（麻醉学专业论文）依达拉奉对大鼠再植断肢的保护作用.pdf

目录 洲rr lr lli ir i l li ii ii il 18 0 0 3 0 4 中文摘要1 英文摘要3 研究论文依达拉奉对大鼠再植断肢的保护作用 前言6月i j 舌6 材料与方法6 结果1 1 附图13 附表2 0 讨论：! 参考文献2 7 综述依达拉奉对肢体缺血再灌注损伤时作用的研究概况2 9 墅丈谢4 0 个人简历4 1 中文摘要 依达拉奉对大鼠再植断肢的保护作用 摘要 目的：本实验通过建立大鼠断肢再植模型，检测依达拉奉对血清中超 氧化物歧化酶( s o d ) 、丙二醛( m d a ) 及骨骼肌线粒体n 矿k + a t p 酶、 c a 2 + a t p 酶活性的影响及光镜、电镜下骨骼肌结构的改变，解明依达拉 奉对大鼠再植后断肢的保护作用。 方法：清洁级健康雌性s d 大鼠4 0 只，随机分为4 组，每组1 0 只：s 组 假手术组，m 组断肢再植模型组，e l 组依达拉奉低剂量组，e 2 组依达拉奉 高剂量组。m 组：大鼠麻醉成功后固定，右后肢常规皮肤消毒后沿股血管 走行方向纵行切开皮肤，显露并游离股动静脉及股神经，钝性分离各层组 织，于右股骨中段水平切断所有股部肌肉至股骨，只保留血管。右后肢驱 血后以血管夹夹闭右侧股动静脉，室温下放置3 h ，放松血管夹，形成再灌 注，缝合肌肉、神经及皮肤。术野用生理盐水浸湿的无菌纱布覆盖。再灌 注前各组均由尾静脉给予肝素钠1 0 0 0 u k g 。e l 、f - a 组除与m 组上述操作相 同外，于再灌注前分别由尾静脉注射依达拉奉0 5 m g k g 和l m g k g 。s 组和 m 组给予等量的生理盐水。s 组仅游离出股动静脉，旷置3 h 后缝合皮肤。 每组于再灌注5 h 和2 4 h 分别经颈外静脉取血各l m l ，静置后离心，测定 血清超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性及丙二醛( m d a ) 的含量。并于再灌注 2 4 h 取右后肢腓肠肌，提取线粒体测定骨骼肌线粒体n a + k + a t p 酶、 c a 2 + a t p 酶活性的变化。另取右后肢胫前肌在光镜和电镜下观察骨骼肌的 结构变化。 结果：4 0 只大鼠全部进入结果分析。 l 大体形态观察：s 组右后肢肌肉、皮肤红润温暖。m 组右后肢肌肉、皮 肤颜色稍暗红，温度稍低。e l 组右后肢外观改变较m 组减轻。e 2 组右后 肢外观较m 组有明显的改善。 2 骨骼肌组织切片观察：s 组肌纤维基本正常，间质无水肿，未见炎细胞 浸润。m 组肌纤维结构紊乱，崩解，血管扩张充血，间质水肿，有较多 的炎性细胞浸润。e 。组肌纤维轻度水肿，间质稍水肿，有炎细胞浸润。 e 2 组间质稍水肿，肌间散在炎细胞浸润。 中文摘要 3 透射电镜观察：s 组肌原纤维排列整齐，z 线清晰。线粒体嵴致密，膜 完整，无肿胀。m 组肌原纤维部分断裂，z 线较模糊，线粒体明显肿胀， 嵴紊乱，部分空泡化。e ，组肌原纤维排列较整齐，z 线稍模糊，含有较多 的脂滴，线粒体部分空泡化。e 2 组肌原纤维排列较整齐，z 线较清晰，含 有少量脂滴，线粒体部分空泡化。 4 血清s o d 活性及m d a 含量： 血清s o d 活性：与s 组比，m 、e 1 、e 2 组s o d 活性均降低( p 0 0 5 ) 。与 m 组比，e l 、e 2 组s o d 活性均升高( p o 0 5 ) 。与e l 组比，e 2 组s o d 活性升 高( p o 0 5 ) 。再灌注2 4 h 时，m 、e l 、e 2 组s o d 活性较5 h 时低。 血清m d a 含量：与s 组比，m 、e l 、e 2 组m d a 含量均升高口 0 0 5 ) 。 与m 组比，e l 、e 2 组m d a 含量均降低( p o 0 5 ) 。与e l 组比，e 2 组m d a 含量 降低( p o 0 5 ) 。 5 骨骼肌线粒体n a + k + - a t p 酶、c a 2 + a t p 酶活性：与s 组比，m 、e 1 、e 2 组n a + k + _ a t p 酶、c a 2 + a t p 酶均降低( p o 0 5 ) 。与m 组比，e l 、e 2 组 n a + k ，a t p 酶、ca _ 2 + a r p 酶均升高( p o 0 5 ) 。与e l 组比，e 2 组n 矿k _ a t p 酶、c a 2 + a t p 酶升高伊 o 0 5 ) 。 结论： 1 依达拉奉可减轻大鼠肢体缺血再灌注的损伤，对再植后的断肢具有保护 作用，且高剂量组优于低剂量组。 2 其机制可能是增高了s o d 活性，降低m d a 含量，提高骨骼肌线粒体内 n a + _ k + _ a t p 酶、c a 2 + _ a t p 酶活性。 