（水生生物学专业论文）中华绒螯蟹性腺抑制激素纯化及其部分生化特性的研究.pdf

摘要摘要本文以甲壳动物十足类中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 的眼柄视神经节为材料，通过超声波破碎并加热离心，得到眼柄激素粗提液，之后应用反相层析的方法，分离得到1 3个样品。通过检测血糖浓度的方法确定了高血糖素的范围，进而确定了性腺抑制激素活性鉴定的重点范围。高血糖素实验中，样品9 具有高血糖的作用，且非常明显，可以确定是高血糖素或者含有高血糖素。采用异源生物日本沼虾( m a c r o h r a c h i u m n i p p o n e n s e )卵母细胞，与分离的样品共同培养以检测样品的性腺抑制活性；另外还通过同种活体注射实验检测分离样品的性腺抑制活性。结果显示其中注射样品6 的实验动物卵母细胞直径最小，抑制率最高，为5 9 0 3 。进一步分离后测定其生化性质。t r i c i n es d s p a g e电泳显示8 条蛋白带；其中1 4 4 k u 以下的有两条；等电聚焦电泳显示样品的等电点在4 7 6 4 之间。关键词：中华绒螯蟹；视神经节：性腺抑制激素；活性鉴定：生化性质a b s t r a c ta b s t r a c tt h r o u g hu l t r a s o n i cf r a g m e n t a t i o n ，h e a ta n dc e n t r i f i l g a 廿o n ，t h ec r u d eh o r m o n e sl i q u i do fe r i o c h e i rs i n e n s i s o p t i cg a n g l i aw a so b t a i n e d ，a n da l s o1 3s a m p l e sa f t e rt h ef u r t h e ri s o l a t i o nb yr e v e r s e dp h a s ec h r o m a t o g r a p h y ( r u , c ) t h ea c t i v es c o p eo fg o n a di n h i b i t i o nh o r m o n ew a sd e t e r m i n e db yt h ed e t e r m i n a t i o no fh y p e r g l y c a e m i ca c t i v i t y i nt h eb i o a s s a yf o rh y p e r g l y e e m i ca c t i v i t y , t h eh y p e r g l y c e m i ca c t i v i t yo fs a m p l e9w a ss i g n i f i c a n t t h es a m p l e9w a se s t i m a t e dt ob eo rc o n t a i n i n gh y p e r g l y c e m i ch e r m o n e t h eo o c y t eo fm a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s e ，w h i c hc u l t u r e dw i t hi s o l a t e ds a m p l e s w a su s e da sh e t e r o l o g o u si nv i t r ob i o a s s a y t h ei nv i v ob i o a s s a yw a sa d a p t e dh o m o l o g o u sb i o a s s a yb yi d j c o t i n gt h ei s o l a t e ds