点。 3 对相位分布图的数值分析表明，编写的程序实现了正弦位相光栅三维结构的完 美再现，可直接获得显微正弦光栅的相位信息，该程序可用于微观物体的位相分布测量。 4 程序中设定不同的再现距离，比较正弦光栅相位分布情况。再现距离z = 3 5 m m 时和原光栅相位图比较，光栅相位最大值都为6 2 8 3r a d ，且没有发生相位畸变。结果表 明，只有再现距离完全等于记录距离时，正弦光栅的相位才能准确再现，才能获得聚焦 的再现像。 5 通过改变正弦光栅的周期，观察再现效果。数值模拟结果表明，光栅周期越大， 像素点越多，再现出来的正弦光栅越平滑，再现像的效果就越好。 最后，本论文完成的计算机模拟和数值分析结果为以后数字全息显微测量技术进一 步的深入研究提供了有意义的借鉴和帮助。 关键词：光学全患；数字全息显徼技术；计算机模拟；位相物体 n u m e r i c a lr e c o n s t r u c t i o no ft h es i n ep h a s eg r a t i n gb a s e do nd i g i t a l h o l o g r a p h i cm i c r o s c o p y a b s tr a c t b a s e do nt h ed i g i t a lh o l o g r a p h ya n do p t i c sm i c r o s c o p i ct e c h n o l o g y ，b yu s i n gn u m e r i c a l c a l c d a t i o nm e t h o d ，d i g i t a lh o l o g r a p h i cm i c r o c o p y ( d h m ) r e c o n s t r u c tp h a s ec o n t r a s ti m a g e s w h i c hp r o v i d eq u a n t i t a t i v em e a s u r e m e mo fp h a s ed i s t r i b u t i o no fm i c r o s c o p i co b j e c t , i ti sa n e wm e t h o dw h i c hr e c o n s t r u c tt h ea m p l i t u d ea n dp h a s eo fm i c r o s c o p i co b j e c ts i m u l t a n e o u s l y i th a sm a n yc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha s1 1 i g hr e s o l u t i o na n dn o n - i n v a s i v e ，n o n d e s t r u c t i v e ，h i g h e r s e n s i t i v i t ya n dh i g h e ra c c u r a c yi nm e a s u r e m e mo ft i n ys t r u c t u r e s ，w h i c hm a k ed i g i t a l h o l o g r a p h yag o o da p p l i c a t i o np r o s p e c ti nt h ef i e l do fm i c r o s t r u c t u r em e a s u r e m e m i nt h e p a p e r , t h em i c r o s c o p i cs i n ep h a s eg r a t i n gi ss e l e c t e da sas a m p l e w eu s ed i g i t a lh o l o g r a p h i c e m e r s i o np r o g r a mw h i c hd e s i g n e do u r s e l v e st os i m u l a t et h ep h a s es t r u c t u r ed i s t r i b u t i o no f s i n eg r a t i n g t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n df e a t u r e so ft h i sp a p e ri n c l u d et h ef o l l o w i n ga s p e c t s ： 1 b a s e do nt h em a c h z e n d e