（动物学专业论文）扁玉螺的遗传多样性研究.pdf

鲁东大学硕士学位论文 摘要 本文以中国北方沿海的扁玉螺( n e v e r i t ad i d y m ar o d i n g ) 野生群体为研究对象，应 用简单重复序列区间扩增( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 分子标记技术，对扁玉螺 的遗传多样性进行了研究，从群体遗传学角度揭示了扁玉螺野生群体的遗传结构，对其 种质资源的遗传多样性进行了评估，探讨了不同野生群体之间的遗传关系，以期为保护 和合理利用扁玉螺种质资源提供理论依据。主要研究结果如下： 1 、通过优化i s s r - p c r 反应体系，从3 0 个i s s r 引物中筛选出1 3 个用于i s s r 分 析。1 3 个引物均显示出不同程度的多态性，在3 个群体9 0 只个体中共检测到1 6 1 个位 点，平均每个引物记录1 2 4 个位点，扩增产物的分子量大多在2 0 0b p - 1 6 0 0b p 之间。 2 、多态性位点比例和s h a n n o n s 指数是衡量群体遗传多样性的重要指标之一。实验 结果显示：青岛、大连和烟台3 个群体的多态性位点分别为7 4 5 3 、7 4 5 3 、8 5 0 9 ， 可见，烟台群体的多态性位点比例明显高于青岛和大连群体，虽然大连群体和青岛群体 的多态位点百分率相同，但综合s h a n n o n s 信息指数( d 和n e i s 基因多样性指数( 办) 两组数据来看，各群体遗传多样性水平的高低依次为y t q d d l 。 3 、n e i s 基因多样性指数( j 1 1 ) 和s h a n n o n s 信息指数( ，) 在群体水平上分别为0 2 8 11 和0 4 1 8 9 ，在物种水平上分别为0 3 3 9 5 和0 5 1 1 3 ，显示出扁玉螺群体拥有较高的遗传多 样性水平，物种水平的遗传多样性高于群体水平。群体内遗传多态度比例( h p o p h s p ) 为0 7 8 7 3 ，群体间遗传多态度比例( # s p - n p o p ) l i s p 为0 2 1 2 7 ，即扁玉螺群体发生的遗 传变异有7 8 7 3 存在于群体内，2 1 2 7 的变异存在于群体间，这说明群体内的变异是 导致群体间分化的重要因素。 4 、利用a m o v a 的等级剖分法得出的群体间和群体内对总的遗传变异的贡献率表 明，扁玉螺2 7 1 6 的变异发生在群体间，7 2 8 4 的变异发生在群体内，显著性检验显 示扁玉螺群体间和群体内均有极显著的遗传分化( 咖r = 0 2 7 2 0 ，p q d d l 3 t h es h a n n o n si n d e xa n dn e i si n d e xa m o n gp o p u l a t i o n sw e r e0 418 9a n d0 2 811 ，a n d w i t h i np o p u l a t i o nw e l e0 5113a n d0 3 3 9 5r e s p e c t i v e l y s o ，t h er e s u l t ss h o w e dt h eg e n e t i c d i v e r s i t yo fs p e c i e sl e v e lw a sh i g h e rt h a ng r o u pl e v e l t h ep e r c e n t a g eo fg e n e t i cd i v e r s i t yf o r i n d i v i d u a l sw i t h i np o p u l a t i o n 婚o p | h s p ) w a s0 7 8 7 3 a n dt h ep e r c e n t a g eo fg e n e t i c d i v e r s i t ya m o n gp o p u l a t i o n s ( h s p - h p o p ) h s p 】w a s0 212 7 i na n o t h e rw o r d s ，7 8 7 3 g e n e t i cv a r i a t i o nw a sd i s t r i b u t e dw i t h i ns t o c k sa n d21 2 7 a m o n gp o p u l a t i o n s s ot h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n e t i cv a r i a t i o nw i t h i np o p u l a t i o n sw a st h ei m p o r t a n tf a c t o r r e f l e c t i n go ng e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n 4 t h er e s u l t so fa n a l y s i so fm o l e c u l a rv a r i a t i o n ( a m o v a ) r e v e a