（植物病理学专业论文）多菌灵降解菌的筛选鉴定及降解特性研究.pdf

英文缩略表 l 目录 中文摘要1 a b s t r a c t 3 1 弓l 言5 1 1 农药的微生物降解研究进展5 1 1 降解农药的微生物类群5 1 1 2 微生物降解农药的机理6 1 1 2 1 微生物在农药转化中的作用8 1 1 2 2 微生物降解农药的生化反应8 1 1 3 影响微生物降解农药的因素 1 1 3 1 微生物自身的影响。9 1 1 3 2 农药自身结构的影响。9 1 1 3 3 环境因素的影响。1 0 1 1 4 研究中存在的问题1 1 1 1 4 1 单一菌株的纯培养问题1 1 1 1 4 2 环境条件对微生物降解农药的影响1 l 1 1 4 3 微生物降解目标化合物对降解的影响1 l 1 1 4 4 微生物与被降解物接触的难易程度1 l 1 1 4 5 微生物的适应性问题1 1 1 2 多菌灵杀菌剂的结构、检测及生物降解研究进展1 2 1 2 1 多菌灵的结构和理化性质1 2 1 2 2 多菌灵降解特性1 3 1 2 3 多茵灵残留方法的检测1 3 1 2 3 1 样品的前处理1 4 1 2 311 液液萃取法( l l e ) 1 4 1 2 312 气相色谱法( g c ) 1 4 1 2 3 1 3 超临界萃取法( s f e ) 1 4 1 2 3 1 4 微波辅助提取法( m a e ) 1 4 1 2 3 2 紫外光谱法1 5 1 2 3 3 高效液相色谱法( h p l c ) 1 5 1 2 3 4 液相色谱质谱联用法( l c m s ) 1 6 1 2 3 5 其他方法1 6 1 2 4 多菌灵的生物降解1 6 1 3 本研究的目的意义1 7 2 材料与方法1 7 2 1 供试土样1 7 2 2 主要仪器与设备1 7 2 3 试剂。1 7 2 4 培养基。1 8 2 5 多菌灵降解菌株的富集分离与纯化1 9 2 6 多菌灵降解细菌种子液的制备1 9 2 7 多菌灵标准曲线的测定2 0 2 8 菌株对多菌灵降解效果的测定方法2 0 2 9 降解菌的筛选。2 0 2 9 1 降解菌的初筛2 0 2 9 2 降解菌的复筛2 0 2 1 0 多菌灵降解细菌生长曲线的测定及种子液的制备2 1 2 n 多菌灵降解细菌条件的优化2 1 2 1 1 1 温度对降解细菌降解效果的影响2 1 2 n 2p h 值对降解细菌降解效果的影响2 l 2 1 1 3 接种量对降解细菌降解效果的影响2 1 2 1 2 多菌灵降解细菌的生理生化性状测定2 1 2 1 2 1 菌株的革兰氏染色2 1 2 1 2 2 菌株的生化特征测定2 2 2 1 3 多菌灵降降解细菌1 6 sr d n a 序列的测定2 3 2 1 3 1 菌株d n a 的提取2 3 2 1 3 21 6 sr d n a 基因的p c r 扩增2 4 2 1 3 3p c r 产物的克隆2 5 2 1 3 3 1 琼脂糖凝胶电泳2 5 2 1 3 3 2p c r 产物回收2 5 2 1 3 4p c r 产物的连接。2 6 2 1 3 5 大肠杆菌感受态细胞的制备。2 6 2 1 3 6 连接产物转化大肠杆菌2 6 2 1 3 7 碱裂解法提取质粒d n a 。2 7 2 1 3 8 重组质粒鉴定。 2 1 3 9 序列的测定、拼接与分析2 8 2 1 3 9 1d n a 序列的测定。 2 1 3 9 2d n a 序列拼接及分析2 8 2 1 4 多菌灵降解细菌发酵条件的优化2 8 2 1 4 1 菌体生长量的测定。2 8 2 1 4 2 最适碳源的选择2 9 2 1 4 2 3 最适氮源的确定2 9 2 1 4 4 最适碳源添加量的确定。2 9 2 1 4 5 最适氮源添加量的确定2 9 2 1 4 6n a c l 添加量的确定2 9 2 1 4 7k 2 h p 0 4 添加量的确定2 9 2 1 4 8m g s 0 4 7 h 2 0 添加量的确定2 9 2 1 4 9 正交试验。3 0 2 1 5 多菌灵降解真菌菌株的5 8 sr d n a i t s 序列测定3 0 2 1 5 1 提取试剂。3 0 2 1 5 2 菌株d n a 的提取_ 3 0 2 1 5 3p c r 扩增。3 l 2 1 5 4 特异性扩增片段的回收2 3 2 2 1 5 5 特异扩增片段的克隆3 2 2 1 5 5 1 克隆反应体系的建立2 3 3 2 1 5 5 2 转化3 3 2 1 5 5 3 单克隆检测_ 3 3 2 1 65 8 sr d n a - i t s 序列测定及分析3 3 2 1 7 多菌灵降解真菌降解条件的优化3 3 2 1 7 1 温度对降解真菌降解能力的影响3 3 2 1 7 2p h 对多菌灵降解真菌株降解能力的影响3 3 3 结果与分析3 4 3 1 多菌灵标准曲线的制定3 4 3 1 1 多菌灵最佳吸收波长的确定3 4 3 1 2 标准曲线的制定3 4 3 2 多菌灵高效降解细菌的筛选3 5 3 3 多菌灵降解细菌的鉴定3 8 3 3 1 多菌灵降解细菌的生长曲线3 8 3 3 2 菌株c d 0 9 1 3 的生理生化特征3 8 3 3 3 菌株c d 0 9 1 3 的1 6 sr d n a 序列测定4 1 3 4 多菌灵降解细菌c d 0 9 1 3 降解特性的研究4 3 3 4 1 温度对菌株c d 0 9 1 3 降解率的影响4 3 3 4 2p h 对菌株c d 0 9 1 3 降解率的影响4 4 3 4 3 接种量对菌株c d 0 9 1 3 降解率的影响4 5 3 5 多菌灵降解菌c d 0 9 1 3 发酵条件的优化4 5 3 5 1 最适碳源的确定。