关键词：依达拉奉；断肢再植；缺血再灌注损伤；大鼠；骨骼肌 英文摘要 t h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fe d a r a v o n eo nt h er e p l a n t e dl i m bo fr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：i no r d e rt os t u d yt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fe d a r a v o n eo n t h e r e p l a n t e dl i m bo fr a t s ，am o d e lo fl i m br e p l a n t a t i o nw a se s t a b l i s h e d b y d e t e c t i n gt h ee f f e c t so fe d a r a v o n et o s e r u ms u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) ， m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) 。a c t i v i t yo f n 0 一k + - a t p a s ea n dc 一- a t p a s eo f m i t o c h o n d r i o ni ns k e l e t a lm u s c l e ，a n dt h es t r u c t u r a lc h a n g e so fs k e l e t a l m u s c l ew a so b s e r v e dw i t ho p t i c a lm i c r o s c o p ea n de l e c t r o nm i c r o s c o p e m e t h o d s ：f o r t yf e m a l es p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t sw e r er a n d o m l y d i v i d e di n t of o u rg r o u p so ft e nr a t se a c h s h a mg r o u p ( s ) ，m o d e lg r o u p ( m ) ， l o wc o n c e n t r a t i o no fe d a r a v o n eg r o u p 正1 ) ，h i g hc o n c e n t r a t i o no fe d a m v o n e g r o u p ( e 2 ) mg r o u pw a st h em o d e lo f l i m br e p l a n t a t i o no fr a t s mr a t sw e r e f i x e df o l l o w i n ga n e s t h e t i z e d a f t e rt h er i g h tp o s t e r i o rl i m bw a sd i s i n f e c t e d ， a l o n gt h el o n g i t u d i n a ld i r e c t i o no nf e m o r a lv e s s e l s c u ts k i n , t h ef e m o r a la r t e r y , v e i na n dn e r v ew e r ee x p o s e da n dd i s s o c i a t e d b l u n ts e p a r a t i o nl a y e r so f o r g a n i z a t i o n s ，i nm i d d l el e v e lo fr i g h tf e m u rc u to f f a l lm u s c l e s ，o n l yp r e s e r v e v e s s e l s a f t e rt h eb l o o dw a sd r o v e ，t h ef e m o r a la r t e r ya n df e m o r a lv e i nw e r e o c c l u d e db yv a s c u l a rc l a m p n er i g h tp o s t e r i o rl i m bw a sp u ti nt h er o o m t e m p e r a t u r ef o r3 h ，t h e nt h ev a s c u l a rc l a m pw a sr e m o v e df o rr e p e r f u s i o n , s u t u r et h em u s c l e n e r v ea n ds k i n 田舱o p e r a t i v ef i e l dw a sc o v e r e dw i t hs a l i n e s o a k e ds t e r i l eg a u z e e a c hg r