a m p l e s a l lt h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h es a m p l e6a c t e dg o n a di n h i b i t i n ga c t i v i t y a f t e rf u r t h e ri s o l a t i o n ，t h ec h a r a c t e ro ft h ea c t i v es a m p l ew a sa n a l y z e d t h et r i c i n es d s p a g er e v e a l e d8b e l t so fp r o t e i n u n d e r1 4 4 k u 。t h e r ew e r et w ob e l t s i s o e l e c t r i cf o c u s i n ge l e c t r o p h o r e s i s ( i e f e )s u g g e s t e da l s ot h a tt h e r ew e r eh y b r i d p r o t e i n s t h ei s e l e c t r i cp o i n tw a sa b o u t 4 7 6 4 k e y w o r d ：e r i o c h e i rs i n e n s i s ；o p t i cg a n g l i a ；g o n a di n h i b i t i n gh o r m o n e ；b i o a s s a y ；b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s河北大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：趁耋丞日期：垫生年上月日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。，2 、不保密日。( 请在以上相应方格内打“”) 作者签名：丝查基导师签名：虚塑丛兰日期：丛! 【年一月日日期：趁堑年厶月血第1 章绪论第1 章绪论1 1 研究现状甲壳动物内分泌腺包括x 一器官一窦腺复合体、同心腺，y 一器官、雄性腺和大颚器等。其中x 器官窦腺复合体是甲壳动物重要的神经内分泌器官。存大多数有眼柄的种类中，该器官位于眼柄。许多神经肽类激素，包括蜕皮抑制激素( n l o t i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m i h ) 、性腺抑制激素( g o n m d q n h i b i t i n gh o r m o n e ) 又称卵黄发生抑制激素( v i t e l l o g e n i n i n h i b i t i n gh o r m o n e ，v i h ) 、大颚器抑制激素( m a n d i b u l a ro r g a ni n h i b i t i n gh o r m o n e ，m o i h ) 和高血糖素( c r u s t a c e a n h y p e 唧y e a e m i ch o r m o n e ，c h h ) 等，都是在x器官一窦腺中分泌和储存的。这些激素调控着甲壳动物的蜕皮、生殖、帆糖平衡和体色变化等多种重要的生理功能。近年来对甲壳动物激素的研究，已经成为围内，b * f 1 关研究的热点。国外对甲壳动物所特有的高血糖素家族神经激素，在分子水平上进行了广泛的研究，积累了大量的基础性资料。对甲壳动物尤其是养殖种类生殖内分泌的研究，可以增加养殖的产量，提高养殖动物体内具有更高价值蛋白的古量”。甲壳动物内分泌激素的研究己经成为备受国内外学者关注的新的领域。