（微生物学专业论文）人乙醛脱氢酶2基因的克隆及表达.pdf

人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达瓤文 摘要 人体中的乙醇脱氢酶( a l c o h o l d e h y d r o g e n a z e ，a d h ) 及乙醛脱氢酶( a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e a l d h ) 在乙醇代谢过程中发挥着重要的作用。若a d h 及a l d h 在人体内均充分具备，则能较快得分解乙醇，减少究竟对中枢神经的影响，因而 即使摄入一定量的乙醇，其所含有的乙醇也能在很短时间内得到充分的代谢。在 人体中，a d h 在一般情况下是可充分表达，且表达量基本持平的。人群内缺乏 a l d h 的个体则较多，而a l d h 的缺乏将导致乙醇不能被完全分解为水和二氧 化碳，而是以乙醛的形式继续留存于体内，使人在酒后产生恶心欲吐、昏迷不适 等中枢神经麻痹状态，即醉酒症状。其中的a l d h - 2 就是众所周知的有高度遗 传多态性并与亚洲人群的饮酒行为密切相关的基因。近年来，随着人们对获得全 新的、更有效的解酒保肝药物的需求目益迫切，关于a l d h 的研究工作更显其 深远意义。 本文采用p c r 技术，克隆获得了人a l d h 2 基因，构建质粒p u c m a l d h 2 并对 其测序，发现其与预期序列完全一致。再以质粒p u c m a l d h 2 为模板进行p c r ， 并将这段含酶切位点的a l d h 2 基因重组到原核表达载体p e t 2 2 b ( + ) 中，进行i p t g 诱导表达，确认人a l d h 一2 蛋白已实现了高水平表达，最佳表达条件为3 7 c 、 l m m o l li p t g 浓度、诱导表达6 h ，表达量约占总蛋白的3 0 。二次洗涤包涵体， 可以获得纯度较高的月的蛋白，这为工业化生产提供了条件。由于重组人 a l d h 一2 融合了6 h i s 标签，使用n i ”亲和层析纯化，可以获得超高纯度的目 的蛋白，亲和层析结果表明，当咪唑浓度达到4 0 m m o l l 左右时，开始有目的蛋 白洗出，直至咪唑浓度到达1 0 0 m m o l l 时结束。纯化后的目的蛋白经含有精氨 酸的变性溶液稀释复性后，进行活性检测表明，该复性蛋白具有a l d h 活性， 比活力约为3 3 1 7u m g 。 关键词：乙醇脱氢酶；乙醛脱氢酶；同工酶；乙醇代谢；底物特异性 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h ) a n da l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ( a l d h ) p l a ya n i m p o r t a n tr o l e i nt h ei nv i v oa l c o h o lm e t a b o l i s mt o g e t h e r t h ei n f l u e n c et oc e n t r a l n e r v o u ss y s t e mc a nb er e d u c e d w i t l lr a p i dd e c o m p o s i t i o na n de n o u g hm e t a b o l i s mo f t h ea l c o h o li n g e s t e di nt h eb o d yf u l lo ft h et w oe n z y m e s i nm o s to fc a s e s ，a l d hi s s c a r e ，w h i l ei nv i v oa d h i sa l w a y se x p r e s s e de n o u g ha n de v e n l y a l c o h o lc a n tb e c o m p l e t e l yd e c o m p o s e dt ow a t e ra n dc a r b o nd i o x i d e ，a n dr e d u n d a n ta l d e h y d ew i l l r e m a i nf o r t h es c a r c i t yo fa l d h ，w h i c hl e a d st ot h ep a l s yo fc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ， d r u n k e ns y m p t o m a l d h 2i saw e l l k n o w nh i g h - l e v e lg e n e t i cp o l y m o r p h i cg e n e ，a n d h a sac l o s ea f f i n i t yt ot h ed r i n k i n gb e h a v i o ro ft h ea s i a n w h i l et h ed r u go f d e - a l c o h o l i ce f f