o u pw a sg i v e nh e p a r i ns o d i u m10 0 0 u k gt o h e p a r i n i z a t i o nv i at h ec a u d a lv e i nb e f o r er e p e r f u s i o n n er a t si ng r o u p e 1a n d f an o to n l yr e c e i v e dt h eo p e r a t i o nm e n t i o n e da b o v e ，b u t a l s oi n j e c t e d e d a r a v o n er e s p e c t i v e l yw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fo 5 m g l 喀a n dl m # k gv i at h e c a u d a lv e i nb e f o r er e p e r f u s i o n t h es a m ev o l u m eo fs a l i n ew a si n j e c t e di n g r o u psa n dm i ng r o u ps ，t h er i g h tp o s t e r i o rl i m bo n l yd i s s o c i a t e st h e f e m o r a la r t e r ya n dv e i l l ，p u ti nt h er o o mt e m p e r a t u r ef o r3 h ，t h e ns u t u r et h e s k i n a tt h et i m e5 ha n d2 4 hr e p e r f u s i o n ，1l n lb l o o do f e a c hr a tw a st a k e nv i a t h ee x t e m a l j u g u l a r v e i n s e r u m s u p e r o x i d e d i s m u t a s e( s o d ) a n d 3 英文摘要 m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) w e r ed e t e r m i n e d a t2 4 ht a k et h er i g h tp o s t e r i o r l i m b g a s t r o c n e m i u s ，e x t r a c tm i t o c h o n d r i a lt od e t e r m i n et h ec h a n g e so f n a - k 十- a t p a s ea n dc a 2 + - a t p a s e t a k et h er i g h tp o s t e r i o rl i m bt i b i a lm u s c l e t od e t e c tt h es t r u c t u r a lc h a n g e so fs k e l e t a lm u s c l e w i 血o p t i c a lm i c r o s c o p ea n d e l e c t r o nm i c r o s c o p e r e s u l t s ：4 0h e a l t h ys dr a t si n c l u d e di nt h ee x p e r i m e n te n t e r e dt h ef i n a l a n a l y s i s 1t h eg e n e r a lm o r p h olo g i c a lo b s e r v a t i o n ：i ng r o u ps ，r i g h tp o s t e r i o rl i m b m u s c l ea n ds k i nr u d d ya n dw a r m i nt h eg r o u pm ，t h ec o l o ro f f i g h tp o s t e r i o r l i m bm u s c l ea n ds k i nw a ss l i g h t l yd a r kr e d ，a n dt h et e m p e r a t u r ew a s s l i g h t l y l o w e r i ng r o u pe 1 ，t h ea p p e a r a n c eo ft h er i g h tp o s t e r i o rl i m bw a sa l l e v i a t i v et o g r o u tm t h ea p lg r o u pe a l l e v i a t i v , t h a ng r o u pmgroupp e a r a n c emg r o u pe 2w a sm o r ea l l e