国内，有关甲壳动物内分泌方面的研究还是刚刚起步”，与生殖密切相关激素的研究也逐渐成为该领域的热点。中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 俗称河蟹，是我国特有的珍贵水产养殖动物，对其生殖生物学、遗传学等许多方面，已有很多学者进行过比较系统的研究，为泼品种的养殖生产提供了宝贵的基础资料，但有关内分泌方面的研究却足刚刚起步，尤其尾与养殖效益密切相关的内分泌研究同国外相比差距较人。河蟹性早熟是养殖过程中普遍存在的问题，会给养殖业带来巨人的损失。性早熟的根本原凼是幼蟹体内神经激素的分泌和代谢失调，尤其是，与性腺抑制激素的分泌和代谢失调密切相关。为了根本解决河蟹性早熟问题，性腺抑制激素基本性质的研究己成为关键环节之一。1 i 1 中华绒螫蟹视神经节以及卵巢发育河蟹的眼柄视神经节位丁_ 复眼之下，呈乳白色，椭球形。视神绎节主要由神绎分泌细胞、视觉神经细胞和胶质组成，外而有一层结缔组织膜包裹，视神经甘自r 到下分为外髓( m e d u l l ae x t e r n a ，m e ) ；内髓( m e d u l l ai n t e m a ，m i ) 和端髓( m e d u l l at e r m i n a l i a ，m t ) 三部分。外髓的端凹陷，形似“椅状”，表而大部分有视觉神经细胞分布，基本m t ) 三部分。外髓的端凹陷，形似“椅状”，表面大部分有视觉神经细胞分布，基本河北大学理学硕士学位论文没有神经分泌细胞；内髓呈椭球状，与外髓连接处有视觉神经细胞分布，在靠近窦腺上方与端髓相连处( e 3 ) 有一些神经分泌细胞；端髓外观像一个椭圆球，是三部分中体积最大的，其中部有一凹沟，将它分成大、小不等的两部分，后者与内髓相连，端髓表面也有部分视觉神经细胞分布，在端髓下部( e 1 ) 和中部背侧( e 2 ) 有大量的神经分泌细胞，凹沟处( e 4 ) 也有神经分泌细胞分布，并与内髓神经分泌细胞连成一片。神经分泌细胞轴突末端聚集在一起形成窦腺，是储存激素的场所，窦腺位于内髓与端髓之间侧面，略偏端髓( 图1 ) ”1 。电镜下河蟹眼柄中神经分泌末梢可区分为6 种不同类型( 也有将其划分为5 种类型3 和2 种类型4 种亚型的”1 ) ，窦腺中的神经分泌物质是以胞吐的方式释放到血液中。m e ：外髓( m e d u l l ae 缸e m a ) ；m i ：内髓( m e d u l l a i n t e m a ) ；m t ：端髓( m e d u l l a t e r m i n a l i a )s g ：窦腺( s i n u sg l a n d ) ；e l ：端髓下部；e 2 ：端髓中部背侧；e 3 ：窦腺斜上方内髓部：e 4 ：端髓凹沟部。：细胞类型1 ；v ：细胞类型2 ；口：细胞类犁3 ；：细胞类型4 o ：细胞类型51 中华绒螯蟹眼柄左侧面观2 中华绒螯蟹眼柄右侧面观图1 1 中华绒螯蟹眼柄神经节与神经分泌细胞、窦腺的分布位置( 摘自康现江等1 9 9 8 )f i g 1 1o p t i cg a n g l i ao f e s i n e n s i s ，t h ed i s t r i b u t i o no f n e u r o s e c r e t o r yc e l l s ，a n dt h ep o s i t i o no ft h es i n u sg l a n d甲壳动物眼柄视神经节分泌的激素具有重要的生理功能，其中性腺抑制激素的作用主要是抑制雄体促雄性腺的活性，和抑制雌体的卵黄发生及性腺刺激因子的生成，而且对肝胰腺合成卵黄蛋白及大颚器合成甲基法尼醇( m e t h y lf a r n e s o a t e ，m f ) ( 该激素在- 2 -第1 章绪论甲壳动物体内可能转化为保幼激素) 也有抑制作用。近年来，作为我国重要的经济水产养殖品种的河蟹，在各地养殖过程中普遍出现性早熟现象，给养殖业带来很大损失。