（光学专业论文）微流控生物芯片pcr实时荧光检测装置及其微型化研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t t l l er 1 二p c rd 嘶c ei sd e s i g n e df o rb 舾i cb i o c h e m i c a la m l y s i s ni sa p o p m 缸d e t o c t i o n 协：h n i q u ef o rb i o 孤a l 如c a ld e t e c t i o a p p l i c a t i o n sb e c a l l s e o f “ss e l e c t i v i 哆a n dh i g h s e 璐m v 时an u o r e s c 饥c em o l e c u l ec o m e si n t 0b e i n gw h 锄a d n ae x p 跖do n c e s o 也e n u o r c s c 锄c es i 弘a 1i ss 那l l r o u s 谢山也ep c rr e a c t a n t e a c hn u o r 铝c e n c es i g n a li s d e t e 吐c db ym es y s t e m an e ws c h e m ef o ri n t e 毋钳e do 砸c a ln u o r e s c e n c es e n s i gi sp r e s 衄t 酣i nm i sa n i c l c ，蹰d 血ed e s i g no fi z l t e g r a t e dm i c r o o p t i c a 王s y s t 锄f b rf l u o r 髓c 髓c ed e t e c t i o n 缸面c r o 矗试d i c s y s t e i n s i s p o i n t e d o u t t h ed 岫t i o ns 蜘锄i sc o m p o s c do f 岫l i g h ts o u r c e ，m m m o d c 五b r e ，劬疵咖c e f i l t 豇心ed e e c t i o n 毋，s t e ma n dt l l es o f t w a 弗c o n t f 0 1s y s t 锄，t 丑e1 远h ts o u r c ei sh a l o g l 锄p l i 班t 丘d mah a l o g e l ll 锄pi sc o 印l e dt h r o u 曲m ef r b r e s w h 吼n u o r e s c e n t p a n i c l e sp a s sa c r o s st h eo p 廿c a lw i n d o t l l e ya r ee x c i t c db yt l l el i g h to fa na p p r o p r i a t c w a v e i e n g m ( 4 7 5n m ) t h ee l i t t e d1 i g h t ，砌c hi so f l o n g e r 啪v e l e n g t h ( 5 3 0 蛐) ，i s t r 赶m i t 【e 也v i aad e t e c 石o n 丘b r e 孤da nh t 盯f 打e n c e 矗i t e r ( 5 3 0 衄) ，t 0ap h o t o d i o d e t h e i n i c r o n u i d i cc h a l l n e l sa r c1 0 0 吼埘d ea n d5 0 埘n d e e p t h ct e c h o l o g yd e s c 曲e di t h i ss t u d yi sp o t e i l d a l l y 叩p h c a b i et 0ar a n g eo f n u o r e s c e n c e d 咖t i o n k e y w o r d s ：r t - p c rf i u o r e s c 髓c ed e d o 丑，b i o c b j p ，m i c r d c h a 姐e 】，r s 2 3 2 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得2 塞王些太堂或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：研约叉日期：。6 ：；口 关于论文使用授权的说明 本人完全了解j e 室王些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：芦铀文导师签名：1 焉、泻日期：2 越s ；。 第一章绪论 1 1 本课题的研究实旨 第1 章绪论 聚合酶链式反应( p c r ) 是一种在体外模拟自然d n a 复制过程的核酸扩增技 术，即无性细胞分子克隆技术，其原理类似于天然d n a 的复制，是体外酶促反应选 择性地合成特异性d n a 的一种方法。 早期撮成功的应用领域是获取某一目的基因。但用于基因诊断有许多局艰性 其一是不能准确定量：二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假阳性。