e c t sa n dp r e v e n t i n gl i v e ri n j u r yi sd e m a n d e d i th a saf i n ef o r e g r o u n do f d e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n i nt h i sp a p e r , t h ec l o n ea n de x p r e s s i o no fa l d h 2g e n ef r o mh u m a nw a sr e p o r t e d a l d h 2g e n ew a so b t a i n e df r o mt h eg e n o m ed n ao fh u m a nt h r o u g hp c r t e c h n i q u e s ， a n dc l o n e di n t op u c m - tv e c t o r , a n dd e t e r m i n e db yd n a s e q u e n c i n gs y s t e m a l d h 2 g e n ef r a g m e n tw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i n gs i t e w h i c hw a sg e n e r a t e db yp c r w 弛t h ep l a s n f i dp u c m - a l d h 2a sat e m p l m e ，i n s e r t e di n t oa ni p t g - i n d u c i b l e e x p r e s s i o np l a s m i dp e t 2 2 b ( + ) t h es e q u e n c eo fa l d h 2g e n ei nt h ee x p r e s s i o nv e c t o r w a sv e r i f i e db yd n a s e q u e n c i n ga n a l y s i s t h ee x p r e s s i o no fa l d h 一2w a sa c h i e v e d i nec o l iw i t ha ni p t gi n d u c t i o n i tm a k e sap e r f e c te x p r e s s i o ni n3 7 。ca n di n d u c e d b y im m o l li p t gw h t h i ns i xh o u r s t h et a r g e t p r o t e i ns h a r e d3 0 o ft h et o t a l p r o t e i n so fi n d u c e dc e l l s t h ew a s h e di n c l u s i o nb o d i e sw e r es o l u b l i z e dw i t h8 m o l l l l r e aa n dp u r i f i e du s i n gn i c k e la f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e da l d h 一2w a s r e f o l d e db yd i l u t e d n e s si nr e f o l d i n gs o l u t i o nw i t hl - a r g i n i n e t h e nt h ea c t i v i t yo f r e f o l d e da l d h 一2w a sd e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t p r o t e i nh a sa na l d h s p e c i f i ca c t i v i t yo f3 31 7u m g k e yw o r d s ：a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h ) ；a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ( a l d h ) i s o e n z y m e ；e t h a n o lm e t a b o l i s m ；s u b s t r a t es p e c i l i c i t y 4 人乙醛脱氢酶：基明克隆及表达浙江大学硕士学位论文 论文综述部分 人类乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶的研究进展 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达跚文 前言 在人体内，由乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，a d h ) 及乙醛脱氢酶 ( a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，a l d h ) 共同组成乙醇脱氢酶系，负责催化人体对乙 醇的分解代谢。