v i a t i v ea l li 臣r o u dm 2f o rt h eh i s t o l o g i c a ls e c t i o n ：i ng r o u ps ，t h em u s c u l a rf i b e rw a s n o r m a l ，t h e r e w a sn oe d e m ai nt h e i n t e r s t i t i a l ，a n dt h e r ew a sn oi n f l a m m a t o r yc e l l s i n f i l t r a t i o n i ng r o u pm ，t h em u s c u l a rf b e rw a sc h a o t i ca n d r u p t u r e d t h eb l o o dv e s s e lw a sd i l a t e da n dc o n g e s t i v e t h ei n t e r s t i t i a lw a se d e m a , a n d t h e r ew a si n f i l t r a t i o nw i t hm a n y i n f l a m m a t o r yc e l l s i ng r o u pe l ，t h em u s c u l a r f i b e ra n di n t e r s t i t i a lw e r e s l i g h t l ye d e m a t h e r ew a si n f l a m m a t o r yc e l l i n f i l t r a t i o n i ng r o u pe 2 ，t h ei n t e r s t i t i a lw a ss l i g h t l ye d e m 钆a n dt h e r ew e r e s c a t t e r e di n f l a m m a t o r yc e l l si n f i l t r a t e 3o b s e r v a t i o n sf r o mt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ：t h ea r r a n g e m e n to f m y o f i b r i li ng r o u psw a sr e l a t i v e l yr e g u l a r zl i n ew 懿c l e a r , m i t o c h o n d r i a l c r i s t aw a sc o m p a c t , m e m b r a n ew a si n t a c ta n dw i t h o u t s w e l l i n g p a r t so f m y o f i b r i l i ng r o u pmw e r eb r o k e n zl i n ew a su n c l e a r o rd i s a p p e a r e d , m i t o c h o n d r i aw e r eh i g h l ys w o l l e na n dm i t o c h o n d r i a lc r i s t aw a si nc h a o s ，a n d p a r t sh a db e e nv a c u o l e s i ng r o u pe l ，t h ea r r a n g e m e n to fm y o f i b r i lw a s r e l a t i v e l yr e g u l a r zl i n ew a sal i t t l eo b s c u r e d t h e r eh a v em a j o rl i p i dd r o p l e t s p a r t so ft h em i t o c h o n d r i aw e r ev a c u o l a t e d i ng r o u pe 2 ，t h ea r r a n g e m e n to f m y o f i b r i lw a sr e l a t i v e l yr e g u l a r zl i n e 、矾坞c l e a r t h e r eh a v es m a l la m o u n t so f l i p i dd r o p l e t s p a r t so ft h em i t o c h o n d r i aw e r ev a c u o l a t e d 4t h ea c t i v i t yo fs o da n dt h ec o n t e n to fn 叭i ns e r u m - 4 英文摘要 s e r u ms o d a c t i v i t y ：a c t i v i t yo fs o d i ng r o u pm ，e ja n de 2w a sl o w e