为克服上述 不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿菅酶降解法等，但均 不很成功，直到最近荧光能量传递技术( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ，f r e t ) 应用于p c r 定量后，上述问题才得到较好的解决。目前国内外 普遍使用的、基于荧光能量传递技术的荧光定量p c r 技术有 2 ，3 ：t a q m a n 技 术、a i n 2p l i s e n s o r 技术、m 0 1 e c u l a rb e a c o n 技术( 分子信标) 、l i g h t c y c l e r 技术c 。m p l e xp r o b e s 技术( 复合探针法) 。通过对上述几种p c r 定量技术的分子 生物学理论和技术特征分析，可以作出这样的诊断：尽管上述几种p c r 定量技术 在生物工程技术层面上的原理方法各不相同，但它们的荧光发光机理以及发光目 的都是破坏两个荧光分子间的f r e t ，从而发出荧光，荧光强度与溶液中模板量成 正比，根据荧光强度以及强度相对变化的信息，可对p c r 产物进行定性定量分析。 因此，以量值溯源的要求对p c r 定性、定量分析的荧光检测进行研究将从根本上 提高p c r 定量技术的精确性和可靠性【l 。 实时定量r t p c r ( r e a 卜t i m er e v e r s et r a n s c r i p t i o nq u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r e a 卜t i m er tp c r ) ，所谓实时定量p c r 是指在p c r 指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此 推断目的基因的初始量。 p c r 芯片结合了其他类型的基因芯片体积小却可以检测大量基因和p c r 容易 发现各种基因变异的特点，采用与其他基因芯片以分子杂交为基础明显不同的， 以p c r 为基础的检测方式，克服了杂交技术所存在的内在缺陷，大大增强了敏感 性和稳定性。自1 9 8 5 年问世以来，因其灵敏度高、特异性强、快速准确的特点 性和稳定性。自1 9 8 5 年问世以来，因其灵敏度高、特异性强、快速准确的特点 北京工业大学理学硕士学位论文 被广泛应用于病原体的诊断和鉴别，p c r 芯片适用于特定基因或基因片段为目的 的生命科学、医学工程、遗传学，对于人类、动物和植物等各种生物的多种基 因的基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定，在临床肿瘤和白血病的诊断、人类 基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的诊断、动物和植物基 因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景5 羽。 常规p c r 扩增仪，存在着热容大、加热速度和冷却速度慢、样品耗用高等缺点。 通常完成一个扩增循环通常需要几到十几分钟，因此对于3 0 个循环的扩增过程需 要花费数个小时，而且对于反应物的需求量大。于是随着p c r 技术的广泛应用以 及m e m s 技术、微流控芯片技术的发展，p c r 微流控芯片的研制得到了越来越多的 关注和发展。p c r 微流控芯片具有很多优点例如能降低热容量、缩短扩增和分析 时间、提高分析速度、对于样品的消耗量小、以及低廉的造价和可抛弃性。 1 2 本课题的研究背景 1 2 1 微流控生物芯片 微流控芯片早期是从m e m s 技术发展而来的，是作为1 9 9 0 年提出的u t a s 主要发 展方向，在2 0 世纪9 0 年代中期迅速崛起的。它主要是在分析化学的学科领域发展 起来的。微流控芯片的目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、 反应、分离、检测等集成在可多次使用的微芯片上，因此较微阵列芯片应用有更 广泛的适用性及应用前景。 微流控芯片的结构与功能特征 微流控芯片在装置上的主要特征是其容纳流体的有效结构( 包括通道、反应 室和其他某些功能部件) 至少在一个维度上为微米级尺度。与宏观尺度的试验装 置相比，微流控芯片的微米级结构显著增大了流体的面积体积比例。这一变化 在微流控系统中导致系列与物体表面有关的，决定其特殊性能的特有效应，其 中影响的分析性能主要包括： 层流效应 表面张力及毛细效应 快速热传导效应 一2 一 第一章绪论 扩散效应 这些效应大多数使微流控芯片的分析性能显著超过宏观条件下的分析体系， 一般说性能的改善主要包括“ 分析装备的体积减小 分析装备更加集成化、自动化 分析效率显著提高 试样和试剂消耗显著下降 微流控芯片可成为微阵列芯片的进样与试样前处理系统，而微阵列芯片可成 为微流控系统的专用传感器。 1 2 2p c r ( p o l y m e r a s ec h a j r e a c t i o n ) 聚合酶链式反应 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i 叽，聚合酶链式反应) 是8 0 年代中期发展起来 的一种在体外模拟自然d n a 复制过程的核酸扩增技术，即无性细胞分子克隆技术， 其原理类似于天然d n a 的复制，是体外酶促反应选择性地合成特异性d n a 的一种 方法。