l e dt h a tt h ed i v e r s i t yo f n e v e r i t a 破d y m aw a sd i v i d e di n t ot w op a r t s ，2 7 1 6 f r o mi n t e r - p o p u l a t i o na n d 7 2 8 4 f r o m i n t r a - p o p u l a t i o n s i g n i f i c a n tt e s ts h o w e dt h a tt h eg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o no fn e v e r i t a 访a ) o n a p o p u l a t i o n ( 咖f = 0 2 7 2 0 ，p 0 0 0 1 ) w i t h i na n da m o n gg r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l y a n dt h i s r e s u l tw a ss i m i l a rw i t ht h er e s u l t sb e i n gd i s c u s s e da b o v e 鲁东大学硕士学位论文 5 g e n e t i ci d e n t i t i e si n d e xw i t ht h ep o p u l a t i o nr e f l e c tt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fi n d i d d u a l s w i t h i nt h ep o p u l a t i o n t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea v e r a g eg e n e t i ci d e n t i t i e s i n d e xo ft h r e ep o p u l a t i o n s q d ，y ta n dd lw e r e0 7 7 0 9 ，0 7 3 0 7a n d0 7 8 2 4r e s p e c t i v e l y , w h i c hs h o w e dt h e r ew a sb i g g e s tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nw i t h i ny tp o p u l a t i o n 6 t h eg e n e t i cd i s t a n c e ( d ) a n dt h eg e n e t i cs i m i l a r i t yi n d e x ( i s ) w a si m p o r t a n tp a r a m e t e r s ， w h i c hm e a s u r e dg e n e t i cv a r i a 廿o nd e g r e ea m o n gp o p u l a t i o n s t h eg r e a t e rsv a l u e s ，t h ec l o s e r r e l a t i o n s h i p s ，t h es m a l l e rg e n e t i cv a i i a t i o 玛a n dt h eg r e a t e rt h ev a l u e o fd ，t h ef a r t h e r r e l a t i o n s h i p ，t h eg r e a t e rg e n 曲cv m 撕o mc o m p a r i n gt h eg e n e t i cs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ta n dt h e g e n e t i cd i s t a n c eo f3p o p u l a t i o n sf r o mq d ，y ta n dd l ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e nq da n dd lw a st h el a r g e s t , a n dt h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nd la n dy t w a st h es m a l l e s t t h eg e n e t i cs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n tb e t w e e ny ta n dd lw a st h el a r g e s t t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t , i nt h et h r e en a t u l a lp o p u l a t i o n s ，d la n dy tw a sc l o s e