a d h 及a l d h 都具有多种同 ：酶，它们分别来自对应的基因家族， 各自的家族成员在序列上有不同程度的同源性。目前，已有7 种人a d h 基因和1 2 种人a l d h 基因得到了鉴定。在乙醇代谢途径中，参与乙醛氧化的a l d h 主要有两 种，即对乙醛有中等亲和力的胞质a l d h ( a l d h 一1 ) ( k m z 3 0 p j o _ o l l ) 及以乙 醛为最适底物( k 。= 3 “m o l l ) 的线粒体a l d h ( a l d h - 2 ) 。其中，以a l d h 2 的作用为主。据研究报道，a d h 及a l d h 基因所具有的高度的遗传多态性与人的饮 酒行为密切相关，而a d h 基因的多态性可能是通过与a l d h 2 基因的连锁才能获得表 现的。 1 乙醇代谢途径 在人体的乙醇代谢途径中，首先由a d h 脱去乙醇分子中的两个氢原子，将 乙醇氧化为乙醛：随后发生下一级的氧化反应，即乙醛在a l d h 的催化下脱氢 而生成最终产物( 乙酸) ；乙酸可通过转化为乙酰辅酶a ( c o a ) 而进入三羧酸 循环( 见图1 ) 。通过乙醇代谢途径及三羧酸循环，摄入的乙醇最终可分解为二 氧化碳及水分子。 ， h l ：一f ：。 r n p c i n 己酰辅酶 n a d * n 删l 卅n p m 明+ h i 己醵c 】h 、 脂胁酶娥! 段髋循环 图! 人体内的乙醇代谢途径 f i gl a l c o h o ld e g r a d m i o ni nh u m a nh a st w os u c c e s s i v es t e p s ，t h ef i r s to f w h i c hw a sc o n t r o l l e db ya l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h ) a n dt h es e c o n d o fw h i c hw a sc o n t r o l l e db ya l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ( a l d h ) 春 矿。、 一狒六 擤 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达浙江大学硕士学位论文 若人体内具备充分的a d h 及a l d h ，则能较快的分解乙醇，减少乙醇对神 经系统，尤其是对中枢神经系统的影响，因而即使摄入一定量的乙醇，其所含有 的乙醇也能在很短时间内得到充分的代谢，而不会产生积累。在一般情况下，人 a d h 是可充分表达的，且表达的数量级基本持平。人群内含有较多的a l d h 缺 乏个体，因为a l d h 的缺乏将导致乙醇不能被完全分解为二氧化碳及水，而是 以中间代谢产物( 乙醛) 的形式继续留存于体内，使人在酒后产生恶心欲吐、昏 迷不适等中枢神经麻痹状态，即醉酒症状。 1 1 乙醇的消除反应 乙醇在口服摄入后，在小肠以被动扩散的形式被几乎完全的吸收。在空腹时， 摄入的乙醇在3 0 9 0 m i n 内达到吸收的峰值。影响口服摄入的乙醇的吸收速率的 因素很复杂，包括所服酒精饮料的浓度、人体状态( 饱腹或饥饿状态) 、伴食食 物的特性与组成、胃排空的速率等环境因素及反应酶系的基因型等， 因为乙醇是能与水完全互溶的极性小分子，故乙醇在人体内的分配在很大 程度上受到各器官及组织的含水量的控制，尤其是在平衡状态下。乙醇的总分布 量与体内的总水量之间是成正比的。目前，还没有报道过血浆内存在负责运输乙 醇的载体蛋白。 人体对乙醇的消除反应主要是通过代谢途径来实现的。另外，有少量的乙 醇通过呼吸( o 7 ) 、汗液( 0 1 ) 及尿液( 0 3 ) 分泌所排出。乙醇的消除反 应主要通过在肝脏的氧化，且受到a d h 及a l d h 催化特性的调控。特定情况下， 微粒体乙醇代谢系统( m i c r o s o m a le t h a n o lo x i d i z i n gs y s t e m ，m e o s ) 也与乙醇代 谢及乙醇相关细胞毒素存在一定的联系。 乙醇的消除速率在个体上及种族上均显示了很大程度的差异，其中的部分 原因是编码a d h 和a l d h 的等位基因发生变异，从而产生了具有不同定位及功 能的同工酶。目前已证实，a d h 及a l d h 基因的多念性增加了乙醇代谢在个体间的 筹异。另外，众多的环境因素也能影响乙醇的消除反应，如性别、种族划分、体 质、肝脏容量、食物组成等，甚至可达到超出币常水平2 3 倍的消除速率。 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达浙江大学硕士学位论文 1 2 乙醇在胃肠的吸收及初级代谢 乙醇初级代谢( f i r s t p a s s m e t a b o l i s m ，f p m ) 指的是摄入的乙醇( 即饮酒后) 在胃及小肠被吸收，并经门静脉输入肝脏的过程。由于乙醇在此阶段尚未进入周 边血液循环，故称之为乙醇初级代谢。