反应步骤是人工合成一对寡核苷酸引物与特异扩增d n a 片段两条链的两端 序列分别互补，由高温热变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，循环进行，使 d n a 片段得以迅速扩增。在合适条件下，这种循环不断重复，前一个循环的产物 d n a 可作为后一个循环的模板d n a 参与d n a 的合成，使产物d n a 的量按2 力方式 扩增。从理论上讲经过3 0 次的循环应，d n a 扩增倍数为1 0 6 1 0 9 。因此，能用 微量样品获取目的基因。目前，该技术被广泛的应用于以获得特定基因或基因片 段为目的的生命科学、医学工程、遗传科研、临床诊断、免疫学和动、植物学等 多个领域【9 。1 1 】。 p c r j 忌有敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优势。最初的 体外核酸扩增技术设想由k o 砌a 于1 9 7 1 年提出，1 9 8 5 年美国p e 。c e t t l s 公司人类遗 传研究室的m u l l i s 等将这些设想变为现实，发明了聚合酶链式反应。之后，经过 k e o h 趿o g 、s a i k i 等人的改进后，p c r 支术得到了广泛的应用，并给生物学和医学 带来了一场革命。1 9 9 3 年m i c h a e ls i i l i t l l 和k a r ym l l l l i s 凭借该项技术荣获了的诺 贝尔化学奖。p c r 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一d n a 片段于数小 时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、 北京工业大学理学硕士学位论文 甚至一个细胞中扩增出足量的d n a 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才 能做到的事情，用p c r 几小时便可完成。p c r 技术是生物医学领域中的一项革命 性创举和里程碑。 p c r 的三个反应步骤反复进行，使d n a 扩增呈指数上升。反应最终的d n a 扩增 量可用y = ( 1 + 石) ”计算。y 代表d n a 片段扩增后的拷贝数，x 代表平均每次扩增效 率，n 代表循环次数。 p c r 扩增技术的基本原理类似于d n a 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序 列两端互补的寡核苷酸引物。p c r 过程有以下三个基本步骤组成，如图2 一l 。 图卜1p c r 扩增过程 f j 9 1 - 1 p c rr e a d i o n 图卜2p c r 扩增过程 f 1 9 1 2p c rr e a d i o n ( 1 ) 模板d n a 的变性：模板d n a 被加热至高温9 5 左右经过一定时间后，模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 分解成为两个单链，以便与引物结合； ( 2 ) 模板d n a 与引物的退火：温度降至5 0 左右时，引物与模板d n a 单链的互补 序列配对结合： ( 3 ) 引物的延伸：升温至7 2 左右，模板d n a 与引物的结合物在t a q d n a 聚合酶 的作用下，以d n t p 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 第一章绪论 原理，合成一条新的与模板d n a 链互补的半保留复制链。新的半保留复制 链再重复经过交往一退火一延伸三个过程，就可以复制出更多的半保留复 制链【l2 】。 1 2 3 实时定量鬣r _ p c r 的定量原理 实时定量r t p c r ( r e a l t i m er e v e r s et r a n s c r i p t i o nq u a n t i t a t i v e p o l y 册e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r e a 卜t i m er t p c r ) ，所谓实时定量p c r 是指在p c r 指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此 推断目的基因的初始量【1 3 】。 最常用的是用荧光标记基因探针。在反应的过程中荧光素会整合到p c r 产物 d n a 中，采集荧光作图像分析，通过d n a 含量可以获知标本中变异( 癌) 细胞的数 量。这种方法使分析可以在反应过程中进行，而不必等到反应完成，称为实时 ( r e a l t i e ) 定量法。克照了p c r 后期d n a 造成不再成倍扩增的平台效应。p c r 基因芯片的微反应池制备成透明端面，透过端面可以测定各个微反应池p c r 反应 的强度。透明的端面可供激发和采集荧光信号。荧光出现的时间表明p c r 产物出 现的时闯，图像分析系统将荧光数据采集入计算机，处理数据。