4 5 3 5 2 最适氮源的确定4 6 3 5 3 最适碳源添加量的确定4 6 3 5 4 最适氮源添加量的确定4 7 3 5 5n a c i 添加量的确定。4 8 3 5 6k 2 h p 0 4 添加量的确定4 8 3 5 7m g s 0 4 7 h 2 0 添加量的确定4 9 3 5 8 利用正交设计实验对发酵条件的优化4 9 3 6 多菌灵降解真菌的富集分离5 3 3 7 菌株c f - 1 2 的鉴定5 5 3 7 1 降解菌株的生长特性5 5 3 7 2p c r 扩增结果5 5 3 7 3 供试菌株的系统发育分析5 6 3 8 多菌灵降解真菌c f 2 的降解特性5 8 3 8 1 温度对菌株c f - 2 降解率的影响。5 8 3 8 2p h 对菌株c f 2 降解率的影响5 8 4 讨论5 9 4 1 农药残留分析技术的研究5 9 4 2 关于土壤中降解微生物的探讨5 9 i v 4 3 多菌灵高效降解细菌安全性的评价5 9 4 4 多菌灵高效降解细菌应用于生产实践的讨论6 0 4 4 正交试验设计的探讨6 0 4 5 多菌灵降解真菌安全性的探讨 5 结论6 1 5 1 分离到一株高效降解多菌灵的细菌菌株6 1 s 2 明确了多菌灵高效降解细菌的降解特性6 1 s 3 优化了多菌灵高效降解细菌的培养条件6 l 5 4 筛选到一株降解多菌灵效果较好的真菌6 1 5 5 明确了多菌灵降解真菌的降解特性6 1 6 参考文献6 2 7 致谢7 1 8 攻读学位期间发表论文情况7 2 v 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 多菌灵( c a r b e n d a z i m ) 是一种广谱、高效内吸性苯并咪唑类杀菌剂，由 于其杀菌谱广、低毒、使用方便，在保护地蔬菜中常年广泛应用。然而其 化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，故 菜地土壤中已经有相当高程度的积累。分离筛选能够高效降解多菌灵的微 生物是人们目前进行多菌灵环境污染治理、土壤生物修复的一种有效途 径。因此寻找并研究多菌灵降解茵是十分必要的。 本研究以长期大量使用多菌灵的寿光蔬菜大棚土壤为研究对象，通过 富集培养分离得到2 个降解多菌灵效果较好的菌株，结合生理生化特性、 菌落形态特征及菌株特异性序列分析等手段，确定其分类归属；并对其降 解多菌灵的特性进行了研究。其主要研究结果如下： 1 从长期施用多菌灵的保护地蔬菜田土壤中经富集培养分离纯化得 到6 8 个细菌菌株，反复测定其降解能力，最终得到一株降解多菌灵效果 较好的细菌菌株c d 0 9 1 3 。该菌在3 0 、2 0 0 r m i n 、p h 7 0 的条件下培养 3 d ，对浓度为l o o m g l 的多菌灵的降解率为8 5 8 9 。 2 对菌株c d 0 9 1 3 主要生理生化特征进行分析，结果表明：菌株在 p b 培养基平板上培养4 8 h ，形成圆形菌落，菌体红色、黏性、光滑、突 起、边缘整齐、不透明、气味难闻。1 0 0 倍油镜下观察菌体呈短杆状。革 兰氏染色阴性；菌株的接触酶试验、乙酸氧化试验、产h 2 s 试验、明胶 液化试验阳性；淀粉水解试验、v p 试验、甲基红试验、吲哚试验均为阴 性；葡萄糖氧化发酵试验结果为发酵型。该菌株的1 6 sr d n a 序列分析结 果表明，其与s e r r a t i al i q u e f a c i e n s 有较高的同源性( 9 9 ) 。综合菌株 c d 0 9 1 3 的生理生化特性及1 6 sr d n a 系统进化分析结果，确定该菌为沙 雷氏菌属( s e r r a t i a ) 的液化沙雷菌( s e r r a t i a 砌u e f a c i e n s ) 。 3 考察了培养温度、p h 值、接种量3 个因素对菌株c d 0 9 1 3 降解能 力的影响，以对多菌灵的降解率为指标，证明菌株c d 0 9 1 3 降解多菌灵 的最适温度为3 0 ，最适p h 为7 0 ，最适接种量为5 。 4 采用单因素试验与正交试验相结合的方式对菌株c d 0 9 1 3 发酵培 养基配方进行优化，结果表明菌株在以葡萄糖为最佳碳源，蛋白胨为最佳 氮源的培养基中菌体生长量最大；综合考虑各因素对发酵液菌体生长量、 多菌灵降解菌的筛选鉴定及降解特性研究 多菌灵降解率以及经济方面的影响筛选出发酵条件的最优组合为 a 1 b i c l d 2 e 2 ，即发酵培养基配方为：葡萄糖5 9 ，蛋白胨3 9 ，n a c ll g ， m g s 0 4 。