ri n t e r f e r e n c eo p t i c a lp a t h , t h eo f f - a x i sd i g i t a lh o l o g r a p h i c o p t i c a lp a t hs y s t e mw h i c hr e c o r dm i c r o s c o p i co b j e c ti sd e s i g n e d b yu s i n gt h et r a n s m i s s i o n r e c o r d i n gs y s t e m ，t h eh o l o g r a m so ft h eg r a t i n ga r ec o l l e c t e d ，a n dt h e s eh o l o g r a m sa r es t o r e d i nt h ec o m p u t e r 2 m p 印e rw o r k sf o c u s e do nt h en u m e r i c a lr e c o n s t r u c t i o no fam i c r o s c o p i cp h a s e g r a t i n g sp h a s ed i s t r i b u t i o n d i g i t a l h o l o g r a p l l i cr e c o r d i n g a n de m e r s i o np r o g r a mi s c o m p l e t e d t h em i c r o s c o p i cs i n ep h a s eg r a t i n gi ss e l e c t e da sas a m p l e ，h o l o g r a p l l i cr e c o r d i n g a n de m e r s i o np r o c e s s e so ft h es a m p l ea r es i m u l a t e db yt h ec o m p u t e r , t h eo f f - a x i sh o l o g r a mi s p r o d u c e d b yu s i n gt h ef r e s n e la p p r o x i m a t ea l g o r i t h ma n df a s tf o u r i e rt r a n s f o r m ，as i n g l e h o l o g r a mi s r e c o n s t r u c t e dn u m e r i c a l l y ，c a l c u l a t i o no ft h ep r o g r a mi s s i m p l e i ni m a g e p r o c e s s i n g ，w ea p p l yt h es p e c t r u mo ff i l t e r i n gm e t h o dt ot h ep r o g r a m ，t h es p e c t r u mo f z e r o 。o r d e ri m a g ea n dt w i ni m a g ea r ef i l t e r e do u t ，w eg e tt h el l i g hq u a l i t yr e c o n s t r u c t i o ni m a g e u s i n gu n w r a p p i n gp h a s ea l g o r i t h m ，t h er e a lp h a s eo fs i n eg r a t i n gi sa c h i e v e d t h i sp r o c e d u r e h a sc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha ss i m p l eo p e r a t i o np r o c e s s ，f a s tc a l c u l a t i o ns p e e d ，f l e x i b l i l i t ye t c 3 t h en u m e r i c a la n a l y s i st ot h ep h a s ed i s t r i b u t i o ns h o wt h a tt h ep r o g r a mw h i c hw e w r i t e dr e a l i z et h ep e r f e c tr e c o n s t r u c t i o no ft h es i n