河蟹性早熟与幼蟹体内神经激素的分泌和代谢失调密切相关。对比l 龄蟹种、早熟蟹种和2 龄成熟河蟹窦腺的形态结构没有明显的差异，但神经颗粒的释放情况却明显不同，这从形态结构上证实了，窦腺中的神经分泌激素对河蟹的性腺发育具有调控作用。我国对甲壳动物神经内分泌系统的研究刚刚开始。1 ，河蟹性早熟的产生原因并不十分清楚，初步认为主要是养殖过程中有效积温过高和营养过剩所致”。性早熟蟹种没有任何养殖价值，因而会给养殖户带来较大的损失m ”1 。国内有关河蟹生殖内分泌的研究还主要是形态观察以及组织形态观察，因此正确识别早熟蟹种，并采取有效措旌防止蟹种早熟现象的发生，是河蟹养殖中亟待解决的问题。因此要根本解决性早熟的问题，就需要对性腺抑制激素进行深入的研究。在雄体中性腺抑制激素是作用于促雄性腺，而雌体中则是直接作用于卵巢，抑制卵黄蛋白的合成。雌体中性腺抑制激素的受体是卵母细胞本身，还是滤泡细胞还有待进一步的研究。河蟹的成熟卵，也就是已具备受精能力的蟹卵，是正处于第一次成熟分裂中期的初级卵母细胞“1 。河蟹性腺抑制激素的靶器官之一的卵巢在早期很小，位于心脏和内肠道的背面，呈透明状，约3 m m 大小，左右各有一个，主要由疏松结缔组织和内生殖上皮构成。原始生殖细胞团紧贴于内生殖上皮的侧面，原始生殖细胞呈圆形，核大而明显，胞质呈弱嗜碱性。到6 月下旬，卵巢外观呈白色。卵巢内仍有大量疏松结缔组织和内生殖上皮，内生殖上皮将卵原细胞分隔成一个个发育区。各发育区内主要以小生长期的初级卵母细胞和卵原细胞为主。卵巢发育到一定阶段，约7 月上旬，各发育区之间逐渐汇合，基本具有卵巢的整体形态，卵巢内仍以卵原细胞和小生长期的初级卵母细胞为主，已有大量滤泡细胞。到9 月份，卵巢呈h 形，白色，卵巢内已开始有大生长期l 的初级卵母细胞形成，其周围已有单层滤泡细胞包围。1 0 月份，卵巢体积已较大，呈浅咖啡色，其中已有大生长期2 的初级卵母细胞形成，滤泡细胞成极薄的扁平细胞层，紧贴在初级卵母细胞的周围。此外，卵巢中尚有各级卵母细胞并存。1 1 月份的卵巢已呈豆沙色，几乎充满整个体腔，卵巢内主要以成熟前期的初级卵母细胞为主。到1 2 月份时，卵子已基本成熟，卵巢呈深豆沙色，充满整个体腔，卵粒明显，已从滤泡腔中游离出来，细胞核消失。卵黄的形成，也就是卵母细胞内卵黄的合成与集聚，发生在分裂前期。事实上在卵母细胞发育至小生长期初级卵母细胞时，卵黄蛋白的积累就开始了“，3 河北大学理学硕士学位论文也就是说此时性腺抑制的作用已经明显减弱，有可能是性腺抑制激素分泌量减少了，也可能是其它激素作用问的相互协调导致了性腺抑制激素作用的减弱。蟹卵一旦成熟，卵黄的合成与集聚也就完成了“”。根据雌性河蟹的发育过程可以看出性腺抑制激素最有可能存在，或者说分泌量最多的时期应该是河蟹发育的早期，即卵巢具有了整体的形态到卵母细胞大生长期前的这一段时间。1 1 2 甲壳动物高血糖素家族高血糖素家族( c r u s t a c e a nh y p e r g l y c a e m i ch o r m o n e s ，c h h s ) 是甲壳动物特有的。“”3 ，这些激素只分布在眼柄而非其它神经系统中，包括蜕皮抑制激素、性腺抑制激素( 又称卵黄发生抑制激素) 、大颚器抑制激素和高血糖素。高血糖素家族是在甲壳动物眼柄x 一器官中合成，通过轴突神经束运送到窦腺储存，并释放到血液，这种特别的神经分泌路线表明这些激素是血液依赖激素o “。1 1 2 1 高血糖素高血糖素、蜕皮抑制激素和性腺抑制激素同属于甲壳动物高血糖素家族，因为他们具有相似的结构：氨基酸序列同源，通常都是7 2 7 8 个氨基酸残基的长度，且成熟肽中都具有六个保守的半胱氨酸残基形成三个二硫键。“。自2 0 世纪9 0 年代初，人们开始关注这一甲壳动物所特有的神经激素家族。高血糖素家族是在甲壳动物服柄中的x 一器官中合成，通过神经轴突运送到窦腺储存，并释放到血液。x 一器官一窦腺复合体是一个非常重要的神经调节系统，是调节多种重要生命活动的神经激素分泌和储存的重要部位。