7 h 2 0l g ，k 2 h p 0 4 1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 5 从长期施用多菌灵的保护地蔬菜田土壤中分离纯化得到一株对多 菌灵降解效果较好的真菌菌株c f 2 。该茵在2 5 c 、1 4 0 r p m m i n 、p h7 0 的条件下培养7 d ，对浓度为1 0 0 m g l 的多菌灵降解率为5 4 5 6 。 6 菌株c f 2 在p d a 平板上培养一周，菌落粉白色，菌丝突起呈 絮状，白色质密。镜检观察，菌株产生两种形状、大小不同的孢子，大 孢子镰刀形多隔膜，小孢子椭圆形。测得菌株的5 8 sr d n a i t s 区序列在 n c b i 中进行b l a s t 分析。系统聚类分析发现菌株c f 2 菌株和镰刀菌属 的尖孢镰刀菌亲缘关系最近，一致率达1 0 0 ，综合菌株c f 2 的菌落形 态特征及5 8 sr d n a i t s 区序列分析结果，将c f - 2 菌株鉴定为尖孢镰刀 菌( f u s a r i u m o x y s p o r u m ) 。 关键词：多菌灵生物降解富集培养分离鉴定液化沙雷菌尖孢镰刀菌 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t c a r b e n d a z i mi sak i n do fb e n z i m i d a z o l ef u n g i c i d ew i t hb r o a d - s p e c t r u ma n dh i g h a b s o r p t i o ne f f i c i e n c y i ti sw i d e l yu s e di np r o t e c t e dv e g e t a b l ef i e l db e c a u s eo fi t sb r o a d s p e c t r u mb a c t e r i c i d a l ，l o wt o x i c i t ya n dc o n v e n i e n tu s a g e o nt h eo t h e rh a n d ，i th a s s t a b i l i t yc h e m i c a lp r o p e r t y ，l o n g e rh a l f - l i f eo fd e g r a d a t i o ni ns o i l ，s ot h es o i lo fv e g e t a b l e u n d e rs t r u c t u r eh a sah i g hd e g r e eo fa c c u m u l a t i o n i no r d e rt oi m p r o v et h ee n v i r o n m e n t p o u u t i o no fc a r b e n d a z i ma n dr e a l i z et h eb i o - r e m e d i a t i n go fs o i l ，i ti sn e c e s s a r yt o d i s c o v e ra n ds t u d yt h em i c r o o r g a n i s m sw h i c hc a ne f f e c t i v e l yd e g r a d i n gc a r b e n d a z i m i nt h i ss t u d y ，t w os t r a i n sw h i c hc a n d e g r a d i n gc a r b e n d a z i me f f e c t i v e l yw e r ei s o l a t e d f r o ms h o u g u a n gp r o t e c t e dv e g e t a b l ef i e l ds o i lw i t hl o n g - t e r r aa p p l i c a t i o no fc a r b e n d a z i m b yt h er i c h m e n tc u l t u r em e t h o d c o m b i n et h e i rp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o p e r t y e s ， c o l o n ys h a p ef e a t u r e sa n dt h ea n a l y s i so fs p e c i a ls e q u e n c eo ft h es e l e c t