r t h a ng r o u ps ( p o 0 5 ) t h ea c t i v i t yo fs o di ng r o u pe la n de 2w a sh i g h e r t h a ng r o u pm q o 0 5 ) t h ea c t i v i t yo fs o di ng r o u pe 2w a sh i g h e rt h a n g r o u pe 1 ( p 0 0 5 ) t h ea c t i v i t yo fs o d a t2 4 ho fr e p e r f u s i o ni ng r o u pm ，e 1 a n de 2w a sl o w e rt h a n5 h s e r u mm d ac o n t e n t ：c o n t e n to fm d ai ng r o u pm ，e 1a n de 2w a sh i g h e r t h a ng r o u ps ( p o 0 5 ) t h ec o n t e n to fm d ai ng r o u pe la n de 2w a sl o w e r t h a ng r o u pm ( p o 0 5 ) t h ec o n t e n to fm d ai ng r o u pe 2w a sl o w e rt h a n g r o u pe l ( p o 0 5 ) 5 a c t i v i t yo fm i t o c h o n d r i an a + - k + - a t p a s ea n dc a z + - a t p a s e ：t h ea c t i v i t yo f n a + - k + - a t p a s ea n dc a 2 + - a t p a s ei ng r o u pm ，e 1a n de 2w a sl o w e rt h a ng r o u p s ( p 0 0 5 ) t h ea c t i v i t yo fn r - k 十一a t p a s ea n dc a z + - a t p a s ei ng r o u pe la n d e 2w a sh i g h e rt h a ng r o u pm ( p o 0 5 ) t h ea c t i v i t yo fn a + - k + - a t p a s ea n d c a a + - a t p a s ei ng r o u pe 2w a sh i g h e rt h a ng r o u pe 1 ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ： 1e d a r a v o n ec a nr e d u c ei s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r yo fr a t s ，h a v et h e p r o t e c t i v ee f f e c to nr e p l a n t e dl i m b 2t h em e c h a n i s mm a yb ei n c r e a s e di nt h ea c t i v i t yo fs o d ，m i m c h o n d r i a n a - a t p a s ea n dc a 2 + a t p a s e d e c r e a s e dt h ec o n t e n to fm d a k e yw o r d s ：e d a r a v o n e ；l i m br e p l a n t a t i o n ；i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r r ；r a t s ；s k e l e t a lm u s c l e 5 研究论文 依达拉奉对大鼠再植断肢的保护作用 屿- 剽青 断肢( 指) 再植的根本目的是重建离断肢体的连续性，最终使肢体恢复 良好的功能。但在一定条件下恢复血液再灌注后，部分细胞功能代谢障碍 及结构破坏不仅未减轻反而更加严重，这种现象称为缺血再灌注损伤 ( i s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r yi r i ) 。缺血再灌注损伤是个多机制参与的损伤 过程，能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基、白细胞介导的炎症反应等 因素在骨骼肌缺血再灌注损伤中起关键作用。如何尽量减少再植肢体缺血 再灌注损伤程度，最大限度的恢复再植肢体的功能是临床医生普遍关注的 问题。 依达拉奉是一种新型自由基清除剂，通过提供电子直接清除o h 从 而抑制自由基的生成及细胞膜、线粒体膜结构脂质过氧化连锁反应；另一 方面，依达拉奉在一定程度上可能增加了线粒体s o d 活性，从而增强其 抗损伤能力，维持了线粒体结构的完整性和细胞正常的氧化磷酸化，促进 再灌注骨骼肌细胞a t p 合成能力的恢复，减轻肢体缺血再灌注损伤。