ep h a s eg r a t i n g s3 ds t r u c t u r e ，t h ep h a s e i n f o r m a t i o no ft h em i c r o s c o p i cs i n eg r a t i n gc a nb ed i r e c t l yo b t a i n e d ，t h ep r o g r a mc a nb eu s e d f o rt h ep h a s ed i s t r i b u t i o nm e a s u r e m e mo f m i c r o o b j e c t 辽宁师范大学硕士学位论文 4 、s e td i f f e r e n tr e c o n s t r u c t i o nd i s t a n c e si n t h e p r o g r a mt oc o m p a r ep h a s e d i s t r i b u t i o no fs i n eg r a t i n g s w h e nr e c o n s t r u c t i o nd i s t a n c ei s3 5 m m ，w h i c hc o m p a r e d 谢mt h e f o r m e rg r a t i n gp h a s ed i s t r i b u t i o nd i a g r a m ，t h ep h a s em a x i m u mo ft h eb o t hg r a t i n g sa r e 6 2 8 3t a d ，a n di td o e s n tp r o d u c e dp h a s ed i s t o r t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a to n l yr e c o n s t r u c t i o n d i s t a n c ec o m p l e t e l ye q u a l st o t h er e c o r d i n gd i s t a n c e ，c a l lt h e p h a s eo ft h es i n eg r a t i n g a c c u r a t e l yr e c o n s t r u c t e d ，i nt h a tw a yw ec a no b t a i nt h ef o c u sr e c o n s t r u c t i o ni m a g e 5 b yc h a n g i n gt h e s i n eg r a t i n gc y c l e ，w eo b s e r v et h ee m e r s i o ne f f e c t n u m e r i c a l s i m u l a t i o nr e s u l t ss h o wt h a tw i t hb i g g e rg r a t i n gc y c l e ，t h eg r a t i n gh a sm o r ep i x e l s ，t h e r e c o n s t r u c t e ds i n eg r a t i n gm o r es m o o t h e r , t h ee f f e c to ft h ee m e r s i o ni m a g ei sb e t t e r a tl a s t , t h ec o m p u t e rs i m u l a t i o na n dt h en u m e r i c a la n a l y s i sr e s u l t sw h i c hw ec o m p l e t e d s h o wt h a ti tw i l lp r o v i d em e a n i n g f u lr e f e r e n c ea n dh e l pf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nt h el a t e rd i g i t a l h o l o g r a p h i cm i c r o s c o p i cm e a s u r e m e n t k e yw o r d s ：o p t i c a lh o l o g r a p h y ；d i g i t a lh o l o g r a p h i cm i c r o c o p y ；c o m p u t e rs i m u l a t i o n ；p h a s e o b j e c t ， i i i 1 1 3 1 3 数字全息显微术的发展历程4 1 3 1 光学显微镜术5 1 3 2 电子显微技术。