e di s o l a t e s ，t o d e t e r m i n et h e i rt a x o n o m i cc a t e g o g y t h e i rd e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c st oc a r b e n d a z i m w e r es t u d i e dt o o t h em a i nr e s u l t so ft h ee x p e r i m e n ta r ea sf o l l o w s ： 1 s i x t y - e i g h tb a c t e r i as t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h el o n g - t e r ma p p l i c a t i o no f c a r b e n d a z i ms o i lo fp r o t e c t e dv e g e t a b l ef i e l db ye n r i c h m e n tc u l t u r em e t h o d t h e d e g r a d a t i o nc a p a c i t yw e r em e a s u r e d t i m ea n d a g a i n ，a n do b t a i n e dt h eb e s t s t r a i n c d 0 9 - 1 3t h a tc a nd e g r a d ec a r b e n d a z i me f f e c t i v e l y t h ed e g r a d a t i o nr a t et oc a r b e n d a z i m w a s8 5 8 9 w h e nt h es t r a i nc d 0 9 1 3w a si n c u b a t e di nm e d i u mw i t hc o n c e n t r a t i o no f l o o m g lo fc a r b e n d a z i ma tp h7 0a n da t3 0 ca n ds h a k i n ga ts p e e do f2 0 0r m i na f t e r3 d a y s 2 t h er e s u l t sb a s e do na n a l y s i so fp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fc d 0 9 1 3s t r a i n s h o w e dt h a tt h eb a c t e r i ao fc d 0 9 1 3c u l t i v a t e do np bp l a t ea f t e r3 d a y s ，f o r m e dr o u n d c o l o n y t h a l l u sa r er e d ，v i s c o u s ，s m o o t h ，p r o t u b e r a n t ，r e g u l a re d g e ，o p a q u ea n dw i t h n a s t ys m e l l t h et h a l l ui ss h o r tp o l e o u ro b s e r v e db yo i li m m e r s i o nl e n s t h er e s u l to f g r a ms t a i ni sf e m i n i n e t e s t so fc a t a l a s e ，o x i d a t i o no fa c e t i ca c i d ，p r o d u c t i o no fh y d r o g e n s u l p h i d ea n d g e l a t i nl i q u e f a c t i o na r em a s c u l i n e w h i l et e s t so fh y d r o l y s i so fs t a r c ht e s t m ， v p ，m e t h yr e d ，i n d o l ea r ef e m i n i n e g l u c o s eo x i d a t i o nf e r m e n t a t i v et e s ti se r m e n t e d t h ea n a l y s i so f1 6 sr d n as e q u e n c eo ft h es t r a i ns h o w e dt h a ti th a sh i g hh o m o l o g y ( 9 9 ) w i t hs e r r a t i al i q u e f a c i e n s