图像采集系统随时 采集各个微反应池中荧光亮度的数据，随着反应进行，随时确定是否出现阳性反 应，并且定量分析【1 4 1 。 实时定量r t p c r 的发明归功于2 个重要发现一是发现d n at 8 q 酶有5 啼3 外切酶活性；二是利用荧光能量传递技术【1 5 】( f 1 u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ，f e r t ) 构建了双标记寡核苷酸探针，即t a q m a n 探针。 在p c r 过程中，这些荧光信号可以被探涮器即时捕获，电脑软件可用过等式 r n = r 矿一丑n 一计算砌，其中月矿是表示每点测量的荧光强度，r h 一表示荧光 基线强度，砌的值表示p c r 过程中，探针降解的量，也即p c r 产物的量。以r 行 的值对循环数作曲线，选择一个荧光阈值，荧光达到荧光闺值的循环数叫做阈值 循环数( t h r e s h o l dc y c l e ，c 。) ，而c 。值随这起始模板量的增加而线性降低，从 而可以通过c 。值推算起始模板量。该方法的特异性由引物和探针的特异性所决 定，只有p c r 过程中探针退火到目标片段才能发出荧光信掣”l 。 实时p c r 技术较之以前的以终点法进行定量的p c r 技术具有无与伦比的优势。 北京工业大学理学硕士学位论文 首先，操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在 封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性。再次，由于 在p c r 扩增过程中能实时监控p c r 扩增情况，可以及时调整反应参数。最后，由于 传统的r t p c r 方法对基因的定量是在p c r 扩增和电泳后，扫描条带，根据颜色的 深浅而定量，误差较大，而实时定量r t p c r 技术用软件进行分析避免了接触e b 【l7 1 。 目前，它作为一种极有效的实验方法，已被广泛的应用于分子生物学研究的 各个领域，最近几年不少学者应用r e a 卜t i m er t p c r 来检测各种细胞因子m r n a 表达水平，从分子水平来研究机体免疫水平和免疫调控机制。 1 2 4 微流控芯片中的聚合酶链反应 m a n z 18 的研究组提出了聚合酶链反应( p c r ) 微流控芯片扩增反应器。芯片 上的通道每个循环经过由三个加热铜块提供的p c r 变性、退火及延伸温区，总共 循环2 0 次。用此装置最快时9 0 秒后即可得到扩增的d n a 试样，不但仪器体积缩 小，减少了试样和试剂消耗，还提高了扩增速度。p c r 芯片还同时提供了与d n a 测 序芯片联用或集成化的可能性。w 0 0 1 l e y 1 明等则使用一个集成在芯片微通道入口 处的可变温反应室进行p c r 扩增与和毛细管电泳联用。反应物加入p c r 反应室后 计算机控制反应室温度，2 5 3 0 秒完成一次扩增循环。扩增与分离全过程在2 0 分钟内完成。 1 9 9 8 年k o p p 【2 0 】等首次报道了连续式芯片p c r ( c o n t i n u o u sf l o w t h e r m o c y c l i n gp c rc h i p ) 此后，c h o u 等口“，s o p e r 等蠲，z h a n g 等跚，刘金 华等 2 4 】也相继对连续式芯片p c r 进行了研究。 连续流式芯片p c r 反应器基本结构如图卜4 所示，通过微加工形成逶迤形流 路。在一定的推动力作用下，当p c r 反应混合液流经三个不同温区时，自动变温， 在流动中实现变性、退火和延伸反应，完成扩增【2 5 】。 一6 一 第一章绪论 图卜3 连续流式p c r 微流控芯片温控单元 f i 9 1 - 3t e r n p 甜a t u c o n 廿o u e r f o r c o i 曲帅a 璐f l o w p c r b i o c h i p 微型化的芯片p c r 不仅节约空间和试剂，其优点还表现在口8 ： ( 1 ) 加热和冷却系统体积小，热容量小，可达到较高的( 1 5 4 0 s ) 的 加热和冷却速率( 而常规p c r 热循环仪的速率仅为2 1 0 s ) 。 ( 2 ) 由于尺寸的缩小使锝比表面积增大，增加了热传导效率，大大缩短了 p c r 反应时间。 ( 3 ) 易于集成化。不仅可以通过薄模沉积和微加工技术在芯片底部将控温 单元的各部件集成为薄膜电阻，紧贴于液体样品，进行热传递。还可将p c r 扩增 系统与其他操作系统集于一体，实现整个实验室的微型化、自动化，提高分析速 度。 我们通过表( 卜1 ) 对p c r 扩增仪与p c r 微流控芯片进行了多方面比较2 9 】： 表( 1 - 1 ) p c r 扩增仪与p c r 微流控芯片对比 t 曲l 1 ) p c rs 羚妊匝v sp c rb i o c 印 p c r 扩增仪p c r 微流控芯片 检测对象基因基因 检测品种单一检测同时多项检测 由光纤光谱仪和微机分析能确定 结果分析电泳分析不能确定其特定序列 其特定序列 效果有一定假阳性和漏检率准确、灵敏、可靠 检测时间约3 4 小时约十几分钟 成本高( 4 0 2 0 0 万元)低( 1 0 万) 消耗试剂需扩增至5 0 一1 0 0 n g 数量级需扩增至p g 数量级 北京工业大学理学硕士学位论文 p c r 微流控芯片系统的总体结构主要由进样单元，p c r 反应单元、温控单元和 检测单元组成，如图卜2 所示： 图卜4p c r 微流控芯片结构图 f i 9 1 4l a b - o n - a h i pf o rp c r ( 1 ) p c r 反应物：参加p c r 反应的物质主要有五种即引物、酶、d n t p 、模板和m 9 2 + 。 