5 1 3 3 共焦扫描显微技术6 1 3 4 扫描探针显微技术7 1 3 5 显微技术比较8 1 4 数字全息显微测量技术概况8 1 4 1 数字全息显微测量技术的应用概况1 0 1 4 2 数字全息显微术的国内研究1 3 1 5 本论文的研究目的l3 1 6 本论文的主要工作1 3 第2 章全息记录与再现的基本理论1 5 2 1 光学全息图的记录和再现。1 5 2 1 1 波前记录15 2 1 2 波前再现17 2 2 数字全息图记录和再现的基本原理1 7 2 3 数字全息重建算法2 0 2 3 1 菲涅耳近似重建算法2 0 2 3 2 卷积重建算法2 3 2 4 傅里叶变换理论2 4 2 4 1 傅里叶变换的定义2 4 2 4 2 离散傅里叶变换2 5 2 5 数字全息图的记录条件。2 7 2 6 数字图像处理技术2 9 2 6 1 频域滤波法2 9 2 6 2 相位解包裹算法3 1 辽宁师范大学硕士学位论文 第3 章正弦光栅位相分布的数值分析3 3 3 1 数字全息显微实验光路的设计3 3 3 2 数字全息记录和再现的数值模拟步骤3 4 3 3 数值模拟结果3 4 3 4d 、结4 6 第4 章总结与展望4 8 4 1 总结4 8 4 2 展望4 8 参考文献5 0 攻读硕士学位期间发表学术论文情况5 4 致谢5 5 一v 一 辽宁师范大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 数字全息术概况 “全息来源于希腊字母“h o l o s ，即完全的信息。全息不仅包括光的振幅 信息还包括位相信息。全息技术利用光的干涉原理，将物光波前以干涉条纹的形式存 储在记录介质上，使物光波前的振幅和位相信息都储存在记录介质中，产生的干涉条纹 图样称为“全息图”。然后用参考光波照射全息图，经全息图衍射后能再现出原始物光 波，从而形成包含物体全部信息的三维像，这个波前记录和再现的过程被称为波前重现 技术。 在1 9 4 8 年，英国科学家丹尼斯伽柏( d e n n i sg a b o r ) 在试图提高电子显微镜的分辨率 时，发明了全息术【l 】。之后伽柏采用水银灯作光源代替电子波，获得了第一张全息照片( 即 全息图) ，并因此获得了1 9 7 1 年的诺贝尔物理学奖。 虽然那时这项新的发明是一个重大的进步，但是需要相干光源，阻止了全息术在实 际中的应用。激光的发明和1 9 6 3 年美国科学家e n l e i t h 和j u p a t n i e k s 离轴全息术的引入 为全息术提供了关键元素，使全息术成为一种实用且功能强大的工具，全息术的研究才 进入迅速发展的阶段。 但传统光学全息术有三个弊端：首先，全息干板所需的曝光时间比较长，灵敏度低， 因此对记录装置稳定性的要求较高。其次，拍摄的全息图需要经过显影、定影、漂白等 一系列的物理、化学湿处理过程，不能实现全息图的实时再现。再者，传统全息术再现 的结果仍然是全息像的强度，这样很难对记录对象进行三维测量和分析，极大程度地限 制了其在检测领域中的应用。随着计算机技术的发展，人们试着在全息术中引入计算机， 实现全息术的数字化。数字全息结合了数字处理技术和传统的光学全息技术，它的优势 在于利用计算机来生成数字全息图，只需要物光波的数学表达式描述，不需要物体的实 际存在。因此，与传统的光学全息术相比，数字全息术具有很广阔的发展前景。 1 9 6 7 年，用计算机重建一幅全息图的思想第一次由g o o d m a n ，l a u r e n c e 和k r o n r o d 等人提出的【2 】。在那个时期，全息术的数值重建方法主要的缺点是计算机的运算能力差 并且缺乏合适的装置获得数字再现图像。1 9 6 9 年美国学者b e n t o n 提出了彩虹全息术，拍 摄出的全息图衍射效率高，制作过程简单，得到了迅速的发展。2 0 世纪6 0 年代末，全息 技术的研究和应用得到了较快的发展。此后，相继出现了多种全息方法，开辟了全息应 用的新领域。1 9 7 1 年，t h u a n g 首次提出了“数字全息术( d i g i t a lh o l o g r a p h y ) ”一词。1 9 6 2 年，前苏联科学家丹尼苏克( d e n i s y u k ) 提出了利用白光再现反射全息图的原理。1 9 7 7 年 基于数字全息显微的正弦位相光栅数值重构 c r o s s n 成了复合全息图，和彩虹全息图一样，都可以在白光条件下观察再现像。1 9 9 4 年，用电荷耦合器件c c d 摄像机记录菲涅耳全息图的数值重建方法第一次被s c h n a r s 和 j u p t n e r 提出。 