t h eb a c t e r i as t r a i nc d 0 9 - 1 3w a ss e r r a t i al t q u e f a c i e n s b y b a s e do np h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr d n as e q u e n c ep h y l o g e n y 3 多菌灵降解菌的筛选鉴定及降解特性研究 a n a l y s i s 3 t h i ss t u d ye x a m i n e dt h e i m p a c t so ft h r e ef a c t o r so nd e g r a d a t i o nc a p a c i t yo f c d 0 9 - 1 3i n c l u d i n gc u l t u r et e m p e r a t u r e ，p ha n di n o c u l a t i o nv o l u m e ，t a k i n gt h e d e g r a d a t i o nr a t eo fc a r b e n d a z i ma st h ei n d i c a t o r t h er e s u l ts h o w e dt h a ti t so p t i m a l d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea ta tt e m p e r a t u r eo f3 0 c ，p h7 0 ，n o c u l a t i o nv o l u m e5 4 t h ee x p e r i e n to fo p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mo fb a c t e r i as t r a i nc d 0 9 - 1 3 b ys i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a lt e s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb a c t e r i a g r o w t hm a s sr e a c h e dt h em a x i m u m w i t hg l u c o s ea st h eb e s tc a r b o ns o u r c ea n dp e p t o n e t h eb e s tn i t r o g e ns o u r c e t h eo p t i m a lc o m b i n a t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s a 1 b i c l d 2 f - - 2b a s e do ni m p a c t so fb a c t e r i ag r o w t hm a s sa n dt h ed e g r a d a t i o nr a t et o c a r b e n d a z i m t h ea d d i t i o n o fe a c hc o m p o n e n ti sg l u c o s e5 9 ，p e p t o n e3 9 ，n a c il g ， m g s 0 4 7 1 - 1 2 0l g ，k 2 h p 0 4 1 5 9a n dd i s t i l l e dw a t e r1 0 0 0 r a l 5 af u n g is w a i nc f - 2w a sa l s o s e l e c t e df r o mt h el o n g - t e r ma p p l i c a t i o no f c a r b e n d a z i mv i n e y a r ds o i lo fp r o t e c t e dv e g e t a b l ef i e l d t h ed e g r a d a t i o nr a t et o c a r b e n d a z i mw a s5 4 5 6 w h e nt h es t r a i nc f - 2w a si n c u b a t e di nm e d i u mc o n t a i n e d1 0 0 m g lc a r b e n d a z i ma tp h 7 0a n da t2 5 ca n ds h a k i n ga ts p e e do f1 5 0r m i na f t e r 7 d a y s 6 t h es t r a i nc f - 2c u l t i v a t e do np d a p l a t ea f t e r7 d a y sf o r