通过切除眼柄和器官移植的方法证明，眼柄中存在许多重要的生理功能调控因子，这些神经激素在甲壳动物正常的生理活动中起着重要的作用。高血糖素主要调节碳水化合物的代谢，除此之外，还在生殖以及蜕皮方面具有重要的调节作用。”；而蜕皮抑制激素和性腺抑制激素的作用则是调节甲壳动物的蜕皮和生殖。2 ”。1 9 9 1 年研究发现美洲龙虾( h o m a r u sa m e r i c a n u s ) 的高血糖素表现出交叉的高血糖和卵黄发生( 性腺) 抑制的作用，而性腺抑制激素却没有高血糖的作用o “。高血糖素主要调节血糖，也有人指出这一激素同时调节生殖和蜕皮。墨西哥小龙虾( p r o c a m b a r u sb o u v i e r i ) 的高血糖素和已经研究过的其它物种的高血糖素的序列非常相似，同时位于羧基末端的四个氨基酸残基似乎与高血糖素受体反应以及种属特异性有关。”。通过与纯第1 章绪论化的主要靶器官肝胰腺的质膜的结合试验，确定了滨蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) 和小龙虾( o r c o n e c t e sl i m o s u s ) 的高血糖素在几种组织膜上的受体3 。异源置换实验反映出高血糖素具有一定种的特异性，而且高血糖素生物活性的特异性表明，激素与受体是共同进化的。1 。甲壳动物高血糖素经常在眼柄中以多个单体的形式出现。通过反相高效液相色谱( r p h p l c ) 分离纯化美洲龙虾的高血糖素i i ，发现它是由7 2 个氨基酸残基组成，分子量是8 3 8 8 k u ，由六个半胱氨酸在7 4 3 、2 3 2 9 和2 6 5 2 位形成三个二硫键。同时发现，高血糖素i 和高血糖素i i 是由两个不同的基因产生的啪1 。通过反相高效液相色谱分离墨西哥小龙虾窦腺中的多肽激素，并确定其生物活性；通过研究还发现单个眼柄中各种激素的含量分别是：性腺抑制激素：5 n g ，蜕皮抑制激素：1 8 n g ，高血糖素i ：6 0 n g ，高血糖素i i ：2 0 n g ，它们的序列相似性极高；都由7 2 个氨基酸残基构成，分子量8 3 8 4 k u 之间，具有封闭的氨基和羧基末端，六个保守的半胱氨酸形成三个二硫键；这些激素的肽链中缺少组氨酸、蛋氨酸和色氨酸”“。通过反相高效液相色谱，分离墨西哥小龙虾的高血糖素i i ，并分析其基本结构。确定它是由7 2 个氨基酸残基构成，分子量8 3 8 8 k u ，由六个半胱氨酸在7 - 4 3 、2 33 9 和2 6 5 2 形成三个二硫键，具有封闭的氨基末端”“。研究发现滨蟹高血糖素两个单体的氨基酸顺序相同，但其氨基末端分别是谷氨酰胺和焦谷氨酰胺。有限的分析( 电喷射m s 和氨基酸组成) 表明黄道蟹( c a n c e r p a g u r u s )的两个相应的高血糖素单体也表现出相同的现象。具有游离或者封闭的末端的高血糖素单体表明，n 末端的焦谷氨酸残基没有明显的生物活性，并且封闭或未封闭的n 末端并不影响多肽的稳定性和生物活性1 。接下来通过反相高效液相色谱又分离出五个具有活性的斑节对虾( p e n a e u s j a p o n 耙u s ) 高血糖素单体，它们都是由7 2 个氨基酸组成，具有氨基化的氨基末端和酰氨化的羧基末端，序列相似性很高。花纹石蟹( c h a r y b d i sf e r i a t u s ) 的蜕皮抑制激素与高血糖素性腺抑制激素具有高度相似性，这些激素通常是由7 2 - 7 8 个氨基酸残基构成并且氨基酸序列相似，具有六个位置保守的半胱氨酸残基。”。对比美洲龙虾的性腺抑制激素”1 、滨蟹的蜕皮抑制激素和高血糖索，以及对比小龙虾和美洲龙虾的高血糖素家族的前体发现，只有高血糖素具有信号肽。通过高效液相色谱分离并研究食用黄道蟹高血糖素i 和高血糖素i i ，二者只在氨基末端有些不同：高血糖素i 的n 末端是谷氨酰胺而高血糖素i i 是焦谷氨酰胺。