f p m 具有重要的生理意义，其减少了到 达靶器官的药物量，并减缓了内脏组织对乙醇代谢所带来伤害的易感性。乙醇在 胃肠吸收的途径和在肝脏的相似，包括a d h 及细胞色素p 4 5 0 。摄入的乙醇在胃 中被缓慢吸收，此过程中可能伴随有乙醇的氧化反应。在离开胃部后，乙醇在小 肠中被迅速吸收。通过内脏粘膜吸收的乙醇由门静脉输送至肝脏，在肝脏中一小 部分得到代谢。为了准确获得f p m 的数量，对口服以及静脉摄入乙醇后的血液 乙醇浓度进行了测定，分别计算获得此两种途径的血液乙醇浓度曲线。对各自血 液乙醇浓度曲线以下的区域( a r e au n d e rt h ea l c o h o lc o n c e n t r a t i o nc u r v e s ，a u c ) 进 行积分，发现这两种途具有不同的f p m 值。 l i e b e r 等人在对f p m 的研究中发现，当低剂量乙醇( 0 3 9 l k g 食物) 在胃 的排空速率被伴食食物所减缓时，最容易探测获得f p m 值。而当大剂量乙醇在 胃被迅速排空时，由于a u c 间的差异过小，导致无法精确测定f p m 值。虽然 目前对f p m 现象的研究较多，但其究竟在哪些器官中发生却仍没有定论。有报 道倾向于认为胃是主要的f p m 发生位点，因为在胃粘膜中含有一些与乙醇代谢 相关的a d h ( y - a d h 、z - a d h 及o - a d h ) 。当胃a d h 活性降低时，如对于女性 或萎缩性胃炎患者、嗜酒者及接受药物治疗的人群中，f p m 值是明显降低的。 胃中的主要同工酶a a d h 在3 0 亚洲人群的胃中是缺乏的，而缺乏此同工酶的 人群对乙醇具有较低的f p m 值，说明。一a d h 在乙醇于胃内的氧化作用中具有重 要作用。f p m 与胃的排空速率之间的关系说明，延长乙醇与胃的接触时间，可 使乙醇更好的被胃所吸收，并经由胃粘膜细胞内含有的a d h 所氧化，而快速的 胃排窄过程则具有相反的作用。在饱腹状态下，口服摄入乙醇比在空腹情况下具 有显著增高的血液乙醇含量及a u c 。以上的这些发现都与胃粘膜存f p m 中具有 的重要作用相一致。 然而，也存在一些相反的解释。目前，关于女性的胃a d h 活性或f p m 值 较男性为低的论断就一直存在争议。有研究认为，胃a d h 活性与f p m 值之问 没有任何联系。在口服和静脉摄入乙醇后的a u c 显示，以胃粘膜a d h 活性为 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达 浙江大学硕士学位论文 基础而得胃中得总a d h 活性并1 i 能说明乙醇代谢的数量。另外，人和小鼠o a d h 在动力学特性存在明显的差异。人6 a d h 的k 。值为4 0 m m ，而小鼠相应酶的 k 。值是人的9 倍，但两者f p m 值在数量上却是相近的。这些论据说明，f p m 也 可能在肝脏中发生。肝脏f p m 取决于乙醇被吸收的速率：在低的吸收速率下， 相应的门静脉乙醇浓度也低，乙醇可被k 。值相对较低的肝同工酶所排除；而在 高的吸收速率下，产生了高的门静脉乙醇浓度，相应的肝同工酶将会被饱和。在 实验中，系统的乙醇a u c 对门静脉的乙醇浓度是很敏感的。如此也解释了在高 剂量的乙醇存在时，或在快速的胃排空状态下，f p m 将出现缺乏的现象。 a m l n o n 等人以静脉或十二指肠给乙醇，通过同时对胃及肝脏的f p m 值进 行评估，从而减少了因内部原因而造成的可变性。他们发现，此时的f p m 值大 约是口服剂量时的8 9 ，并估计胃对f p m 值的贡献约为口服剂量的6 。从而 获得如下结论：在总体的乙醇消除反应中，口服摄入的乙醇的f p m 值通常只占 很小的比例( g o ) ，且在快速的胃排空状态下，或当乙醇有高的消耗剂量时， 其在数量上的重要性更低。性别差异在f p m 上似乎并不显著。f p m 的重要性可 能在于胃f p m 对肝脏的保护，及使其他器官免受低剂量乙醇( 及其他阻断f p m 作用的药物) 的潜在作用，从而在摄入小于预期剂量的乙醇后，产生醉酒状态。 1 3 肝脏的乙醇代谢及其调控 在吸收和通过肝脏后，乙醇由肝脏细胞的胞质a d h 及微粒体中的细胞色素 p 4 5 0 i i e l 所催化，开始代谢，火量产生乙醛；生成的乙醛再由a l d h ( 尤其是 线粒体同工酶a l d h 一2 ) 所催化，转变为乙醇代游的最终产物( 乙酸) ：乙酸再 由肝脏释放通过心脏及肌肉，开始三羧酸循环。在乙醇代谢时，由a d h 及 a l d h - 2 所决定的代谢速率可能是关键的，因为此代谢的中间产物本身就具有潜 在毒性。大鼠肝脏的乙醇氧化模型显示，a d h 活性除了受到蛋白自身因素的影 响外，同时也受到底物( n a d h 及乙醛) 的抑制作用。由于肝a d h 和a l d h 的 最高活性是树近的，从而减少了a d h 催化反应的底物积累，使两个酶协调反应， 其所组成的催化酶系对乙醇氧化过程起着整体调控的作用。 大鼠肝脏中的乙醇氧化模型显示，a d h 活性除受全酶活性的控制，同时也 受到n a d h 和乙醛的j 。物抑制作朋。