r , a n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd l a n dq dw a sf a r t h e r 7 a c c o r d i n gt ot h et e s to fu n w e i g h t e dp a i r - g r o u pm e t h o dw i t ha r i t h m e t i ca v e r a g i n g t h eg e n e t i cd i s t a n c ea n dt h eg e n e t i cs i m i l a r i t yi n d e xo n9 0i n d i v i d u a l s ，e v e r yp o p u l a t i o nh a n d i t so w nc l u s t e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h e r ew a sh i g hg e n e t i cs i m i l a r i t ya m o n gi n d i v i d u a l s i nt h eg r o u p s 8 t h e 瓯o f3p o p u l a t i o n sn e v e r i t ad i a y m aw a so 17 2 0 ，a n dt h e 肘w a s2 4 0 6 3 t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ist k 习旧a r ee 毹c 吐v eg e n ef l o ww i t h i nt h r e ep o p u l a t i o n sa n dg e n e t i c d r i f ti sn o tt h em a i nf a c t o r sa f f e c t i n gg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o no fn e v e r i t ad i a y m ap o p u l a t i o n s t h ef a c t o r s ，w h i c hc a u s e dg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o no fn e v e r i t ad i d y m ap o p u l a t i o n s ，m a yb e r e l a t e dt ot h e g e o g r a p h i c i s o l a t i o n o w i n gt ob r e e d i n g ，t h ep o p u l a t i o n d i s t r i b u t i o n i n c o n s e c u t i v e l y ，a n dr e s o u r c e sr c d u c t i o nd u et oe x c e s s i v e l yc a p t u r e ，a n ds oo n k e y w o r d s ：n e v e r i t ad i d y m a ( r o d i n g ) ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；i s s rm a r k e r 鲁东大学学位论文原创性声明和使用授权说明 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：弓l 、女舍感日期：舢9 9 年多月f j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权鲁 东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密囤。 ( 请在以上相应方框内打“4 一) 作者签名：弓1 、始蔽 导师签名剔豸u 舻叼 日期：如分年 日期：碲 毛只| 击日 6 只 乃日 鲁东大学硕士学位论文 引言 扁玉螺( n e v e r i t ad i d y m ar o d i n g ) 隶属于软体动物门( m o l l u s e a ) 、腹足纲 ( g a s t r o p o d a ) 、前鳃亚纲( p r o s o b r a n c h i a ) 、中腹足目( m e s o g a s t r o p o d a ) 、玉螺超科 ( n a t i c a c e a ) 、玉螺科( n a t i c i d a e ) ，属广温性种，是一种分布于我国黄渤海以及朝鲜半 岛、日本和东南亚沿海的贝类。扁玉螺是海洋贝类中具有食用和经济价值的种类之一， 随着人们对扁玉螺需求量的增大，自然资源量正在逐步减少，因此，扁玉螺已成为潜在 的人工养殖开发品种。 由于海洋环境污染，养殖群体遗传结构单一、近交机率增加、贝类种质日渐退化、 抵御病害和适应环境的能力下降，致使养殖的品种出现了病害频发、个体小型化、抗逆 性减退等现象，再加上引入的外来品种遗传渐渗作用势必会对野生群体的种质资源带来 负面影响；养殖逃逸个体和劣质种苗对野生资源基因库也产生了一定的威胁：对其自然 资源的过度采捕已导致自然群体的数量日趋减少，也是种质资源受到了一定程度的破 坏。