本 实验拟通过建立大鼠断肢再植模型，探求依达拉奉对再植后断肢的保护作 用。 材料与方法 1 主要仪器设备及器械 h m 2 0 0 电子天平：日本 v e r s a m a x 酶标测试仪：美国 6 0 0 型电热恒温水箱：天津市医疗设备厂 n 6 b 烤片机：湖北孝亚光电子技术研究所 q p 切片漂烘温控仪：安徽电子科学研究所 b x 5 1 光镜照相机：奥林巴斯公司，日本 p m - 1 0 a 型光学显微镜：奥林巴斯公司，日本 h - 7 5 0 0 透射电子显微镜：o i 删7 s 公司，日本 研究论文 2 6 7 6 r a m 载玻片：中国青岛 s c 2 7 8 l 冰箱：中国海尔 l d 5 2 a 低速离心机：北京医用离心机厂 眼科剪组织剪 眼科镊组织钳 无创血管夹纤维器械 2 药品和试剂 依达拉奉注射液：南京先声东元制药有限公司，批号8 0 0 9 0 7 1 1 ，1 0 m g 支。 肝素钠注射液：南京新白药业有限公司，批号0 9 1 0 0 2 ，1 2 5 0 0 u 支。 氯化钠注射液：石家庄四药有限公司。 水合氯醛：天津市永大化学试剂开发中心。 超氧化物歧化酶( s o d ) 试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号： 2 0 0 9 11 0 2 。 丙二醛( m d a ) 试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：2 0 0 9 1 1 0 2 。 a t p 试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：2 0 0 9 11 0 2 。 b c a 蛋白测试试剂盒：美国p i e r c e 公司。 3 实验动物 清洁级健康雌性s d 大鼠，体重2 3 0 - - 2 5 0 9 ，由河北医科大学实验动物 中心提供，动物合格证编号：9 1 2 0 9 6 。置于温度为2 5 。c 的净化实验室内， 混合食料自由饮水喂养一周。 4 试验方法 4 1 分组 将大鼠随机分为4 组，每组1 0 只。 s 组：假手术组。 m 组模型组：即断肢再植模型组。 e l 组依达拉奉低剂量组：即再灌注前静注依达拉奉0 5 m g k g 。 e 2 组依达拉奉高剂量组：即再灌注前注依达拉奉1m g k g 。 4 2 模型建立 实验前大鼠禁食1 2 h ，不禁水。1 0 水合氯醛4 m l k g 腹腔注射，麻醉 成功后，将大鼠仰卧固定于手术台上。右后肢常规皮肤消毒，自腹股沟处 研究论文 做纵行切口，显露并游离股动静脉及股神经，钝性分离各层组织，于右股 骨中段水平切断所有股部肌肉至股骨，只保留血管。右后肢驱血后以血管 夹夹闭右侧股动静脉，室温下放置3 h ，放松血管夹，形成再灌注，缝合肌 肉、神经及皮肤。对照组仅游离出股动静脉，旷置3 h 后缝合皮肤【l 】。术野 用生理盐水浸湿的无菌纱布覆盖，所有操作在室温( 约2 0 c ) f 进行。 首先挤压右下肢体驱血，然后夹闭右股动静脉后，动脉远心端血管搏 动消失，血管腔塌陷变细，近心端则稍增粗；静脉远心端血管腔均塌陷变 细；后肢远心端及足趾皮肤由红润变为苍白，温度变凉，说明断肢模型建 立成功。松开血管夹后，可见股动脉远心端血管搏动复现；股动、静脉粗 细复原；右后肢远心端及足趾皮肤由苍白转为红润，温度转为温暖，显示 再灌注成功。术后2 4 h 断肢的皮肤颜色红润，温度温暖，活动自如，再植 模型复制成功。 4 3 各组操作及用药 大鼠成功麻醉后固定，m 组行上述操作，s 组仅游离出股动静脉，旷 置3 h 后缝合皮肤。再灌注前各组均由尾静脉给予肝素钠1 0 0 0 u k g 全身肝素 化。e l 、e 2 组除与m 组上述操作相同外，于再灌注前分别给依达拉奉 0 s m g k g 和l m g k g 鼠尾静脉注射。s 组和m 组给等量的生理盐水鼠尾静脉 注射。实验全过程保证动物体温在3 6 - - 3 7 。 4 4 标本采集 每组于再灌注5 h 和2 4 h 分别经颈外静脉取血各l m l ，静置后离心，测定 血清超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性及丙二醛( m d a ) 的含量。并于再灌注 2 4 h 取右后肢腓肠肌l c mx1 c m l c m ，2 0 保存，用于提取线粒体测定骨 骼肌线粒l z l s ：n a + k + - a t p 酶、c a 2 * a t p 酶活性的变化。另取右后肢胫前肌用 多聚甲醛固定，4 冰箱保存，用于光镜标本的制备。再取右后肢胫前肌 l m mxl m m x 3 r a m ，用4 戊二醛固定，用于电镜标本的制备。 4 5 测定指标及方法 4 5 1 骨骼肌组织切片标本制备 4 5 1 1 脱水包埋及切片：取上述多聚甲醛固定好的胫前肌标本浸入p b s 液中两次，每次3 0 m i n ，再用p b s 液浸泡过夜，4 c 保存。