乙醇氧化过程中的肝脏n a d h 水平被测定 9 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达辄张散 是由于在苹果酸盐天冬氨酸穿梭中的第一个酶，苹果酸盐脱氢酶对n a d h 有一 个高的k m 值。这样，在稳定状态下的a d h 在低于其最大反应速度v m a x 下起 作用。在整个过程中的变化对a d h 的总活性也是敏感的。降低的e d , a d h 活性 减弱了大鼠肝脏对乙醇氧化的能力，但酶活性的增加却并不使代谢速率成比例地 增加。这结果被假设为对增加的乙醛氧化的无活性的结果，并且，稳定状态下的 乙醛浓度的增加可能限制了乙醇代谢的速率。在具有显著不同的动力学特性的 a d h 和a l d h 一2 的人群中，乙醇代谢的速率应是受到k 。，v 。的影响，并且对 产物抑制是敏感的。这关系得出了下列的可能性：在某些特定情况下，乙醇代 谢的途径和代谢中间产物的浓度可能改变，但乙醇消除的速率并不改变。 在乙醇消除曲线的拟合线性片段中，从血液中消除乙醇的速率在个体间有 2 3 倍的改变。最近使用一种新的测定乙醇消除速率的方法乙醇钳技术，确定了 个体之间的差异是确实存在的，该方法完全避免了在吸收上不同所造成的误差。 对这种个体差募目前还没有完全地了勰，最为可能的解释是催化乙醇氧化的酶活 性和肝脏容积的差异。对这些同工酶以及其基因的检测揭示出大量的功能上的多 态性，从而造成了对乙醇的不同的反应。 乙醇脱氢酶的基因多态性 人a d h 基因位于4 号染色体的长臂，可编码由同源或异源二聚体构成的同 工酶。人a d h 以z n ”为金属辅基，其同工酶有2 0 余种，常见的包括有a d h l a d h - 5 五种，分别由a d h l a d h 5 基因所编码的五种亚基，即旺、p 、和z 所 组成。其中。a d h l a d h 3 基因的关系密切，其在染色体上的定位相邻近，三者c d n a 序列存在9 4 的同一性。研究还发现，在a d h 2 和a d h 3 基因位点存在多念性，而 a d h i 、4 及5 的基因多态性尚未发现。 对a d h 同工酶动力学的研究发现：由于a d h 3 基因编码产生的7 1 y l 、7 2 y 2 两种同工酶对乙醇的k 。值的差异很小，仅在v 。值上有2 5 倍的差异，从而将 a d h 同1 酶在催化活性上的差异归结于a d h 2 基因位点的多态性。口d h 2 基因所 编码的三种问工酶对乙醇的k 。值分别为3 4 m m o l l ( 1 3 3 1 3 3 ) 、o 9 4 i l l m o i l ( 1 3 2 1 3 2 ) 及0 0 4 9m m o l l ( 1 3 1 d 1 ) ，提示由d 1 p l 组成的同工酶( a d h 2 + 1 1 ) 可能具有最 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达 浙江大学硕士学位论文 重要的作用。但对于乙醇的氧化速率及。值而言，却在由p 2 d 2 组成的同工酶 ( a d h 2 * 2 2 ) 处出现最大值。因此，携带a d h 一2 + 2 2 的个体对乙醇存在很高的 消除率。 2 1a d h 2 的基因多态性 a d h 2 有三个等位基因，即a d h 2 + 1 、a d h 2 * 2 及a d h 2 * 3 ，分别编码p l 、d 2 及 d 3 三种亚基，这些亚基的随机组合可形成六种不同的基因型。p 2 亚基与6 1 、p 3 的区别在于，其第4 7 位氨基酸由组氨酸( h i s ) 取代另两者中的精氨酸( a r g ) 。 此单一氨基酸替换源于a d h 2 * l 及a d h 2 * 3 的第三个外显子中，一个鸟嘌呤( g ) 突变为a d h 2 + 2 中的腺嘌呤( a ) ，并因此产生一个m a c i l l 特异性酶切位点。b 3 亚基与p l 、p 2 的区别在于，其第3 6 9 位氨基酸由半胱氨酸( c y s ) 取代另两者中 的糖氨酸( a r g ) 。此单一氨基酸替换卿! 源于a d h 2 * 及a d h 2 2 的第九令外显子中， 一个胞嘧啶( c ) 突变成为a d h 2 + 3 中的胸腺嘧啶( t ) ，并因此产生一个a l ui 特 异性酶切位点。 2 2a d h 3 的基因多态性 a d h 3 存在两个等位基因，即a d h 3 + l 及a d h 3 * 2 ，分别编码y l 及但亚基， 这两个亚基可组合成三种基因型。y 1 与y 2 亚基的区别仅在于两个氨基酸的不同， 即 1 的第2 7 1 位精氨酸( a r g ) 突变为y 2 中的谷氨酰胺( g l n ) ，及y 1 的第3 4 9 位异亮氨酸( 1 1 e ) 突变为7 2 中的缬氨酸( v a l ) 。其中，对于后一个氨基酸替换， 其源于在a d h 3 + 1 的第八个外显子中，一个鸟嘌呤( g ) 突变为a d h 3 * 2 中的腺嘌 呤( a ) ，并因此产生一个s a pi 特异性酶切位点。 2 3a d h 等位基因频率在不同种族人群中的差异 a d h 2 及a d h 3 基冈位点的多态性在4 i 同种族人群中的出现频率不同。