因此，采取有效措施加强对我国野生和养殖群体进行遗传监测和评价，保护其遗传 多样性，对水产动物资源的可持续利用、促进其养殖业健康稳步发展，有着极为重要的 意义。 遗传多样性是生物多样性的核心，保护生物多样性最终是要保护其遗传多样性，因 为一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，而物种的经济和生态价值也依赖其 特有的基因组成。一个物种的遗传变异愈丰富，它对生存环境的适应能力便愈强；而一 个物种的适应能力愈强，则它的进化潜力也愈大。因此，检测和研究遗传多样性，是全 面系统地研究生物多样性的基础和前提，也可以为种质资源保护和分子标记辅助选育 ( m a r k e ra s s i s t a n ts e l e c t i o n , m a s ) 等提供科学、客观的依据，分子标记技术的发展无 疑为此提供了一种有效的手段。 物种和生态系统的稳定依赖于遗传多样性，但是随着环境或人为等因素的改变，其 多样性会受到破坏，全球生物多样性正在灾难性地减少，研究和保护动物的遗传多样性 已成为保护生物学关注的热点。只有掌握了物种的多样性水平和群体的遗传结构，才能 制定有效的保护策略和措施。因此，研究生物群体的遗传多样性，对保护和合理开发利 用其资源有着重要的意义。 分子标记具有数量多、分布广、多态性丰富、检测快速方便等优点，近年来在鱼虾 贝类等水生动物的研究中已得到了广泛应用。本研究以中国北方沿海的大连、青岛和烟 l 鲁东大学硕士学位论文 台海域的扁玉螺野生群体为研究对象，采用简单重复序列区间扩增( i n t e rs i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 分子标记技术，对扁玉螺的种质资源进行遗传多样性分析，从群 体遗传学角度揭示扁玉螺野生群体的遗传结构，对其种质资源的遗传多样性进行评估， 探讨了不同野生群体之间的遗传关系，以期为保护和合理利用扁玉螺种质资源提供理论 依据。 鲁东大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 遗传多样性研究方法概述 生物多样性是地球上生命及其相互关系的总和，是人类赖以生存的物质基础。它包 括种类丰富的动物、植物、微生物及其与环境形成的生态复合体，以及与此相关的各种 生态学过程，是生态系统的基本特征。生命系统是一个等级系统，每一个等级或层次上 都存在着多样性，因此生物多样性包括遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性、景 观多样性四个层次i l j 。其中，遗传多样性是生物多样性的核心，保护生物多样性最重要 的是保护其遗传多样性，因为一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，而物种 的经济和生态价值也依赖其特有的基因组成【2 j 。 遗传多样性的定义有广义和狭义之分。广义的遗传多样性是指地球上生物所携带的 各种遗传信息的总和。这些遗传信息储存在生物个体的基因之中。因此，遗传多样性也 就是生物的遗传基因的多样性。基因的多样性是生命进化和物种分化的基础。狭义的遗 传多样性主要是指生物种内基因的变化，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传 变异总和p 】。在生物的长期演化过程中，遗传物质的改变( 或突变) 是产生遗传多样性 的根本原因。物种的遗传多样性可以从形态特征，细胞学特征，生理生化特征及d n a 序列特征等不同层次来标记区别。 1 1 1 形态学水平 形态性状是物种在生长发育过程中，可用肉眼观察的形态特征、特性。例如小麦株 高、千粒重、穗形及分蘖、生育期、抗逆性和抗病性等。形态标记遗传差异由于表现直 观，易于识别，便于掌握，人们对它的应用远远早于其他标记。从形态学或表型性状上来 检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法。通常所利用的表型性状主要有两类，一 是符合孟德尔遗传规律的单基因性状，另一类是根据多基因决定的数量形状【4 j 。很多时 候，形态标记估测遗传变异是最现实、最有价值的方法，但是此种方法需要有自然突变 或物化诱变所获得的突变体，这就要求较长的时间，而且突变对有利形态标记会产生不 利影响；另外，形态标记易受环境条件及基因性状影响【5 1 。李金花等1 6 1 利用美洲黑杨 僻d e l t o i d e s ) 5 0 号为母本和青杨c a t h a y a n a ) 5 个种源( 各1 0 个单株) 为父本杂交所得杂 3 鲁东大学硕士学位论文 种f 1 代无性系，对其叶片和生长遗传变异进行了研究。结果表明，父本青杨种源间及种 源内单株间均达到极显著差异，f 1 代无性系的种源间、种源内家系间和家系内无性系间 存在不同差异，f 1 代无性系存在丰富的遗传变异，具有选择潜力。卫二建等【7 】对珠江野生 鲮的形态变异进行了观察研究，同时将野生鲮与人工繁殖群体进行了比较。