近年来，随着计算机技术的发展和高分辨率c c d 的发展，数字全息技术正迅速成 为一种代替以胶片为记录介质的传统全息术的方法。数字全息术是以c c d 等光电探测器 件记录全息图，用数值方法再现全息图，综合普通全息术、数字图像处理技术、光电成 像技术发展起来的一种新型全息成像技术。数值全息术有很多显著的优势，如简单、快 速地采集图像，可用许多功能强大的数字处理算法，通过计算三维图像的复光场，可以 直接获得光场的振幅和相位。数字全息术及其应用现在受到越来越多的关注，已经使 数字全息技术变得可行，并且获得飞速发展。数字全息术已经被应用于多种多样的领域， 包括度量衡学、形貌测量、变形测量、振动分析、防伪、三维图像识别、医学诊断和 更多最新的生物显微术。 数字全息技术对比传统的光学全息术具有很多突出的优点：首先，数字全息通过光 敏电子器件c c d 记录全息图，灵敏度高，响应速度快，比用银盐干板记录全息图所需 曝光时间短得多。其次，数字全息省去了传统全息术中的显影、定影、漂白等物理和化 学处理过程，再现过程时间短、简单，因此适合记录运动物体的各个瞬时状态，并且大 大降低对稳定性的要求，从而可以实现测量过程的实时化和现场化。再者，数字全息再 现过程利用空间滤波处理技术，消除了零级衍射和孪生像的影响，借助数字图像处理技 术，消除了噪声以及记录过程中底片非线性因素的影响，这是传统全息技术不能比拟的。 第四，全息图经数值再现后得到的是物光场的复振幅分布，不仅包括物体的振幅信息， 而且包括物体的位相信息。物体的表面轮廓和光强都可通过复振幅得到，可直接计算出 物光场的相位分布，通过相位的改变就可获得物光场变化的情况，因此数字全息干涉术 得到了广泛的应用。第五，数字全息的数值重现不需要光学元件聚焦就可以方便地实现 数字聚焦，观测三维物体的形貌。第六，用计算机进行全息图重建，效率高、成本低。 第七，数字全息图具有很强的反干扰性。通过使用像素全息和浮雕，全息胶片的制作都 可以通过改变数字全息图来实现，这可以制作数字全息防伪标识。另一个基本优点是， 数字全息图可以很容易地拍摄，相对于传统的全息图，打印数字全息图不是很昂贵。 一2 一 光舞分柬镶 _ 链 ( a ) 传统的光学全息 囊 f _ l 函 赫， 厂 户。i 先嚣 光舞分柬镀 ( b ) 计算全息 l c d ( c ) 数字全息 图1 1 光学全息示意图 f i g 1 1s c h e m e s o fo p t i c a lh o l o g r a p h y 1 2 数字全息术的国内外发展现状 2 0 世纪9 0 年代，由于各种理论的深入研究、实验条件和技术水平的提高，数字全息 技术得到了迅速的发展，其应用领域也在不断拓展。目前在国外，数字全息技术的实验 基于数字全息显微的正弦位相光栅数值重构 研究比较活跃，所做的工作包括为了提高数字全息分辨率而研究的记录和再现方法。 1 9 9 2 年，美国学者w s h a d d a d 等人首次公布了他们的工作，用c c d 记录全息图，并用计 算机再现全息像【5 1 ，w s h a d d a d 的研究具有跨时代的意义。1 9 9 4 年，德国科学家u s c h n a r s 和w j u p t n e r 采用离轴菲涅耳数字全息记录光路，用c c d 记录了一个骰子的全息图，得到 了清晰的骰子强度再现像 6 1 ，并在此基础上提出了菲涅耳变换的方法。1 9 9 7 年，t h o m a s m k r e i s 等人研究提出了数字全息的卷积再现算法，并对比了菲涅耳变换法和卷积再现 法两者的优劣，讨论了它们各自的特点和适用范围【j 7 1 ，然后他们又利用菲涅耳变换算法， 利用菲涅耳离轴全息再现，测量物体的微小形变。1 9 9 7 年，日本科学家i c h i r o uy a m a g u c h i 和t o n gz h a n g 提出了相移数字全息法，它是一种消除零级像和共轭像的方法【s j 。在数字 全息图的记录过程中，根据相移干涉原理，在参考光光路中引入一定的相移量，需要记 录多幅全息图，利用相应的相移算法，对所记录的多幅全息图进行数字计算处理，重建 出物光在记录面处的复振幅分布。相移法具有测量过程简单，测量精度高，可以全场测 量等优点。进入二十一世纪以来，数字全息技术发展相当迅速，并很快成为国际上的研 究热点。 在国内，对数字全息技术的研究起步比较晚，大多数开始于早期的介绍和理论研究。 目前国内所进行的诸多研究中，大多数文章中只有理论推导，实验设计方面的介绍还比 较少，但是也取得了一些成果。上海光机所的刘诚【9 】、肖体乔【l o 】等人在数字全息术的基 本特点和消除共轭像、零级像的方法上做了很多研究工作，并取得了比较好的成果。 