有关资 料显示：a d h 2 + 1 在美国闩人叶1 的出现频率超过了9 5 ，在欧洲白人及美国黑人 中的频率也达到8 5 ，但在东亚黄利r 人( 以闩小人为例) 中的频率仅为1 5 ； 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达辄文 口d h 2 * 2 在日本人中的出现频率为8 5 ，在欧洲白人中的频率为1 5 ，而在美国 人( 包括白人及黑人) 中的频率仅为5 ；a d h 2 * 3 的出现频率除了在美国黑人中 约为1 5 外，在其他人群中的频率均小于5 。a d h 3 + 1 及a d h 3 + 2 的出现频率在 美国白人中均为5 0 ，在欧洲白人中分别为6 0 及4 0 ，在美国黑人中分别为 8 5 和1 5 ，在日本人中则分别为9 5 弄1 q5 。 乙醛脱氢酶的基因多态性 在人体内，已有1 2 种编码乙醛脱氢酶获得了鉴定，常见的包括a l d h 1 a l d h 4 四种，它们由定位于四个不同染色体的独立基因所编码。其中，a l d h 2 位于肝细胞线粒体内，且对乙醛的k 。值较低，一般认为乙醛是其最适底物，而 该酶是催化乙醛氧化的最重要的a l d h 。其余三种a l d h 同工酶均位于肝细胞 的胞浆内，而它们对乙醛的k 。值是a l d h 一2 的1 0 0 1 0 0 0 倍，推测它们在体内 对乙醛的氧化过程并不起主要作用。人a l d h 一2 以四聚体的形式存在，其依赖 于n a d + 完成对乙醛及其它脂肪族醛的氧化反应。编码a l d h 2 的基因a l d h 2 位 于第1 2 号染色体上，其具有高度的遗传多态性，并被认为与亚洲人群的饮酒行 为密切相关。 3 1a l d h 2 基因的多态性 定位于人1 2 号染色体的a l d h 2 基因是线粒体同工酶( a l d h 2 ) 的编码基 因，其与6 0 以上的乙醛代谢有关，可将乙醛转化为毒性较低、无致癌作用的乙 酸。目前己发现a l d h 2 基因至少存在两个等位基因，即a l d h 2 * 1 及a l d h 2 * 2 。其中， a l d h 2 * l 是野生型的隐性等位基因，具有乙醛脱氮酶的活性；后者是突变理的显 性等位基因，没有乙醛脱氢酶活性。a l d h 一2 * 2 亚基是由a l d h 一2 4 1 氨基酸序列 的第4 8 7 位突变( g l u 4 8 7 l y s ) 而形成的。这两个等位基因可组合形成纯合孑 a l d h 2 + 1 1 、a l d h 2 + 2 2 及杂合子a l d h 2 。1 2 的基因型，但只有纯合子a l d h 2 * 1 1 编 码的同工酶才具有显著活性。理论t ，对于杂合子a l d h 2 * 1 2 所编码的a l d h 2 * 1 2 ，其催化活性只有纯合子编码蛋白a l d h 一2 41 1 的6 。 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达浙江丈学硕士学位论文 3 2a l d h 2 基因多态性与脸红反应 研究显示，不同矛| f 族间a l d h 2 等位基因的出现频率存在明显的差异。突变型 a l d h 2 * 2 在高加索人、美国黑人、欧洲白人及美国北部的大部分印第安人中几乎 完全缺乏，但却存在于约5 0 的中国人、日本人及4 0 的美国南部印第安人中。 对于a l d h 2 * 2 所编码的无活性蛋白a l d h 一2 ，其能导致酒后血液中乙醛积聚，刺 激肥大细胞释放血管活性物质，使血管舒张，从而引起脸红、出汗、发音困难、 心动过速、恶心和低血压等症状。 在摄入相同数量的乙醇( o 1 4 0 3 m l k g 体重) 后，在高加索人体内并没有 检测到任何的不适反应，而对于蒙古人种的部分人而言，则将出现脸红或其他轻 度到中度的醉酒症状，如心悸、恶心、轻微头痛、甚至呕吐。这些醉酒症状简称 为脸红反应，丽这神异常的脸红反应是出人先天的餮体差异所导致的。后来有人 发现，蒙古人种对乙醇的不耐受性是因为在该人群内，很多人缺乏a l d h 2 基因， 即缺乏a l d h 一2 ，故该部分人在摄入乙醇后，将造成中问代谢物( 乙醛) 在肝脏 中的累积，从而致使该个体产生脸红反应。迄今，所有被检测的高加索人都含有 a l d h 2 ，且该酶都具有活性( 标记为a l d h - 2 * l 。对应的基因型为a l d h 2 * 1 ) ； 而5 0 的亚洲黄种人【以蒙古人种为主) 则含有无活性的a l d h 一2 ( 标记为 a l d h 一2 + 2 ，对应的基因性为a l d h 2 + 2 ) 。虽然a l d h 2 * 2 也具有与a l d h 2 * 1 一 样的免疫交叉反应，但减弱了其对乙醛的催化氧化作用。a l d h 2 基因位于1 2 q 2 4 2 。 对于突变种a l d h 一2 ，2 ，其编码序列在第1 2 个碱基对处出现一个g a 的点突 变，即单碱基突变 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 。而正是此s h i p 导致了 a l d h 一2 + 2 的第4 8 7 位发生氮基酸替换( g l u l y s ，即g l u 4 8 7 l y s ) ，使a l d h 2 * 2 丧失酶活性。 