这是p c r 反应五要素【3 0 1 。 ( 2 ) 进样单元用于控制反应物的引入和混合，以及微流体的驱动和控制，通过 对通道内流体的操控，完成芯片系统地分析功能。 ( 3 ) p c r 反应单元是指进行p c r 反应的微室或微通道。 ( 4 ) 温度控制单元用于对p c r 反应过程中的温度变化进行控制， 1 2 5 荧光标记信号的产生 荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰，在光的刺激下，荧光基团吸收光的 能量后通常以三种方式释放能量【3 1 。3 4 】，见图( 卜5 ) 。 1 ：光能许多荧光基团吸收光能以后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰 值大于吸收峰。 2 ：热能某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中，如d a b c y l 3 ：转移给临近的分子当临近的分子满足发生能量转移的要求时，能量从荧光基 团传递到临近的分子。 荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。 ， ， 光能 热能 、转移给临近的分子 第一章绪论 图卜5 荧光基团能量释放 f 远1 - 5 r e l e a s ee n e r g y 图卜6 荧光受激发射更长波长的发射光 f i 9 1 6 f l u o r e s c e n c es p e c 砌 荧光是物质在吸收光能以后产生的辐射光，因此，待测样品的荧光强度与样 品的吸收系数、量子效率和浓度有关。假如入射光以每秒钟每平方厘米的光强 i a 照射至样品溶液中，它所产生的荧光强度f 可表达为： 厂t、 卜k q h l 者j _ l 迥1 0 咖 卜1 式中q 是荧光物质的量子效率，i 。是激发光强度；i a 为荧光物质吸收的光 能，e 是荧光物质的摩尔吸收系数；b 是吸收光程；c 是荧光物质的浓度；k 是 与收集效率，传输效率等因素有关的常数。 当其它条件保持不变时，荧光强度正比于荧光物质的浓度，这是荧光检测 的定量基础。需要指出的是，公式( 1 1 ) 是一近似表达式，是在样品浓度很稀 的情况下下( b b c 0 0 5 ) 推导出的，也就是( 1 1 ) 式仅适合于低浓度的样品检测。 当曲c 0 0 5 ，f 和样品浓度c 不再成线性关系。对于较浓的溶液，荧光强度不仅 不随溶液浓度增加而加大，反而呈下降关系。 1 2 6 荧光p c r 的检测流程 北京工业大学理学硕士学位论文 1 3 论文结构 i 在扩增过程中检测荧光强度变化 l 篱耄警；鬻蕾番；鲨。；l 溢；警；湓蕊；誉l 罨虿蔷；篮黼蓄譬；湓蕊；蓄；i ；。i 图卜7荧光p c r 的检测流程口5 】 f i g l 6 1 1 l en o wc h 碰o f f l u o r e s c e n c ef o rp c rd e t e c 廿0 n 本论文按照课题研究过程安排如下： 第一章：绪论 第二章：一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 第三章：p m 姒基微流控生物芯片p c r 荧光检测装置微型化初探 冈恻罔尉 第二章一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 第二章一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 2 1 荧光检测的国内外相关领域的现状、研究成果及进展分析 2 1 1 荧光检测 检测的三部分： 光源：卤素灯l e d l d 被探测体：荧光素 探测器件：光敏二极管仨极管硅电池光电倍增管c c d 根据光源可以将荧光检测分为两类坷 1 激光诱导荧光检测器( l a s c r i n d u c e dn u o r e s c e i l c e ，u f ) ：其特点是灵敏度 高。这种方式的缺点是大多数分离以后的物质并不具有荧光特性，因此必须通过 衍生化的处理，这就增加了检测的步骤，降低检测的效率。此外，通常的激光诱 导荧光检测器的体积较大，结构较复杂、成本较高。 j i a n g 等报道采用1 1 2 w ，发射波长为635 的红色半导体二极管激光 器和光电倍增管构成的共聚焦型高灵敏l i f 检测器，对染料c y 一5 的浓度检测限可 以达到9 p m 0 1 l 图2 1 共聚焦型l i f 检测器的结构示意图鲫 f i 9 2 1o p d c a ls e t u p0 f 也cc o n f o c a l1 粘盯s c 蛐i n g 商c r o s c o p e 北京工业大学理学硕士学位论文 共聚焦型l i f 检测器常由共聚焦荧光显微镜作为光学系统，主要由二向色镜 ( d i c h r o i cm i r r o r ) 、聚光透镜、干涉滤光片等构成。