从以上国内外概况可以看出，虽然近几年国内数字全息技术取得了一些进展，但从 技术实现上，我国与国际上差距还很大，尤其是数字全息技术在生物医学检测及工业检 测等应用方面，差距更大。 1 3 数字全息显微术的发展历程 数字全息显微术是在数字全息记录和再现技术以及光学显微技术基础上发展起来 的一种新型显微技术，是观测显微样本一种有力的工具，它能同时获得再现光波的强度 和相位信息。这种分辨率高、快速、非接触式、无损伤的数字全息显微技术在微观领域 中有着广泛的前景，它可以被用于生物细胞观察 1 1 , 1 2 、微光学及微机电元器件的面形或 变形测量 1 3 , 1 4 】，空间粒子和核径迹的跟踪检n t l 5 , 1 6 、聚合物粒子的生长检测、微电路的 测试等多个领域。 随着科学技术的发展和显微镜分辨率要求的提高，显微镜技术得到了持续的发展与 完善。当前研究显微结构的技术可以分为几个阶段：光学显微技术，电子显微技术，共 一4 一 物体成放大的像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1 7 世纪 中叶，荷兰的列文胡克( a n t o n i v a nl e e u w e n h o e k ) 和英国的胡克利用自制了单组元放大镜 式的高倍显微镜，对显微镜的改进作出了巨大的贡献，这种显微镜尤其在动植物机体微 观结构的观测方面表现卓著。1 9 世纪，英国的科学家利斯特( l i s t e r ) 为消除色差和球差， 利用火石玻璃和冕牌玻璃制成物镜，从而大大提升显微镜分辨显微结构的能力。1 9 世纪 7 0 年代，德国科学家阿贝( e a b b e ) 用衍射理论证明了普通光学显微镜受到光波衍射极限 的限制。以上这些研究都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展。在制造显微镜 的技术快速发展的同时，显微观察技术也在不断创新。1 8 5 0 年发现了偏光显微术；1 8 9 3 年出现了干涉显微术；1 9 3 5 年，荷兰物理学家泽尔尼克( f z e m i k e ) 发明了相衬显微镜， 泽尔尼克由此荣获了1 9 5 3 年的诺贝尔物理学奖。 1 3 2 电子显微技术 现在，随着计算机技术的发展，电子显微镜技术和功能也越来越进步，放大 倍数已超过1 0 0 0 多万倍，并在材料、生物、医学等领域得到广泛应用。由于受光 波波长对分辨率的限制，普通光学显微镜只能观察细胞水平的物体，还远不能达到科 学家探索微观世界的需要。电子显微镜技术( e l e c t r o nm i c r o s c o p y ) 成为研究机体微细 结构的重要手段，常用的有透射电子显微镜( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t e m ) 和 扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，s e m ) 。1 9 5 8 年，我国成功地研制了第 一台电子显微镜( e l e c t r o nm i c r o s c o p e ，简称e m ) 。 透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光 屏上或照相底片上进行观察。电子显微镜的分辨率大大优于光学显微镜。现代透射电子 显微镜的分辨率已可达0 1 0 2 r i m ，放大倍数为几万到几十万倍。由于电子易散射或被物 体吸收，故穿透力低，必须制各更薄的超薄切片( 通常为5 0 1 0 0 n m ) 。 1 9 4 2 年，英国首先制成扫描电子显微镜。扫描电子显微镜的工作原理是电子束经电 子透镜或磁透镜缩小成一束极细的电子束，电子探针以扫描的方式打在样品表面。由探 测器分别接收从样品上产生的二次电子、吸收电子、散射电子及透射电子等一系列信息， 一5 一 基于数字全息显微的正弦位相光栅数值重构 经电子电路放大后以扫描方式在显像管上成像。目前使用最广的常规钨丝阴极扫描电子 显微镜的分辨率已达到3 5 r i m 左右。和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电子显微镜具 有以下特点：能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至1 2 0 m i n x 8 0 m m 5 0 m m ； 样品制备过程简单，不用切成薄片；景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学 显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍：图象的放大范围广，分辨率也比较高，可放大十 几倍到几十万倍。