然后p b s 液再浸 泡2 1 1 后，经过7 0 、8 0 、9 0 、9 5 酒精各一次及1 0 0 酒精两次脱水后， 二甲苯透明，浸蜡3 d , 时，然后石蜡包埋、修块。用砌屺1 2 6 i 玎切片机进 研究论文 行连续石蜡切片，层厚5um 。 4 5 1 2 将上述切片常规脱蜡二甲苯两次各十分钟、1 0 0 酒精两次，9 5 、 9 0 、8 0 、7 0 酒精各5 m i n ，然后用蒸馏水冲洗。 4 5 1 3 苏木精染色1 5 m i n ，自来水冲洗。 4 5 1 41 盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗浸泡数分钟，o 5 伊红酒精浸 染3 0 s 。 4 5 1 5 常规梯度酒精脱水7 0 、8 0 、9 0 酒精各l m i n ，9 5 及1 0 0 两次 各5 m i n ，二甲苯两次各5 m i n ，中性树胶封片，自然晾干。 4 5 1 6 在光镜高倍视野下观察肌纤维及间质的改变。 4 5 2 骨骼肌透射电镜标本制备 4 5 2 1 取4 戊二醛固定好的胫前肌标本在4 c 下用1 锇酸固定1 2 h 。 4 5 2 2 用p b s 液冲洗三次，各1 0 - - - 1 5 m i n 。 4 5 2 3 酒精梯度脱水5 0 、7 0 、8 0 、9 0 及1 0 0 两次各1 0 - - 1 5 m i n 。1 0 0 丙酮脱水两次，各1 0 - - - 1 5 r a i n 。 4 5 2 4 在室温下用包埋液浸透3 h 后包埋组织块。 4 5 2 5 超薄切片机切片，厚度约5 0 n m 。醋酸铀及柠檬酸铅双重染色。 4 5 2 6 透射电镜下观察肌原纤维的排列情况，及线粒体结构的改变。 4 5 3 生化指标的测定 4 5 3 1 组织生化指标 用无机磷显色光电比色法测定n a + k + a t p 酶、c a 2 + _ a t p 酶活性。测定 时，将冰箱保存的骨骼肌组织o 1 9 ，按1 ：9 ( 质量比) 加入匀浆介质( p h 7 4 、 0 0 1 m o l lt r i s h c l 、0 0 0 1 m o l le d t a 2 n a 、0 0 1 m o l l 蔗糖、质量分数为 o 8 的氯化钠溶液) ，在低温下制备成1 0 的组织匀浆，低温低速离心机 1 5 0 0 r m i n 离, 1 2 , 1 0 m i n ，取上清液用低温高速离心机1 2 0 0 0 r r a i n 离, l , 1 5 m i n ， 沉淀物即为线粒体，用o 1t n l 匀浆介质重悬沉淀。 试剂一：1 0 m l ，4 c 保存。 试剂二：1 0 m l ，4 。c 保存。 试剂三：1 0 m l ，4 c 保存。 试剂四：粉剂3 支，每支稀释至5 m l 。 试剂五：粉剂1 支，稀释至5 m l 。 试剂六：粉剂1 支，稀释至1 0 m l 。 研究论文 试剂七：1 0 m l ，加双蒸水稀释至2 5 m l 。 试剂八：粉剂3 瓶，一瓶加双蒸水稀释至4 0 m l 溶解。 试剂九：粉剂l 瓶，每瓶加双蒸水稀释至l o o m l 溶解。 试剂十：2 5 m o l l 硫酸l o o m l ，4 c 保存。 试剂十一：l o m m o l l 标准磷储备液l o m l ，4 保存。 1l am o l l 标准磷应用液配制：将储备液1 0 倍稀释。 定磷剂的配制：按h 2 0 ：2 5 m o l l 硫酸：试剂八：试剂九- 2 ：1 ：l ：1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。 所测指标均用组织蛋白含量校正。b c a 法蛋白定量操作步骤：( 1 ) 制 备工作酶：根据标准品和样品数量试剂a ：试剂b 为5 0 ：1 ，即b c a 工作 酶。充分混匀，b c a 工作液室温2 4 h 内稳定，4 c ，一周。( 2 ) 稀释标准品： 、取1 0u1 标准品用p b s 稀释至1 0 0ui ( p b s ) ，使终浓度为0 5 m g m l 。将标准 品按0 、1 、2 、4 、8 、1 2 、1 6 、2 0l al 加到孔板的蛋白标准品孔中，力 i p b s 补足至l j 2 0ul 。( 3 ) 加适当体积样品到9 6 孔板的样品孔中，补p b s 到2 0l al 。 ( 4 ) 各孔加入2 0 0ulb c a 工作液，3 7 c ，3 0 m i n 。( 5 ) 冷却到室温，酶标仪测 定a5 6 2 n m 。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 计算： 。a t p a s e 澍j ，：詈标( 瀚1mof度锄la m o l p i m gp r o th 1m o l m l ，删 ( ) 标准管 ) 稀释倍数 x6 + ( 嚣篇) 4 5 3 2 血生化指标 将所取血液经离心机离心后取血清2 0 c 冻存。 4 5 3 2 1 超氧化物歧化酶( s o d ) 活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法。 