通过生物测试发现它们具有相同的生物活性洲。研究还发现有些种类的高血糖素，它们也具有焦谷氨酸封闭的氨基末端，e 河北大学理学硕士学位论文和酰氨化的羧基末端o 。分离并纯化罗氏沼虾( m a c r o b r a c h i u m r o s e n b e r g i i ) 的一种高血糖素，发现它是由7 1个氨基酸组成与其它甲壳动物的高血糖素相比有4 5 6 8 的相似性。用免疫化学分析和细胞免疫化学定位的方法，确定罗氏沼虾眼柄中的商血糖素，它是由7 2 个氨基酸组成，并且推测苏氨酸应该出现在第7 l 位o 。通过c d n a 转录克隆的方法，研究刀额新对虾( m e t a p e n a e u se n s i s ) 的一种高血糖素样神经肽时发现，它还可能在雌虾的性腺成熟周期中起着重要的作用 4 0 o 斑节对虾高血糖素家族激素的分子量范围在7 - 9 k u ，分子内有三个二硫键“。史密斯对虾( pl i t o p e n a e u s ) 的高血糖素，分子量是8 3 5 9 k u ，具有游离的氨基末端和酰氨化的羧基末端，其三个二硫键的位置与已知的高血糖素相同，与斑节对虾的高血糖素相比具有9 0 的序列相似性“”。1 1 2 2 蜕皮抑制激素斑节对虾的蜕皮抑制激素由7 7 个氨基酸残基组成，具有游离的氨基酸末端，它与滨蟹的蜕皮抑制激素的序列表现出高度的相似性“。在研究美洲龙虾的蜕皮抑制激素时发现，它还具有高血糖的作用“。k e l l e r 指出尽管不同的激素之间的关系并不像高血糖素单体间那样近，蜕皮抑制激素在同种中与其它高血糖素的序列对比，表明它们就属于同一个家族。高血糖素和蜕皮抑制激素的长度不同，前者是7 8 个氨基酸后者是7 2 个氨基酸，其末端都是游离的。性腺抑制激素的序列则更长一些。滨蟹的蜕皮抑制激素和美洲龙虾的性腺抑制激素的序列相似性很高，达到了4 8 ，明显高于同滨蟹高血糖素的相似性。南t 1 1 4 , 龙虾( j a s u sl a l a n d i i ) 的蜕皮抑制激素由7 4 个氨基酸残基组成，分子量9 0 0 6 k u ，具有游离的氨基末端和酰氨化的羧基末端。与其他甲壳动物十足目的蜕皮抑制激素序列相比，有3 6 - 4 3 的相似性，与本种的高血糖素具有3 2 3 4 的相似性”。墨西哥小龙虾的蜕皮抑制激素是由7 2 个氨基酸残基组成，分子量为8 3 2 2 k u ，具有封闭的氨基末端和羧基末端，缺少色氨酸、组氨酸和蛋氨酸，与墨西哥小龙虾的高血糖素相比具有9 0 的相似性，与美洲龙虾的蜕皮抑制激素具有7 9 的相似性，与南美白对虾( pv a n n a m e i ) 的蜕皮抑制激素具有4 6 的相似性“。近年来以眼柄总r n a 为模板，设计兼并引物，进行r t p c r 扩增，得到了鹰爪虾( t r a c h y p e n a e u sc u r v i r o s t r i s ) 、河蟹、锯缘青蟹( s c y l l as e r r a t a ) 和中国明对虾( f e n n r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 的蜕皮抑制激素特异性片断，并推测其相应的氨基酸序列。6 第l 章绪论鹰爪虾蜕皮抑制激素的特异性e d n a 片段由2 1 3 个碱基对组成，推测的氨基酸序列由7 1 个氨基酸组成，它相当于m i h 成熟肽的第5 至7 5 个氨基酸，与其它绝大多数甲壳动物蜕皮抑制激素的氨基酸序列相似性普遍较高，但与甲壳动物c h h 家族其它神经肽相似性较低“。河蟹蜕皮抑制激素的特异性e d n a 片段由2 1 3 个碱基组成。推定的氨基酸序列与甲壳动物的蜕皮抑制激素的相似度最高。比较河蟹部分蜕皮抑制激素与美洲螯龙虾性腺抑制激素氨基酸序列同源性和相似性，可以发现它们的比例很高，分别为4 6 4 和6 2 3 ，该比例甚至高于河蟹蜕皮抑制激素部分氨基酸序列与其它蟹类和螯虾蜕皮抑制激素的同源性和相似性。