激光束经扩束准直，由二 向色镜反射并由显微物镜聚焦后垂直照射到芯片的检测区域，激发产生的荧光经 二向色镜透射，并由与显微物镜同轴且共焦的显微目镜聚焦，再经干涉滤光片进 一步滤除干扰光后成像在光检测元件上进行检测，其中二向色镜是光健的光学元 件，起到对激发光和荧光的有效分离作用。 多道扫描荧光检测技术：s h i 眺瞎设计了一种旋转式扫描的共聚焦激光诱导 荧光四色检测器。通过步进电机准确控制驱动检测器的旋转式扫描光学物镜在芯 片的下方作圆周运动，依次扫描芯片每组电泳通道检测区域。 另外还有一些非共聚焦的荧光检测器【3 9 斟】。 2 l e d 荧光检测器：应用于芯片毛细管电泳( 蜘p b a s c dc 印i 1 1 a r ye l e c 仃d p h o r c s i s ) l e d 荧光检测器 一种以发光二极管为激发光源的荧光检测器 n娆幽g n i 吐c 积n d 擎) ；4 。光涮i “j d e ) 。5 捻 ll测池f c e l l ) ；6 池纤【印如a 】6 b e 订；7 谐光片 _ ( f n l c r l ；8 毙电髂蹭管烈踊 图2 2 光学系统示意图 f i 9 2 2 s c h c m a t i cd i a g r a mo f l h eo p d c a ls y s t e m 杨丙成等人【4 5 】报道了一种利用高亮度发光二极管作为激发光源组装了一荧 光检测器并应用于毛细管电泳检测；激发光斑与毛细管检测池的耦合通过透镜加 光阑组合方式实现；光纤用于收集并传输荧光信号，增加了光学系统的灵活性 和紧凑性；光阑、检测池和光纤之间的校准简单、方便；用荧光素和异硫氰酸荧光 素衍生的氨基酸考察了体系性能，最小检测浓度为0 1 8 u m o l l ( s 小= 5 ) ，在 2 1 0 7 叫1 0 5 m o l l 范围内表现出较好的线性关系( r = o 9 3 3 ) ，结果表明该系统 灵敏度达到了普通荧光检测器的指标。 第二章一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 从l e d l ) 发出的光束通过两个平凸透镜( 2 ) 准直、聚焦，通过一直径o 2 m m 光 阑( 4 ) 与毛细管检测池( 5 ) 耦合。其中，l e d 与透镜、透镜与光阑之间的位置可调。 光纤( 6 ) 用于收集并传输荧光信号，经干涉滤光片( 7 ) 进入光电倍增管( 8 ) 。使用光纤 不但增加了光学系统结构的灵活性，而且可以使处于光纤“终端”的电学部件远 离c e 的高压电源，消除高压电源对检测信号的干扰。激发光路、检测池和发射光 路之间的校准通过自制校准器件( 3 ) 实现，很好地解决了三者之间的校准问题，使 用和装卸都很简单。 2 1 2 商用的r 卜p c r 检测仪器 1 p e 公司生产的a p p l i e db i o s y s t e m 阳 ( 1 ) a b ip r i s m7 7 0 0s e q u e n c ed e t e c t i o ns y s t e m ( s d s ) 用激光激发荧光，并且 在5 0 0 6 6 0 n i n 范围内调节波长，一次可测定9 6 个样本，一批样本2 个小时。但是不 能实时对扩增结果进行分析。 ( 2 ) g e n ea m p5 7 0 0s d s 原理同上，但是采用卤素灯为激发光源。 2 r o c h e 公司生产的l i g h t c y c l e r 热循环仪 可装载2 0 u l 的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光 源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光。 3 s t r a t e g e n e 公司的m ) 【4 0 0 0 l t i p l e x 这种仪器的检测波长可在3 5 0 7 5 0 响 范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括t a q m a n 探针、 杂交探针和分子信标( m 0 1 e c u l a rb e a c o n ) 4 c o r b e r tr e s e a c h 公司的r o t o r g e n e 具有双光源系统，蓝光在4 7 0 加处激发荧光，绿光在5 3 0 衄波长激发荧光；具有两 种样品盘3 2 孔和7 2 孔供选择，可以对多种荧光材料进行测定。 2 2 实时荧光检测装置 光源为卤素灯，光通过聚光系统，聚光系统由两片石英平凸透镜组成( 中2 5 4 焦距7 5 衄) 将光束聚焦，然后通过分光系统( 由有色玻璃和干涉滤光片组成，波 长4 7 5 n m ) 。过滤后的光束经过光纤的传输照射到生物芯片中扩增后的荧光p c r 反 应物上，激发反应物发出荧光。被激发的荧光经过光纤传输到到聚光系统( 由两 北京工业大学理学硕士学位论文 片平凸透镜组成中1 0 焦距1 0 m m ，k 9 光学玻璃) ，通过滤光系统的5 3 0 n 左右的光束 聚焦之后进入光电倍增管获得相应的电流信号。通过步进平移台的移动实现对不 同位置的荧光反应物的检测，从而达到实时检测的目的。采用此系统可以对p 删a 基微通道中的p c r 反应物进行检测。