m e dp i n dw h i t ec o l o n y w i t hp r o t u b e r a n t ，f l o c c u l e n ta n dw h i t ed e n s eh y p h a s s t r a i nc f - 2p r o d u c e dt w od i f f e r e n t t y p e so fc o n i d i o s p o r e so b s e r v e dt h r o u g hm i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o n t h eb i g g e ri ss i c k l e w i t hm u l t i p l ed i a p h r a g m sa n ds m a l l e re l l i p t i c a lw i t h o u td i a p h r a g m t h e5 8 sr d n a i t s s e q u e n c eo fc f - 2w a sb l a s t e di nn c b i t h er e s u l to fs y s t e mc l u s t e rs h o w e dt h a tt h e g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fc f - 2i sc l o s et of u s a r i u mo x y s p o r u m ，a n dt h ec o n s i s t e n tr a t e r e a c h e d1 0 0 s ot h es t r a i nc f - 2c o u l db ei d e n t i f i e da sf u s a r i u mo x y s p o r u mb a s e do n i t sm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s c o l o n ys h a p ef e a t u r e sa n dt h e5 8 sr d n a i t ss e q u e n c e a n a l y s i s k e yw o r d s ：c a r b e n d a z i m ；b i o d e g r a d a t i o n ；e n r i c h m e nc u l t u r e ；i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ；s e r r a t i al i q u e f a c i e n s ；f u s a r i u mo x y s p o r u m 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 农药在现代农业生产中被广泛使用，但过分使用农药产生了严重的负 面影响。农药残留很难降解，很多农药本身对人类及其他生物是有毒的， 人们在使用农药防止病虫草害的同时，也使粮食、蔬菜、瓜果等农药残留 超标，农药进入自然环境，破坏了生态平衡，影响了农业的可持续发展， 威胁着人类的健康。 近年来，随着农业结构的调整和菜篮子工程的实施，保护地蔬菜的栽 培面积逐年扩大，增加了淡季蔬菜的供应量，提高了蔬菜种植户的生产效 益和经济效益，改善了人民生活水平。目前蔬菜病虫害的控制仍以化学药 剂防治为主，然而，化学药剂容易造成农药在土壤和蔬菜作物上的残留， 对生态环境造成污染，尤其给人类的生存、发展和健康带来危害。随着人 们生活水平的提高，人们越来越注重生活质量。安全、优质、无公害农产 品受到人们的青睐，所以寻找安全、有效的新途径以克服农药带来的农药 残留及土壤、地下水污染等问题。利用高效降解菌治理环境污染不仅成本 低，见效快，且不会造成二次污染。因此农药的生物降解在治理环境污染 方面的作用日益受到人们重视。近年来，国内外学者在农药微生物降解菌 的分离鉴定及利用它们进行生物修复研究等方面取得了较大进展。 1 1 农药的微生物降解研究进展 1 1 1 降解农药的微生物类群 人们发现，在自然生态系统中存在着大量的、代谢类型各异的、具有 很强适应能力的和能利用各种人工合成有机农药为碳源、氮源和能源生长 的微生物，它们可以通过各种代谢途径把有机农药完全矿化或降解成无毒 的其他成分，为人类去除农药污染和净化生态环境提供必要的条件。 土壤中存在着大量的微生物，包括细菌、真菌、放线菌和藻类等，它 们不乏有一些具有能降解农药功能的种类。细菌在农药降解中占有主要地 位，因其生化上的多种适应能力和容易诱发突变菌株。在土壤、污水及高 温堆肥体系中，对农药分解起主要作用的是细菌类微生物，这与农药类型、 微生物降解农药的能力和环境条件等有关，如在高温堆肥体系当中，由于 高温阶段体系内部温度较高( 大于5 0 ) ，存活的主要是耐高温细菌， 而此阶段也是农药降解最快的时期。