虽然电子显微镜有较高的分辨率，电子显微镜同样也有缺点，比如它 们对于工作环境要求极高，需要保持高度真空，还要求样品导电，并且对探测样品有较 大损伤，而且对活的生物体，特别是本身发光的样品显得无能为力，因此难以在任何环 境中实现对物质的无损观察。 1 3 3 共焦扫描显微技术 上世纪8 0 年代出现了一批新型的光学显微镜，在进一步观察微观物体方面又提升了 一个台阶。在新型的光学显微镜中，最具代表性的是激光扫描共焦显微镜0 7 q 9 ( l a s e r c o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p e ，l s c m ) 。激光共焦扫描显微镜是一种高级的荧光显微镜， 在生理学、分子细胞生物学、药理学、遗传学、形态学等领域己被广泛应用。激光共聚 焦扫描显微镜的主要原理是利用共轭焦点技术，即激光光源的光栅针孔与探测针孔对被 照射点或被探测点来说是共轭的。如图1 2 显示，利用放置在光源后的照明针孔和放置在 检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过光栅针孔发射出的光聚焦 在样本焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，扫描点以外的任何发 射光均被探测针孔阻挡，不会成像。然后，再通过分光镜和计算机控制，这一点光源在 物镜的焦平面上来回扫描，便可形成这个焦平面的图像。探测针孔起空间滤波作用，可 以滤除杂散光，而且载物台在垂直方向上的移动可以得到三维图像，具有更高的轴向分 辨率，这是普通光学显微镜不能比拟的。 妇攀一光电倍增管 针孔 分柬镜 物镜 图1 2l s c m 的工作原理 f i g 1 2w o r k i n gp r i n c i p l eo fl s c m 一6 一 辽宁师范大学硕士学位论文 正是因为激光扫描共聚焦显微镜的多种优越性和实用性，因此共焦扫描显微镜在细 胞生物学、神经生物学、植物学等研究领域中得到了广泛的应用。例如共焦扫描显微镜 可以实现对自然状态下活生物体进行三维无损检测，克服了以前必须对生物样品进行染 色、并且做成超薄生物切片的缺点。由于共焦显微技术的不断完善和更新，目前激光共 焦扫描显微镜已具有优异的特点，如高分辨率、高对比度、高灵敏度、能够获得多维图 像、对细胞检测无损伤、准确、以及优良的重复性。例如日本奥林巴斯公司生产的 o l s 3 0 0 0 激光共焦扫描显微镜，它与其他同类产品相比，分辨率是最高的，它的扫描精 度可以达到o 1 u m ，分辨率可达1 2 0 n m 。激光扫描共焦显微镜虽然有分辨率高，自动化 程度高等优点，但其扫描速度是主要的受限条件之一，且价格昂贵，维护保养要求高， 对系统配件如扫描实现装置要求高，所以很难在各行业中普遍运用。 1 3 4 扫描探针显微技术 继扫描隧道显微镜后，陆续出现了一系列具有相似工作原理的新型显微镜，包括原 子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，简称a f m ) 、横向力显微镜( l a t e r a lf o r c e m i c r o s c o p e ，简称l f m ) 等，这类显微镜的工作原理是探针对被测样本进行扫描成像，所 以称为扫描探针显微镜( s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p e ，简称s p m ) 。1 9 8 6 年，g b i n n i n g 在扫 描隧道显微镜的基础上发明了原子力显微镜。原子力显微镜是一种比较典型的扫描探针 显微镜，它的基本原理是通过检测待测样本表面和微型力敏感元件之间极微弱的原子间 的相互作用力获得样本形貌和作用力等相关信息，从而得到样品表面的形貌图像。原子 力显微镜有两个独特的部分：对微弱力敏感的悬臂和力检测器。由于原子间的作用力极 其微弱，因此a f m 的分辨率可达到原子量级。 喁 激光嚣 阪 电 1 5 匐 瓷 f 王 ： 激光整溯器 桴品逼近螺杆 吲 图1 3 原子力显微镜( a f m ) 系统结构图 f i g 1 3s y s t e ms t r u c t u r eo fa f m 基于数字全息显微的正弦位相光栅数值重构 随着科学技术的发展，原子力显微镜技术已成为目前最新的生物成像技术之一。 原子力显微镜具有其它显微镜与之不可比拟的优点，比如原子力显微镜可以在自然状 态下对生物医学样品直接进行成像，而不需要对样品做任何的特殊处理；原子力显微 镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作，而电子显微镜需要在高真空条件下运 行；原子力显微镜提供清晰的三维表面图，而电子显微镜只能给出二维图像。