发现采集的 珠江野生鲮中有两种不同颜色的类群：背部呈绿色，颜色较深，称为深色群体；背部呈 黄色，颜色相对较浅，称为浅色群体：人工繁殖群体的体色与深色群体相近。在3 龄鲮 中，浅色群体与深色群体个体的平均体重具有显著差异( p 0 0 5 ) 。雄鱼的遗传图谱中包含1 8 1 个a f l p 和7 个s s r 标记，组成2 4 个连锁群， 总长度为2 9 5 9 1 c m ，而在雄鱼的遗传图谱的2 3 个连锁群中，由1 5 3 个a f l p 和8 个s s r 标记组成，总长度为2 2 0 5 7 c m 。王伟继等瞰j 以中国明对虾抗白斑综合症病毒( w h i t es p o t s y n d r o m ev t r u s ，w s s v ) 选育群体第四代为母本，野生中国明对虾为父本，采用单对杂交 1 1 鲁东大学硕士学位论文 方式产生f 代，f 代个体姊妹交产生f 代共4 2 个个体为做图群体。利用拟测交理论分别 构建中国明对虾雌虾、雄虾的遗传连锁图谱，利用f 2 自交模型构建共同的a f l p 分子标 记连锁图谱。将该图谱和其他对虾类遗传连锁图谱进行了比较分析，探讨了利用相关分 子标记将已有图谱进行整合的可能。 ( 2 ) 分析群体遗传结构及亲缘关系 动物在长期的自然选择和人工选择过程中，形成了不同的种群和品系，基因频率也 发生了分化，分子标记技术为揭示物种间的亲缘关系提供了可靠的依据。而亲缘关系鉴 定与研究能够为杂交亲本的选配提供依据，有效的预测杂种优势，确定不同物种之间亲 缘关系及其进化地位，有选择的利用其某些优良性状培育新品种。李思发等【5 5 】用形态判 别、同工酶和r a p d 分析相结合的方法，从3 个层次研究分析了鲂属团头鲂、三角鲂和 广东鲂的种间亲缘和种内遗传差异，结果表明广东鲂与团头鲂、三角鲂差异较大，亲缘 关系较远；而三角鲂和团头鲂之间差异小，亲缘关系较近；另外，三角鲂种内遗传多样 性显著地高于广东鲂和团头鲂。宋林生等【5 6 1 对分别采集于福建和山东青岛的日本对虾野 生种群和养殖群体的样品，利用r a p d 技术就其遗传结构进行初步研究，结果，2 0 个 随机引物在野生和养殖群体中分别扩增出1 5 7 和1 5 3 条d n a 片段，其中多态性片段数 分别为8 5 和5 8 条，多态性片段的比例分别为5 4 1 4 和3 7 1 9 ，平均杂合度分别为0 2 5 1 7 和o 1 3 4 3 ，野生种群的多态性和杂合度明显高于养殖群体，说明中国的日本对虾野生种 质资源种质状况较好。李太武等【57 】用2 0 条随机引物对皱纹盘鲍、杂色鲍进行r a p d 分 析，结果均能产生清晰可重复扩增产物，计算出各群体扩增位点的多态性比例分别为 4 3 6 6 和5 3 0 5 ，群体平均遗传杂合度分别为0 1 5 5 7 和o 1 6 8 6 ，群体间的遗传距离 0 2 8 9 8 ，表明皱纹盘鲍与杂色鲍的亲缘关系较远。李思发等【5 8 】运用r a p d 技术，筛选3 4 个有效引物，研究了分布于额尔齐斯河流域的白斑狗鱼和黑龙江流域的黑斑狗鱼两种鱼 间的亲缘关系，结果其种间遗传相似度为0 8 0 9 0 ，遗传距离为0 0 1 2 5 ，表明这两种鱼为 同一属鱼，只是由于地理隔离、生态环境的差异，使他们从形态到d n a 水平上都出现 了差异。 ( 3 ) 检测种群的遗传多样性 现代遗传学认为，遗传多样性是物种多样性的基础，是评价自然生物资源的重要依 据。一个物种的遗传多样性高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关，遗传变 异是有机体适应环境变化的必要条件。因此，研究物种的遗传结构和遗传分化，揭示其 遗传多样性水平，是生物资源恢复和持续利用的前提和基础。k a s s a m 等【5 9 1 用a f l p 技 术对三个群体的遗传多样性进行了分析，结果显示a f l p 标记为鱼类遗传变异及多样性 1 2 鲁东大学硕士学位论文 评估等方面提供了可靠信息。宋林生等1 6 0 利用r a p d 技术对我国栉孔扇贝野生种群和养 殖群体的遗传结构及其分化进行了研究，结果野生种群和养殖群体的多态位点比例分别 为7 5 8 2 和7 3 4 7 ，杂合度分别为0 2 7 和0 2 6 ，野生群体的多态位点比例和杂合度处 于较高水平，说明我国栉孔扇贝野生种群的遗传多样性水平较高，种质资源尚处于较好 状态。陈大鹏等【6 1 】利用i s s r 技术对江苏和辽宁两个地理群体文蛤( m e r e t r i xm e r e t r i x ) 进行了p c r 扩增，结果显示江苏文蛤的遗传多样性比辽宁文蛤要高，群体内平均遗传 距离比辽宁文蛤大，江苏文蛤的位点多态性( 8 0 7 ) 高于辽宁文蛤的位点多态性( 6 8 4 ) ； 种群内平均遗传距离分别为0 3 1 0 5 4 - 0 0 9 0 和0 2 6 5 8 + 0 0 4 4 ，江苏文蛤也高于辽宁文蛤。 沈玉帮等【6 2 l 利用i s s r 标记技术对厚壳贻贝与贻贝及杂交贻贝遗传渐渗进行研究，结果 表明，厚壳贻贝与贻贝的特异性标记在杂交贻贝中有所反应，进一步证实了在浙江嵊泗 部分厚壳贻贝与贻贝发生了杂交和基因渐渗现象。所采集的杂交群体样本中，6 5 与厚 壳贻贝的遗传距离近，可能是杂交后与厚壳贻贝回交的后代。 ( 4 ) 系统进化 由于物种的进化本质上是基因组的进化，因而分子分类学可以在d n a 水平更精确 地分析物种的进化速度和种属分类。近年来，分子标记分类法有了很大的发展，越来越 受到人们的重视，该技术的运用可以快速有效地对某一品系进行鉴定。罗静等【6 3 】利用 1 7 种酶对鲫属普通鲫低背型、高背型、异育银鲫、白鲫的m t d n a 进行了r f l p 分析， 结果表明云南普通鲫、湖北普通鲫已出现地理分化，能区分出云南普通鲫低背型、高背 型各自在m t d n a 分子上有较丰富的群体内变异，但高背型云南普通鲫有独特的单倍性， 故不支持关于高背型群体可能是近期内由低背型经染色体的简单多倍化而形成的推论。 李思发等【删对长江中下游湖北石首、江西九江、安徽芜湖三江段鲢、鳙、草鱼、青鱼天 然群体的m t d n a 进行了r f l p 分析。结果表明，鲢群体存在显著的遗传差异和基因型 分布有明显的地域性；鳙群体也有显著差异，但基因型分布无区域性；青鱼群体有一些 遗传差异，但基因型未见有区域分布：草鱼群体无显著差异，基因型分布亦无区域性。 ( 5 ) 品系鉴定及辅助育种 提高对象育种品质已成为辅助育种的重要目标之一，将分子标记的方法应用于鉴定 品系、选择优良品质的基因型，是重要的品质改良、育种的方法之一。随着分子生物学 技术的发展，分子标记已经在动植物品种鉴定、分子育种等方面起到越来越重要的作用。 梁利群等1 6 5 】利用r a p d 技术对荷包红鲤抗寒品系的基因组d n a 进行分析。通过对5 0 个 引物的r a p d 分析，综合实验分析结果，发现o p h 0 5 和o p c 0 6 这两个引物是可以鉴 定出荷包红鲤抗寒品系的。高俊生等脚j 采用r a p d 分子标记技术，对荷包红鲤抗寒品系 1 3 鲁东大学硕士学位论文 与柏氏鲤进行杂交所获得的f 2 代个体进行亲子鉴定分析。从1 8 0 个随机引物中筛选出 5 个多态性较丰富的引物，并对其产生的多态性d n a 片段进行统计分析，结果显示：x 2 亲 的r a p d 谱带全部在f 2 代中表现出来，而子代中产生的所有谱带在双亲中的表现率在这 五个引物中分别为8 7 0 、1 0 0 o 、9 2 1 、8 2 8 、9 2 6 。这也表明r a p d 技术在对 鲤的亲子鉴定中具有很强的可行性。 1 2 4 发展前景 目前d n a 分子标记技术发展非常迅速，已经掌握的技术会不断完善，新的生物技 术还会不断涌现，分析速度更快、信息量更大、准确度更高、成本更低的分子标记技术 必将出现【7 1 。纵观各种分子标记技术的发展历史，根据其自身的特点，有人预计，将来 分子标记技术将主要向以下两个方面发展：( 1 ) 提高多位点、大规模检测技术的准确性 和重复性；( 2 ) 提高单位点标记的易用性和经济性：二者最终将会相互紧密的融合到一 起。 虽然d n a 分子标记技术发展迅速，但在某些方面的应用还有待于更多的研究。梁 利群等【6 5 l 认为d n a 分子标记技术用于鱼类杂交种的基因组分析还刚刚起步，要把控制 众多的与经济性状相关的基因型与d n a 图谱建立连锁关系需要做大量的艰苦工作，但 是在常规育种中利用d n a 的分子标记技术或者说用分子标记的成果指导鱼类的杂交育 种的鱼类分子遗传育种的新时代已经到来了。由于结构和进化上的特点，m t d n a 已成 为研究生物( 主要是动物) 进化的重要材料【6 引。现在m t d n a 分子标记技术已广泛应用于 动物群体遗传学和进化生物学的研究，并已取得了许多有意义的结果【6 9 1 。m t d n a 的分 子分析已从限制性图谱发展到d n a 序列分析，对m t d n a 的研究也从对d 一环控制区的 研究扩展到单独的线粒体基因进行研究，从而找到一种更有效的探寻不同物种起源及系 统进化的工具【7 0 1 。尽管人类对m t d n a 的研究已取得较大进展，但仍然有一些实际问题 尚待解决，如什么是限制m t d n a 发生变异的因素? 这些因素是否有助于保持m t d n a 的忠实复制并限制其变异的积累? m t d n a 是否会降低利用其研究物种系统进化关系的 价值? m t d n a 的拷贝数在一段时间内将如何变化等。近年来1 8 sr r n a 基因、2 8 sr r n a 基因和c a s e i n 基因等核基因及微卫星等重复序列作为分子标记也在广泛应用，在一定程 度上弥补了线粒体基因分析的不足【7 1 1 。 就当前的技术现状而言，毫无疑问，建立在d n a 基础上的分子标记技术已成为 技术领域的主流，在海洋动物的遗传研究中的应用越来越广阔，其发展前景将十分广阔。 1 4 鲁东大学硕士学位论文 1 3 扁玉螺的生物学特性 扁玉螺( n e v e r i t ad i d y m ar o d i n g ) 隶属于软体动物门( m o l l u s e a ) 、腹足纲 ( g a s t r o p o d a ) 、前鳃亚纲( p r o s o b r a n e h i a ) 、中腹足目( m e s o g a s t r o p o d a ) 、玉螺超科 ( n a t i c a c e a ) 、玉螺科( n a t i c i d a e ) ，属广温性种，是一种分布于我国黄渤海以及朝鲜半 岛、日本和东南亚沿海的贝类【7 2 1 ，其个体较大，肉味鲜美，具有一定的食用和经济价值。 