通过微生物的作用，把环境中的有机 多菌灵降解菌的筛选鉴定及降解特性研究 污染物转化为c 0 2 和h 2 0 等无毒无害或毒性较小的其他物质。通过许多 科研工作者的努力，已经分离得到了大量的可降解农药的微生物。不同的 微生物类群降解农药的机理、途径和过程可能不同。 表1 1 常见降解农药的微生物类别 三曼曼! 曼! ：! 弛曼苎也璺12 1 勉跫i ! i 熟恶i 殿望曼! 曼巳垒垒! 呈2 1 璺曼g ! 璺璺! 篮腿也幽曼 降解菌 可降解的农药 节杆菌a r t h r o b a c t e r2 ，4 d 、甲基对硫磷、杀螟松、对硫磷 曲霉a s p e r g i l l u s 芽胞杆菌b a c i l l u s 地衣芽孢杆菌 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 棒状杆菌c o r y n e b a c t e r i u 黄杆菌f l a v o b a c t e r i u m 假单孢菌p s e u d o m o n a s 青霉p e n i c i l l i u m 镰孢霉菌n e u r o s p o r a 瓶型酵母n e p l a n o c i n 诺卡氏菌n o c a r d i a 小单胞菌m i c r o m o n o s p o r a 白腐菌w h i t e r o t f u n j i 木霉t r i c h o d e r m a 甲胺磷、乐果、2 ，4 d 、敌百虫、七氯对硫磷、 西草净、敌百虫、扑草净 六六六、d d t 、阿特拉津、对硫磷、甲胺磷、 涕灭威、茅草枯、苯硫磷、杀螟松等 敌敌畏、对硫磷、甲胺磷 2 ，4 - d 、d d t 2 , 4 d 、对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松等 乐果、六六六、2 ，4 d 、阿特拉津、狄氏剂、敌 敌畏、甲胺磷、甲拌磷 阿特拉津、艾氏剂、氯磺隆、幼脲3 号 艾氏剂、七氯、d d t 、敌百虫 阿特拉津、甲胺磷 2 ，4 - d 、d d t 七氯 七氯 六六六、毒杀芬、d d t 、阿特拉津七氯 甲基对硫磷 1 1 2 微生物降解农药的机理 微生物对农药的作用方式可分为两大类，一类是微生物直接作用于农 药，通过酶促反应降解农药；另一类是通过微生物的活动改变了化学和物 理的环境而间接作用于农药，常见的作用方式有矿化作用、共代谢作用、 生物浓缩或累积作用等。微生物的降解作用主要是通过其分泌酶的代谢来 完成，其本质为酶促反应，其中包括：( 1 ) 广谱性酶的偶然性代谢；( 2 ) 由 基质结构与农药相似的酶进行的共代谢；( 3 ) 由利用农药作为能源适应酶 6 山东农业大学硕士学位论文 进行的降解代谢。另外，还有通过p h 改变、辅酶或化学产物的降解。当 微生物农药的降解作用是由其胞内酶引起时，整个降解过程通过3 个步 骤：( 1 ) 将农药吸附于微生物细胞表面，这一过程是一种动态平衡，也是导 致降解初期出现“迟缓期”的关键阶段。( 2 ) 农药穿透细胞膜进人膜内，在 茵量一定时，农药对细胞膜的穿透率决定了其穿透细胞膜的量，农药对细 胞膜的穿透是降解的限速步骤。农药的这种穿透率与农药分子结构参数密 切相关。( 3 ) 农药在细胞膜内通过与降解酶结合发生酶促反应，这是一个 快速过程。目前对于各种农药的微生物降解途径已比较清楚，其主要的降 解途径主要有以下几种： 1 1 水解作用：在微生物作用下酯键和酰胺键水解，使得农药脱毒，如马 拉硫磷、敌稗等。 2 ) 脱卤作用：卤代烃类杀虫剂，在脱卤酶的作用下，其取代基上的卤被 h 、羧基等取代，从而失去毒性，如d d t 降解变为d d e 即属此类反 应。 3 1 氧化作用：微生物通过合成氧化酶，使分子氧进入有机分子，尤其是 带有芳香环的有机分子中，插入1 个羟基或形成1 个环氧化物，如多 菌灵和2 ，4 d 。 4 ) 硝基还原：在微生物的作用下，农药中的n 0 2 转变为n h 2 ，如2 ，4 二硝基酚，其降解产物为2 氨基4 硝基酚和4 氨基2 硝基酚；对硫 磷转为氨基对硫磷。 5 ) 甲基化：有毒酚类加入甲基使其钝化，如五氯酚、四氯酚。 6 1 去甲基化：含有甲基或其他烃基，与n 、o 、s 相连，脱去这些基团 转为无毒，如敌草隆的降解即脱去两个n 一甲基。 7 1 去氨基：脱氨无毒，如醚草通。 8 1 轭合作用：生物体内的中间代谢产物与异生素进行合成反应。 微生物对农药的降解受到许多因素的影响，如氧气、营养、温度、湿 度和环境的p h 值等对微生物的生长都有影响。 有研究表明n o 孓、f e “、m n “、s 0 4 2 和c 0 2 对微生物降解农药都起 了重要作用。p e t r i e 等也报道加入一定量的m n 4 + 可提高五氯苯酚( p c r ) 的生物降解率。这些因素中有许多是可以通过控制和调节来提高微生物对 多菌灵降解菌的筛选鉴定及降解特性研究 农药的降解，国内的许多学者对此也做了大量