试剂一：贮备液：5 m l 加蒸馏水稀释至5 0 m l ，4 c 保存。 试剂二：5 m l 。 试剂三：5 m l 。 试剂四：3 5 0 9 l l ；4 号稀释液5 m l 。二者按1 ：1 4 稀释。 试剂五：粉剂1 支，加7 0 - 8 0 ( 2 热双蒸水3 7 5 m l 溶解后备用，避 光4 冷藏。 研究论文 试剂六：粉剂1 支，加双蒸水3 7 5 m l 溶解后备用，避光46 c 冷藏。 显色剂：按照试剂五：试剂六：冰醋酸= 3 ：3 ：2 体积配制，避光4 。c 冷藏。 计算： 血清中总s o d 活力对照管吸光度一测定管竺光度 ( u m 1 ) 对照管吸光度 x 样本测试前的 稀释倍数 5 0 销黼的 4 5 3 2 2 丙二醛哪) 含量的测定采用硫代巴比妥法。 试剂一：液体1 0 m l ，室温保存。 试剂二：6 m l ，加1 7 0 m l 双蒸水混匀，4 。c 冷藏保存。 试剂三：粉剂1 支，加9 0 1 0 0 热双蒸水3 0 m l 中，溶解后补足 至3 0 m l 再加冰醋酸3 0 m l ，混匀备用，避光冷藏。 标准品：1 0 n m o l m l 四乙氧基丙烷5 m l ，4 冷藏。 计算： 血清中g d a 含量 ( n m o l m 1 ) 一 测定管吸光度一测定空白管吸光度 标准管吸光度标准空白管吸光度 样本测试前 7 稀释倍数 标准品浓度 ( 1 0 r i m 0 1 m 1 ) 5 统计方法 采用s p s s l 3 0 统计软件包进行统计分析，计量资料以均数标准差 ( x - t s ) 表示。组间比较采用多个样本均数比较的单因素方差分析。p o 0 5 为差异有统计学意义。 结果 1 肉眼观察：s 组右后肢肌肉、皮肤红润温暖。m 组右后肢肌肉、皮肤颜 色稍暗红，温度稍低。e l 组右后肢外观改变较m 组减轻。e 2 组右后肢外 研究论文 观较m 组有明显的改善。 2 骨骼肌组织学 2 1 骨骼肌组织切片观察：s 组肌纤维基本正常，间质无水肿，未见炎细 胞浸润，见f i g 1 。m 组肌纤维结构紊乱，崩解，血管扩张充血，间质水 肿，有较多的炎细胞浸润，见f i g 2 。e l 组肌纤维轻度水肿，间质稍水肿， 有炎细胞浸润，见f i g 3 。f - a 组间质稍水肿，肌间散在炎细胞浸润，见f i g 4 。 2 2 透射电镜观察：s 组肌原纤维排列整齐，z 线清晰。线粒体嵴致密，膜 完整，无肿胀，见f i g 5 。m 组肌原纤维部分断裂，z 线较模糊。线粒体明 显肿胀，嵴紊乱，部分空泡化，见f i g 6 。e l 组肌原纤维排列较整齐，z 线 稍模糊，含有较多的脂滴，线粒体部分空泡化，见f 培7 和f i g 8 。e 2 组肌 原纤维排列较整齐，z 线较清晰，含有少量脂滴，线粒体部分空泡化，见 f i g 9 和f i g 1 0 。 3 生化指标 3 1 血清s o d 活性及m d a 含量： 血清s o d 活性：与s 组比，m 、e l 、e 2 组s o d 活性均降低( p o 0 5 ) 。与 m 组比，e l 、e 2 组s o d 活性均升高口 o 0 5 ) 。与e l 组比，e 2 组s o d 活性升 高( p o 0 5 ) 。再灌注2 4 h 时，m 、e l 、e 2 组s o d 活性较5 h 时低。见f i g 1 1 和 m 出l e1 。 血清m d a 含量：与s 组比，m 、e l 、e 2 组m d a 含量均升高口 o 0 5 ) 。 与m 组比，e l 、e 2 组m d a 含量均降低( p o 0 5 ) 。与e l 组比，e 2 组m d a 含量 降低 o 0 5 ) 。再灌注2 4 h 时，m 、e l 、e 2 组m d a 含量较5 h 时高。见f i g 1 2 和t ，出l e2 。 3 2 骨骼肌线粒倒k n a + - k + - a t p 酶、c a 2 + a t p 酶活性： 与s 组比，m 、e l 、e 2 组n 矿k + a r p 酶、c a 2 + - a t p 酶活性均降低( p o 0 5 ) 。 与m 组比，e l 、e 2 组n r k + a t p 酶、c a 2 + a t p 酶活性均升高( p 0 0 5 ) 。与 e l 组比，e 2 组n r k + - a t p 酶、c a 2 + 仰酶活性升高口 o 0 5 ) 。见f i g 1 3 、1 4 和t a b l e3 。 研究论文 附图 f i g 1t h ep a t h o l o g i c a lf i g u r ei nm u s c l et i s s u eo fg r o u ps ( h e ：4 0 0 ) f i g 2t h ec h a n g eo fh i s t o p a t h o l o g yi nm u s c l et i s s u eo fg r o u pm ( h e ：x4 0 0 ) 、霭。，乞弧 研究论文 f i g 3t h ec h a n g eo fh i s t o p a