扁玉螺生活在朝间带至水深5 0 m 的浅海的沙和泥沙质的海底，通常在低潮区至1 0 m 左右水深处生活。以发达的足在沙面爬行，爬过处留下一道浅沟。常潜于沙内7 8 厘 米处，猎取竹蛏或其他贝类为食。在海滨采到的一些贝壳上面有圆孔，即为玉螺所穿。 因其为肉食性种类，故为滩涂贝类养殖之敌害；但同时也是底栖鱼类的饲料，如马面鲍 的胃内发现扁玉螺的贝壳和厣。扁玉螺约在8 _ - 9 月产卵，卵子用粘液与泥沙粘成围领 状卵群，退潮后在海滩上能发现大量卵群。扁玉螺肉味鲜美，供食用，壳为贝壳工艺的 原料，可供观赏【7 3 】。目前，扁玉螺的获得主要是采捕野生资源，但是随着人们对扁玉螺 需求量的增大，自然资源量正在逐步减少，因此，扁玉螺已成为潜在的人工养殖开发品 种。 1 4 国内外有关扁玉螺的研究 与其它贝类相比，国内关于扁玉螺的研究比较少，且起步较晚，直到上世纪9 0 年 代才有人对扁玉螺进行了关于消化系统、血液、形态学等方面的研究。李明德【7 4 】对包括 扁玉螺在内的六中渤海贝类进行了氨基酸及重金属含量的检测，结果发现，所测贝类中 含氨基酸较高，因此其营养成分十分丰富。而对于重金属的检测，汞未检出，铅未检出 或低于允许量，镉超过允许量。李太武等【7 5 】对大连沿海常见的腹足纲包括扁玉螺在内的 八种贝类进行了脂肪酸的组成及含量的研究，结果表明贝类并不像有些海洋鱼类含有较 高的肪，但是脂肪酸的组成比较齐全。同时与海参、对虾、蝼虾蛄、三疣梭子蟹进行了 比较，从中证明了八种贝类的营养价值。郑怀平等【7 6 】专门对扁玉螺蛋白质、脂肪含量的 季节变化进行了探索研究。通过测定分析1 9 9 9 年1 2 月- - - 2 0 0 0 年1 1 月的扁玉螺不同部位 的蛋白质和脂肪，发现扁玉螺蛋白质和脂肪的季节变化都与水温和繁殖季节有关，存在 着明显的季节性，但不存在明显的性别差异。另外还发现蛋白质以足部最高，为8 2 0 4 ， 性腺和肝脏的蛋白质都比较低，小于7 0 。而脂肪以足部最低，仅有1 8 3 ；性腺和肝 脏的脂肪都比较高，特别是雌性性腺，年平均为1 2 8 5 ，4 月份可高达1 9 3 6 。宁黔 1 5 鲁东大学硕士学位论文 冀掣77 j 测定了扁玉螺肝脏中细胞色素氧化酶活力，其最适温度为4 4 c ，最适p h 7 0 。研 究了f e 3 + 、c u 、z n 2 + 三种重金属离子在离体条件下对该酶的影响，结果显示低浓度的 f e 3 + 、c a 2 + 对其具有激活作用，高浓度的f e a + 、c u 2 + 极低浓度的z n 2 + 对其具有显著的抑 制作用。另外，宁黔冀【7 引、任虹【7 9 1 等还研究了离体条件下，重金属对金属酶类、过氧化 氢酶活性的影响，结果表明f e 3 + 、c a 2 + 、z n 2 + 、p d 2 + 对所研究的酶既有激活作用，也有 抑制作用，这种作用与各种离子的浓度有关。崔龙波【8 0 】等以多种组织化学的方法研究了 扁玉螺的消化系统。结果表明，除直肠外，其余消化道的纤毛柱状细胞呈现蛋白酶、非 特异性酯酶和酯酶活性，其游离端质膜呈现碱性磷酸酶活性。杯状细胞分泌弱硫酸化酸 性粘多糖。食道腺腺细胞以及肝脏消化细胞显示蛋白酶、非特异性酯酶和酯酶活性，后 者还显示酸性磷酸酶活性。隐窝细胞含有铁。贮藏细胞含有糖原。刘迅等【8 l 】对扁玉螺植 物消化特性进行了初步研究，通过对其各消化器官消化酶活力的测定表明，扁玉螺有一 定的消化植物的能力，其中淀粉水解能力相对较高和稳定，纤维素水解能力低，没有褐 藻酸水解能力，海藻多糖水解能力不稳定，蛋白质和脂肪水解能力处于相对较低的水平。 比较各消化器官重量和蛋白含量，表现唾液腺和肝脏的作用接近，胃、小肠和直肠作用 接近，可能唾液腺和肝脏是消化酶的主要产生部位。崔龙波等【8 2 】用光镜和扫描电镜对扁 玉罗鳃地组织学和表面结构进行了观察，发现鳃叶上皮由5 个区带的细胞组成，即前纤 毛柱状细胞、立方细胞、侧纤毛柱状细胞、后纤毛柱状细胞及呼吸上皮。侧纤毛是产生 呼吸水流的动力来源，呼吸上皮细胞表面凹凸不平，其组织学和表面结构有助于进行气 体交换。姜莹英等【8 3 j 以扁玉螺血淋巴为实验材料，比较研究不同保存温度、时间及血细 胞浓度与其血细胞凝结的关系。 第二章扁玉螺is s r - p o r 反应体系的建立及其优化 2 1 材料 2 1 1 实验材料 扁玉螺采自烟台近海海域，活体运回实验室后，解剖取足肌，放入7 4 c 超低温冰 箱中保存备用。 