系统的整体结构图见图2 1 。 巨卜固 数据采集卡 撇目 - 1 【j 1 接口 i _ l 电机控制卡l 一 a 整体实物图 a t e s 廿n gm a c h i n ep in l l r e 图2 3 系统的整体结构图 f i 贮3s y s t e mf r 锄e w o r k b 机械与电子部分 b m e c h a i l i c a la n de l e 吐r 0 1 1 i cs y s t 唧 第二章一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 c 于避光环境下测试 c e x p e r i e n t a t i o nw i t ht h eg o b o 图2 4 荧光检测装置整体实物图 f i 9 2 4t e s 血gm 舢ep i c 慨 通过步进平移台的移动实现对不同位置的荧光反应物的检测，从而达到实时 检测的目的。步进平移台的主要机械构件为丝杠。通过划片和导轨可以灵活调节 丝杠在任意方向上的位置，实现对微流控：占片检测。 在进行光的测量时，为了避免外来光线的干扰，需要在暗室里进行测量，如 图2 - 2 c 所示。 2 3 光学系统 2 3 1 校准光路 生物芯片多光路校准光纤p c r 荧光检测装置：由于微流控生物芯片的荧光 p c r 检测的重复性、稳定性要求很高，在检测系统建立时使用了多光路校准光纤 p c r 荧光检测装置。 一般的检测装置的光路是光源，p c r 反应物，激发的荧光光电检测器件接收。 这种只有激发光路的单光路荧光检测缺点：光电接收器以及电路等方面易受温 度、电磁、电压以及本身质量的影响，产生不可避免的信号漂移，并且由于该信 号漂移带有很强的随机性，同时荧光p c r 反应物也存在荧光强度漂移情况。因此 单光路检测的重复性、稳定性都存在着极其严重的问题，从而极大影响该类检测 仪的测量精度。 所谓校准光路是指在直接连接光源与光电检测器的一条光路，由光纤构成a 所谓校准光路是指在直接连接光源与光电检测器的一条光路，由光纤构成a 北京工业大学理学硕士学位论文 在检测生物荧光p c r 反应物之前，先将光电检测器上接收到的校准信号与上一次 的校准信号相比较可以得到仪器的信号漂移量，同时上次检测生物荧光的信号强 度与校准信号强度之比作为此次检测的依据，通过微机处理校准此次正式检测生 物荧光信号的标准曲线。通过快门控制激发光路和校准光路的使用顺序。校准光 路上设有自动光强增减装置，可根据光电检测器的灵敏度变化调节校准光路的光 强，这样校准光路的光强不会在高灵敏度时使光电检测器产生满量程校准信号， 也不会在低灵敏度时产生零校准信号。 2 3 2 光源对荧光检测的影响 瑙 奎 瞧”o 芸 裂2 5 0 2 d a 1 5 0 1 5 w3 0 w5 a w7 5 w 光源 图2 5 不同功率光源条件下荧光检测数据 f i 9 2 - 5e x p e r i m e n t a lr e s u h s 谢t l ln 坞c o n d i d o no fd i f r e r e n tp d w 盯 从图中我们可以看出，随着光强与荧光值成正比。 2 3 3 分光滤光片的研究 由于荧光背景直接影响荧光检测，因此在分光滤光片的组合研究方面十分必 要。根据不同的材料和膜系做出了许多不同的有色滤光片和干涉滤光片，并对它 们进行了研究。 1 两片滤光片为干涉滤光片中心波长为4 7 5 衄 2 滤光片为干涉滤光片中心波长5 3 0 n m 3 滤光片为干涉和两种有色玻璃滤光片中心波长4 7 5 n m 4 滤光片为三片两种有色玻璃滤光片中心波长5 3 0 m 滤光片光谱扫描图如图2 4 、2 5 、2 6 、2 7 所示 波长( n m ) 图2 61 号滤光片光谱扫描图 f i 9 2 - 6 t h e 恤m 踞l i s s i o no f 雒i n t e r f 咖团t e r 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 06 0 06 5 07 0 0 波长( n m ) 图2 72 号滤光片光谱扫描图 f i 9 2 7 1 1 1 et r a 地m i s s i o no f 孤i i l t e r f 醯n c ef n t 盯 波长( n m ) 图2 83 号滤光片光谱扫描图 f i 9 2 - 8t h e 枉a i l 锄i s s i o n o f 触i n t 硼糊c e f n t e r 舭d m o b l u eg l 黜 一1 7 1 孚_ l 加柏伸o 加 0 2 l 爨卜 北京工业大学理学硕士学位论文 1 0 0 蓦 卜 8 0 6 0 4 0 2 0 0 3 0 03 5 0 4 0 04 5 0 5 0 05 5 0 6 0 0 6 5 07 0 0 波长( n m ) 图2 94 号滤光片光谱扫描图 f i 9 2 - 9 1 1 1 e 衄l s 嘶s s i o no f m i n t 晌c e f i l 嘧d t w og r e 蓟m p c r 反应成阴性的荧光信号值：“b ”p c r 反应成阳性的荧光信号值： “a ” 装置灵敏度以高压形式表示：v 木料 实验1 激发系统滤光片发射系统滤光片 荧光信号值a荧光信号值b b ：a v 4 0 0 3 号4 号 1 4 0 3 5 12 5 0 v 4 2 0 3 号 4 号 1 9 64 9 22 5 l 结论：在实验1 的结果说明：a ：b 的倍数不受灵敏度的影响。 