3 3a l d h 2 2 是显性遗传 在刈a l d h 2 + 2 研究的最初阶段，普遍认为杂合子a l d h 2 ( a l d h 2 * 1 1 2 ) 的表达 是共显性的，其表达量至少有5 0 ，故只自少数的纯合突变( a l d h 2 * 2 2 ) 才失 去了酶活。但事实偏向于说明，此突变引起的脸红反应是显性遗传的，这在家系 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达浙江大学硕士学位论文 调查及对杂合子结构、表达的研究中均得到了证明。c r a b b 等人发现在日本人中， 家系内人群的a l d h 2 基因型与脸红反应表型相对应，个体携带的无活性a l d h 2 4 2 无论是杂合子还是纯合子，此酶都检测不到任何的活性。另外，a l d h 一2 的活性 形式是同型四聚体，丽突变g i u 4 8 7 l y s 影响了四聚体结构的稳定性，进而影响酶 的正常表达。杂合子中4 个摹的结构都处于稳定状态的概率是6 2 5 ( 1 2 1 2 1 2 1 2 ) ，因此在理论上，即使杂合予的j f 常及突变的等位基因具有等量 的表达，其最高6 2 5 的表达量也过小，携带杂合子的个体的相应酶活几乎没有， 喝酒后仍将产生脸红反应。此结果与检测到的亚洲人群中携带a l d h 2 * 2 杂合子及 纯合子基因型总和( 约5 0 ) 、亚洲人群的脸红反应表型数量( 约5 0 ) 致。 3 4 中国人群a l d h 2 基因多态性的研究 目前对a l d h 2 * 2 在人群中的分布频率研究多数集中于日本人，其次是在中国 台湾地区的汉族。也有一两篇关于印度人、匈牙利人、韩国人、巴西人、新几内 亚人、泰国人、柬埔寨人、中国香港地区及上海地区的汉族等a l d h 2 * 2 分布频率， 及世界上其他地区人群内没有发现等位基因a l d h 2 * 2 的报道。但这些报道大多着 重于所报道人群中a l d h 2 * 2 频率与饮酒行为的关系，并未对群体间的a l d h 2 频率 差异进行比较。 罗怀容等人对中国武汉地区的汉族群体进行检测后发现，该人群的a l d h 2 * 2 频率是1 2 ，比其他已检测的东亚黄种人( 日本人除外) 的相应频率都低。猜想 a l d h 2 t 2 在不同地区人群或民族内可能具有不同的频率分布。对来自中国广东、 辽宁、青岛、云南、广西与武汉地区的汉族及广西地区的么佬族与毛南族人群( 共 6 8 8 个体) 进行检测，发现a l d h 2 + 2 频率为1 7 6 6 。结合曹西蓉等人对中国五个 民族的研究结果，发现a l d h 2 * 2 在，“东地区汉族中具有最高的频率( 3 0 9 8 ) ， 且浚地区汉族的a l d h 2 频率与其他群体存在显著差异( p 6 0 9 d ) 中，d l d h 2 * 1 2 基因型携带者患上食管癌的风险高于a l d h 2 2 + 1 1 基因型携带者的1 0 倍。在另一项研究中，丁建华等人在江苏地区人群中也发现了类似结果，即对于 口l d h 2 * 2 基因型携带者，其若大晕饮酒，将显著的增加患上肝癌、胃癌、食管癌 等癌症的风险。 6 3 肝癌 多年来，发现在常年嗜酒的中国人群中，仅有极少数患上肝癌。此现象一 直受到广泛的关注。肝癌的发生是由环境因素及遗传因素的共同作用所致，当化 学致癌物进入机体后，由于不同的个体存在代谢酶遗传多态性及其表达差异性， 从而形成不同的内暴露剂量，最终导致了个体间患癌易感性的差异。因此，在研 究某个环境因子的致癌效应时，必须考虑与之相互作用的基因型，否则将无法获 得合理的评价结果。 在乙醇进入人体后的4 条代谢途径中，参与其代谢的酶主要包括细胞色素 p 4 5 0 i i e l 、a d h 一2 及a l d h 一2 。而对于嗜酒而致癌，第一步的代谢产物( 乙醛) 是其中的关键物质，由于a l d h 一2 与6 0 以上的乙醛代谢相关，故a l d h 2 与肝癌 的关系便显得尤为重要。在我国首次发现了饮酒与肝癌的易感性，其不仅与a l d h 2 基因多态性有关，还与乙醇的摄入量相关。当a l d h 2 * 2 基因型或饮酒因素独立存 在时，这种关联并不显著：只有当a l d h 2 * 2 基因携带者嗜酒时，其患肝癌的危险 性要明显的高于携带a l d h 2 + 1 1 1 基因型的不饮酒者并存在明显的剂量效应趋势。 可能是圆为在a l d h 2 2 基因携带者的体内，a l d h - 2 失活，无法将乙醛迅速的氧化 成乙酸，故长期、大量摄入乙醇后，血液的乙醛浓度将明显的增高及积累，可以 达到携带a l d h 2 + 1 1 基因的少量饮酒者的6 倍或以上，而血液乙醛浓度的升高最终 可导致肝细胞癌变危险性的增加。 研究还发现，a l d h 2 * 2 基因的分布频率与乙型肝炎病毒( h e p a t i t i s1 3v i a l s h b v ) 的感染在地理分布上有一定的连锁关系。a l d h 2 * 2 分布频率高的地方也f 是乙肝病毒流行的地方，山于患乙肝或饮洒过度都会缩短人的寿命，故在乙肝病 毒流行区域内，人体a l d h 一2 活性缺失可能是一种适应忭的进化，如此抑制了人 的饮酒行为，从而改善人的生活质量。