2 1 2 实验所用主要仪器设备及试剂 1 6 鲁东大学硕士学位论文 2 1 2 1 主要仪器 本实验中所使用到的主要仪器及其生产厂家、型号如表2 1 所示： 表2 1实验所用主要仪器及其生产厂家 t a b 2 - 1t h ea p p a r a t u s ，t h et y p ea n dp r o d u c tc o m p a n i e s 2 1 2 2 主要试剂 本实验中所用到的主要试剂、规格及其生产厂家如表2 - 2 所示： 表2 2 主要试剂来源 t a b 2 2t h em a i nr e a g e n t sa n dt h e i rp r o d u c tc o m p a n i e s 试剂名称厂商试剂名称厂商 r i f f s ( 三羟甲基氨基甲烷) g e n v i e w 分装 e b ( 溴化乙锭)s i g m a 分装 e d t a n a 2 ( 乙二胺四乙酸二钠盐) 北京鼎国公司蛋白酶k_ l e r c k 原装 1 7 鲁东大学硕士学位论文 s d s ( 十二烷基硫酸钠)s i g m a 分装 r n a s e ag e n v i e w p c r 相关试剂( b u f f e r 、 t r i s 饱和酚北京鼎国公司北京鼎国公司 m 9 2 + 、t a q 酶、引物等) 异戊醇北京鼎国公司 d n t p s 北京鼎国公司 氯仿北京鼎国公司m a k e r北京鼎国公司 琼脂糖0 x o i d 原装溴酚蓝北京鼎国公司 2 1 3 提取d n a 相关试剂的配制 ( 1 ) 1 mt r i s ( p h 8 0 ) 5 0 0m l 称取6 0 5 5 9t r i s 碱溶解于4 0 0 m l 水中，加入浓盐酸( 约3 0 m 1 ) 调节p h 值至8 0 ， 加水定容至5 0 0m l ，高压灭菌，4 。c 保存。 ( 2 ) 5 me d t a ( p h 8 o ) 5 0 0m l 称取9 3 0 5 9e d t a - n a 2 ，溶于4 0 0m l 双蒸水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用固体 n a o h 调节溶液的p h 值至8 0 ( 加入1 0 9 左右后，换用n a o h 溶液滴加调节) ，定容至 5 0 0m l ，高压灭菌，4 。c 保存。( e d t a - n a 2 需加入n a o h 将溶液调至8 0 时，才能完全溶 解。) ( 3 ) 1 0 s d s5 0 0m l 称取5 0 9s d s 溶于4 0 0m l 水中，加热助溶，加入浓盐酸调节溶液的p h 值至7 2 ， 加水定容至5 0 0m l ，高压灭菌，4 。c 保存。 ( 4 ) 磷酸盐缓冲液( p b s ) 1 0 5 0 0 m l 称取4gn a c l ，0 1gk c i ，1 7 9gn a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 和o 1 2gk h 2 p 0 4 溶于4 0 0 m l 双蒸 水中，滴加浓盐酸调节溶液的p h 值至7 4 ，加水定容至5 0 0m l ，高压灭菌，4 c 保存。 ( 注：本实验中用的n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 是带结晶水的，即0 0 0 5m o l ，如不带结晶水，只 需要0 7 2 9 。) ( 5 ) 5 mn a c l 5 0 0m l l r 鲁东大学硕士学位论文 称取1 4 6 1 9n a c l 溶于4 0 0m l 双蒸水中，彻底溶解，加水定容至5 0 0m l ，高压灭菌， 4 0 c 保存。 ( 6 ) 蛋白酶k ( 2 0 m g m 1 ) 取2 0m g 蛋白酶k 溶于l 皿超纯水中，上下缓慢翻动，勿剧烈摇晃以致使酶变性。 ( 注：将其分装小份，2 0 c 保存，防止反复冻融使其变性。) ( 7 ) 0 0 1 m 醋酸钠溶液( p h 5 2 ) 1 0 0m l 称取0 1 3 6 1 9 醋酸钠溶于8 0 m l 双蒸水中，充分溶解，滴加约1 5m 浓盐酸后，改加 1 m 盐酸调节溶液p h 值至5 2 。 ( 8 ) l 之d q a s e a ( 1 0m g m 1 ) 将胰核糖核酸酶( r n a s e a ) 溶解在0 0 1 m 醋酸钠缓冲液( p h 5 2 ) 中，始终浓度为 1 0m 砌，沸水煮1 5m i n ，室温下缓慢冷却，用o 1 体积的1 m i r i s h c i ( p h 8 0 ) 调整 p h 值至7 4 左右，分装小管，2 0 保存，备用。 ( 9 ) t e ( 5 0 x ) 1 0 0m l 取1 mt r i s ( p h 8 0 ) 5 0m l ，0 5me d t a ( p h 8 0 ) 1 血，加水定容至1 0 0m l ，4 c 保 存。 利用上述经灭菌后的母液配制d n a 提取缓冲液，各成分如表2 - 3 所示： 表2 - 3d n a 提取缓冲液 t a b 2 3t h er e a g e n tu s e dt ot h ee x t r a c t i o no fd n a 2 1 4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂的配制 ( 1 ) t b e ( 5 x ) 1 0 0 0 m l 1 9 鲁东大学硕士学位论文 称取5 4gt r i s 碱，2 7 5g 硼酸溶于8 0 0 r a l 双蒸水中，加入2 0 “的o 5me d t a n a 2 ( p h 8 0 ) ，加水定容至1 0 0 0m l ，4 1 2 保存。 ( 2 ) 溴酚蓝加样缓冲液( 6 x ) 1 0 0m l 称取o 2 5g 溴酚蓝、1 5g f i e o l l ( 4