实验2 激发系统滤光片发射系统滤光片荧光信号值a荧光信号值b b ：a v 4 0 0 3 号4 号 1 4 03 5 1 2 5 0 v 4 2 0l 号2 号 4 8 85 8 51 2 0 结论：在实验2 的结果说明：在同样的灵敏度条件下，增大激发系统和发射系统 的透过率，并不能增大b ：a 的值，由于截止深度不深，反而使a ，b 的值几乎没有 差别。 实验3 激发系统滤光片发射系统滤光片荧光信号值a荧光信号值b b ：a v 4 2 0 l 号4 号 1 3 71 7 81 ，3 v 4 2 03 号2 号 1 3 0 48 9 4一o 6 9 结论：3 号与2 号组合时，b ：a 一0 6 9 阴阳不分，不能正常显示荧光信号。 第二章一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 在以上的实验中我们可以看到 1 ) 相同灵敏度条件下3 号4 号组合，a - 1 9 6 ；1 号与4 号组合，a _ 1 3 7 。表明1 号滤光片的透过率并不比3 号高。 2 ) 相同灵敏度条件下3 号4 号组合时，b ：a = 2 5 1 ：l 号4 号组合，b ：a = 1 3 。 表明b ：a 的值的大小不取决于滤光片的透过率，而是截止深度，也就是 说对于生物荧光检测，分光系统的截止深度的要求比透过率重要多了。 从3 号与2 号的组合来看，阴阳性不分，尽管3 号截止深度比较深，但由于 2 号的截止深度有限，因此激发光4 7 5 n l 已经影响了发射光5 3 0 r h n 的检测表 示，生物荧光检测为微光检测。 2 4 机械结构设计 2 4 1 光纤传输系统的机械结构设计 a 实物图片b 键合后的微流控芯片 a o p t i c a lf i b e r b n em i c r o c b i p 囝2 一i o 实际检涮图片 f i 9 2 1 0o p 右c a l 丘b e r 锄dt t i em i c r o c “pp i c 眦 表( 2 一1 ) 光纤固件设计数据 t a b 】e ( 2 - l ，d c s 和d a 协 立体图 俯视图尺寸结果 光 x = 1 - 5 第二个尺寸检测效源 邓 r = 1 2 5 果更好。原因：光光 y = 2 5 纤 x = 2 5 纤采集尺寸与光源 固 y = 1 5 光斑尺寸较稳和。 件 r = o 7 5 北京工业大学理学硕士学位论文 检 测 中= 2 6 第二个尺寸检测效 果更好。原因分析： 光 一每 ，、一 光斑大，即所采集 纤 一_ 罗一，一 固 、二 中= 3 4 的荧光信号更多， 光强更强。 件 x = 8 从5 0 u m 到1 不同 与 一、 y = 2 宽度的微通道检测 芯 j 二，_ i k r = 1 结果看，第二个尺 寸更好。原因分析： 片 、一；4 p x = 8 微 x y 的尺寸变大，增大 h _ 一 y = 1 了荧光信号的背景 通 r = 0 5 噪声。 道 相 ? 0 丌 x = 2 0 对 一 r 将x 的尺寸增长，可 应 。l 。电 y = 1 检测更长的微通道 r = 0 5 光拜在固阵中捧辄， 图2 1 1 光纤排布 f i 9 2 1l1 1 l ep l a c m e n to f o p 6 c a l 丘b e r 图2 一1 2 光纤耦合示意图 f i 9 2 1 1n ec o u p l e d 叩6 c a l 助e r 2 4 2 步进电机控制系统机械传动部分 一2 0 第二章一种微流控生物芯片p c r 荧光实时检测装置 通过步进平移台的移动实现对不同位置的荧光反应物的检测，从而达到实时 检测的目的。步进平移台的主要机械构件为丝杠。通过划片和导轨可以灵活调节 丝杠在任意方向上的位置，实现对微流控芯片检测。 图2 1 1 实物图 f i 薛一1 3 t h ew h o l ep i e t u 陀 图2 1 4 机械传动部分实物图 f i 9 2 1 4t h ec o e c 6 n gp i c t u m 北京工业大学理学硕士学位论文 光纤通过光纤固定件连接到移动滑块，移动滑块随着丝杠的转动前后移动， 可以移动的定位精度在1 u m 。丝杠通过轴承架在两个丝杠固定支架上，左侧的光 纤固定支架与电机固定座固定于底座，底座通过定位于水平导轨上并且其在导轨 上的位置可以调节。右侧的光纤固定支架定位于水平导轨上，其在导轨上的位置 可调节。同时水平导轨定位于垂直的划片上，这样丝杠的位置可以通过导轨和划 片调节。 2 5 试验装置荧光p c r 检测方式研究 在生物p c r 荧光检测中，由于使用的荧光素以及使用荧光素的生物层面上的 方式有不同，因此由于没有稳定性好，代表性好的标准物质，按分析化学的标准 物质作为参比的方法是不可能的。在具体的p c r 荧光检测中，一般使用调零管作 为零点进行参比相对测量。在终点法中还有可能再有一个“强阳性”作为辅助参 比。同时由于生物p c r 荧光的变化是以2 “方式扩增，因此在曲线设定时一般要考 虑在曲线中各点的获得方式。 一种方式是在生物p c r 荧光扩增中人为地设定某一拷贝数如1 0 2 、1 0 3 、1 0 4 、 1 0 5 、1 0 6 、1 0 7 、1 0 8 ，然后进行荧光值测量。将测量后的荧光值采集下