当然原子 力显微镜也有自身的缺点，例如成像范围太小，速度慢，受探头的影响太大。目前原子 力显微镜主要在生物大分子纳米水平的形态结构和功能、细胞微生物、半导体及生物单 分子间相互作用等研究领域被广泛应用，它现在已成为纳米科学研究的基本手段。 1 3 5 显微技术比较 以上所述的显微结构测量技术都可以很好地对微小物体成像，而且各种测量技术均 已发展成熟，并且商品化，但各自的缺点依然存在。光学显微镜的像焦深短，每次聚焦 只能获取物体的二维图像，对样品的厚度、位置以及多层细胞的观测非常困难；电子显 微镜虽然有较高的分辨率，但是对于工作环境和被测样本的要求极高，需要保持环境高 度真空、要求样品导电，因此难以在任何环境中实现对物质的无损观察；共焦扫描显微 镜目前已实现超衍射极限的高分辨率、高成像对比度以及能够层析成像，但扫描速度是 其主要的受限条件之一，且对系统配件要求高而复杂，故而不适合样本的动态测量；扫 描探针测量达到了原子级高分辨率，即可以分辨出单个原子、获得实时三维图像、可实 现原子或分子层的局部表面结构分析等，但也存在一些问题，扫描探针显微镜需要严格 控制探针与样本之间纳米级的距离，必须的机械驱动环节引入了较大噪声，降低了测量 的实时性，活体生物样本需要硬化处理，不能完全避免“非入侵 ，不适于活体生物样 本的动态观测。这样就需要一种高分辨率、能同时测量生物样品的三维形貌、且操作简 单的显微观测方法，数字显微技术的出现克服了传统光学显微术无法直接提取样品相位 信息的缺点，可以对活体细胞组织等相位型生物样品进行定量测量和有效观察，这些研 究是非常有意义的。 1 4 数字全息显微测量技术概况 数字全息显微测量技术是检测显微样本微观结构的重要工具，它在科学和工业应用 中是非常重要的，因此需要提供快速、非接触式和非入侵性的工具对微观结构的性能以 及几何形状进行精确检测和表征。为了这个目的数字全息术已经提出几种相位测量的方 法。同轴全息术中用到相移程序，需要获取多幅全息图和压电传感器r ( p z t ) ，它是用来 调节参考波的相位。在离轴全息光路中，s c h n a r s 说明了通过分析样本两个不同状态下 的相位差测量样本变形的可能性。然而，这种两次曝光的方法不能给出样本的绝对相位。 一8 一 在1 9 9 9 年，c u c h e 等提出测量绝对相位的解决办法。他们引入数字参考光波的概念， 来弥补离轴光路图中参考波的角色，引入数字相位掩膜的概念来补偿显微物镜( m o ) 造成 的波前变形。其他干涉装置和干涉显微镜需要通过采集多个图像、相位调制来测量相位。 相比之下，数字全息术获得相位信息，只需要一个单一的图像( 全息图) ，而且没有相位 调整装置。 数字全息显微方法是一种更有吸引力的测量微观结构的方法，因为由全息图它能够 同时获得定性和定量的强度和相位信息，数字全息显微测量技术已经发展成为一种具有 前景的测量显微物体有力的工具，而且广泛应用于各种领域，例如微机电系统( m e m s ) 检测，细胞生物学，粒子成像与测量，聚合物粒子生长检测、形貌和变形测量、折射率 测量、图像加密、物质参数测量( 如泊松比、热膨胀系数、杨氏模量) 【2 0 】等领域。数字全 息显微的测量的精度不断地提高，目前可以达到小于1um 的横向分辨率和n l t l 量级的 纵向分辨率【2 1 1 。 相对而言，国外对数字全息显微测量技术的研究和应用比较广泛。目前，德国以及 瑞士的科学家对数字全息显微测量技术领域的研究比较深入，取得了突破性进展。它们 采用不同的再现算法和记录光路，为数字全息显微测量实验提供了丰富的思路，而且将 显微测量技术应用到各个领域。很多国家现在已经将数字全息显微测量技术商品化，投 放到市场。h a d d a d 和b o y e r 等人提出傅里叶变换全息在生物医学显微术上的应用。上面 提到的所有研究主要集中在振幅对比成像，即只考虑了重建光波场的强度。数字全息术 在全息图干涉测量中的应用说明了这种方法能够测量同一物体两种不同状态的相位差。 然而，这种方法不能用于一幅全息图重建相位对比图像【2 2 2 3 】。c u c h e 等人表明通过全息 图和复制的参考光波相乘可以得到物体的相位重建，同时也表明得到的相位对比是定量 的，能够直接应用于光学测量比如表面轮廓测量瞄】和全息干涉测量，其重建的准确性对 测量结果有着重要的影响。这种新的成像技术显著的特点是高获得率( 成像频率) ，和高 重建率0 h z ) ，能够同时重建振幅和相位图像，并且能够利用一幅全息图通过数值计算 的方法再现精确的样本三维结构定量信息。 数字全息显微光路系统有透射式和反射式两种形式，如图1 4 所示，第一种( 图a ) 是用于透明物体( 例如生物细胞) 的透射式光路，第二种是反射式光路( 图