另有报道指出，a l d h 2 * 2 基凼携吊者也是 人乙醛脱氢酶2 基因的免隆及表达浙江大学硕士学位论炙 h b s a g 口h 性时，其长期、大量饮酒后发生肝癌的危险性呈现明显的相乘效应，其 与携带a l d h 2 * 1 1 基i n n _ h b s a g i j f l 性的少量饮酒者相比，发生肝癌的危险性竞升高 t 5 2 1 7 倍。研究表明，应将这种对象作为肝癌的重点高危人群，进行定期医学 随访。同时，在肝癌高发区的长期饮酒者中开展a l d h 2 基因型及h b s a g 检测，将 有助于对肝癌高危人群进行筛选，通过卫生宣教与行为干预，从而降低肝癌的发 病率。 参考文献 1 a m m o ne ，s c h a f e rc ，h o f m a n nu ，e ta 1 d i s p o s i t i o na n df i r s t - p a s sm e t a b o l i s mo f e t h a n o li nh u m a n s ：i si tg a s t r i co rh e p a t i ca n dd o e si td e p e n do ng e n d e r ? c i n p h a r m a c o lt h e r ，1 9 9 6 ，5 9 ( 5 ) ：5 0 3 - 5 1 3 【2 b e d i n os ，t e s t o mg ，a n do b e nek i n e t i cb e h a v i o u ra n dp r o p e r t i e so fa l d e h y d e d e h y d r o g e n a s ef r o mr a tt e s t i sm i t o c h o n d r i a e f f e c to fm g 斗i o n s n t ，b i o c h e m 1 9 9 2 ，2 4 ( 7 ) ：1 1 7 5 1 1 8 2 3 b o o n y a p h i p h a tp t h o n g s u k s mp ，s r i p l u n gh ，e la 1 l i f e s t y l eh a b i t sa n dg e n e t i c s u s c e p t i b i l i t ya n dt h er i s ko fe s o p h a g e a lc a n c e ri nt h et h a ip o p u l a t i o n c a n c e r l e t t ，2 0 0 2 ，1 8 6 ( 2 ) ：1 9 3 1 9 9 4 b o s r o nw f ，l itk ，v a l l e ebl n e wm o l e c u l a rf o r m so fh u m a nl i v e ra l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ：i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa d h i n d i a n a p o l i s p r o c n a t l a c a d s c lu s a ，19 8 0 ，7 7 ( 10 ) ：5 7 8 4 5 7 8 8 【5 】b o s r o nwf m a g n e slj ，l itk k i n e t i ca n de l e c t r o p h o r e t i cp r o p e r t i e so fn a t i v e a n dr e c o m b i n e d i s o e n z y m e so fh u m a nl i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e b i o c h e m i s t r y ，1 9 8 3 ，2 2 ( 8 ) ：1 8 5 2 18 5 7 【6 】b o r s o nw f ，l itk g e n e t i cp o l y m o r p h i s mo fh u m a nl i v e ra l c o h o la n da l d e h y d e 人乙醛脱氢酶2 基因的克隆及表达浙江大学硕士学位论文 d e h y d r o g e n a s ea n dt h e i rr e l a t i o n s h i p t oa l c o h o lm e t a b o l i s ma n da l c o h o l i s m h e p a t o l o g y ，1 9 8 6 ，6 ( 3 ) ：5 0 2 5 1 0 7 】b r o z i a kw k o s l e yl l ，a n dp i e t r u s z k or h u m a na l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ： c o e n z y m eb i n d i n gs t u d i e s b i o c h e m i s t r y ，1 9 8 9 ，2 8 ( 1 3 ) ：5 3 6 7 5 3 7 3 8 】c