k l e i j n 等“”认为，美洲龙虾的性腺抑制激素除了具有抑制性腺发育的作用外，还参与蜕皮活动的调控，通过比较很多蟹类的蜕皮抑制激素与美洲龙虾的性腺抑制激素的氨基酸序列，发现它们在结构上具有很高的相似性，与美洲龙虾的性腺抑制激素相类似，河蟹的蜕皮抑制激素也可能对性腺的发育具有调控作用，这需要进一步的实验证实“。编码锯缘青蟹蜕皮抑制激素成熟肽的e d n a 由2 3 4 个碱基组成，由此推测其成熟肽含7 8 个氨基酸残基。该序列不仅与其它短尾类甲壳动物的蜕皮抑制激素氨基酸序列具有高度的同源性( 7 9 9 l ) ，还与该激素同一家族的性腺抑制激素、大颚器抑制激素的氨基酸序列具有较高的相似性。r n a 斑点杂交结果显示，蜕皮抑制激素基因在眼柄神经节及脑组织中均有表达，而在肌肉、中肠腺不表达”1 。中国明对虾蜕皮抑制激素的前体e d n a 编码1 0 3 个氨基酸的蜕皮抑制激素前体分子，包括信号肽和成熟肽，信号肽由2 8 个氨基酸组成，成熟肽由7 5 个氨基酸组成，推导的氨基酸序列与对虾类的蜕皮抑制激素的氨基酸序列同源性最高，其中与日本对虾、斑节虾、刀额新对虾蜕皮抑制激素的同源性分别为9 5 1 、8 3 1 、7 9 1 。“。郭豫杰等“2 1 将河蟹的蜕皮抑制激素成熟肽的e d n a 片段插入到中间载体p m d l 8 t 中，酶切后再将该片段插入到p g e x , - 4 t - 1 表达载体中，构建成表达质粒p g e x - 4 t m i h i 。细胞中经i p t g 诱导表达，得到g s t m i h i 的融合蛋白。这为迸一步深入研究蜕皮抑制激素在中华绒螯蟹蜕皮过程中的作用机制奠定了基础。1 1 2 3 性腺抑制激素性腺抑制激素最初称为卵黄发生抑制激素，是p a n a c s e 在1 9 4 3 年发现并命名的，后来因为它在雄体内也有分泌，并对雄性个体性腺发育也有抑制作用，所以又称为性腺抑制激素。性腺抑铝激素是甲壳动物特有的高血糖素家族中的一员，由眼柄中位于x 器官- 7 -河北大学理学硕士学位论文中神经分泌细胞分泌”1 ，经轴突神经束运送到窦腺暂时储存，之后进入血液循环。“。它的靶器官是肝胰腺、卵巢、大颚器和雄体的促雄性腺。它不仅能够抑制雄体的促雄性腺的活性，还能抑制雌体的卵黄发生及性腺刺激因子的生成，而且对肝胰腺合成卵黄蛋白及大颚器合成甲基法尼醇也有抑制作用。甲壳动物性腺抑制激素是一种具有酸性等电点的热稳定性产物，由7 l 一7 8 个氨基酸残基构成，分子量约为2 - 5 k u 5 5 o去除河蟹的眼柄即去除了性腺抑制激素的作用，可使肝脏结构和氨基酸含量发生变化，并开始为生殖腺发育提供营养物质，促使生殖腺的发育。去除眼柄的雄性河蟹，其精巢发育加快，精子生成和精巢发育同步化”1 。赵维信等“1 发现罗氏沼虾眼柄粗提液低浓度( 1 ：1 0 5 ) 和高浓度( 1 ：1 0 2 ) 组对其卵黄发生早期和成熟前期的卵巢发育具有抑制作用，可使卵母细胞直径显著减小( p o 0 5 ) 。这显然与性腺抑制激素有关。林远生等“7 3 用加热离心的方法，从罗氏沼虾眼柄中获得了性腺抑制激素的租提液，再用凝胶层析和平板电泳等方法进一步分离纯化，得到的性腺抑制激素对罗氏沼虾和日本沼虾卵母细胞的发育都有一定的抑制作用，说明这两种虾的性腺抑制激素在结构和功能上具有相似性。w e e r a w a n 1 在纯化高血糖素同型体时指出，高血糖素、蜕皮抑制激素和卵黄抑制激素具有高度的序列同源性，都由7 2 7 8 个氨基酸残基组成，尤其值得注意的是半胱氨酸残基在序列中的位置几乎相同，因而这几种激素被归入只有甲壳动物才有的高血糖素( c h h ) 家族。性腺抑制激素主要控制着雌体卵黄的发生以及生殖周期。k e l l e r o ”对甲壳动物包括高血糖素，蜕皮抑制激素和性腺抑制激素在内的神经肽的结构、功能及分布进行了深入的研究，证明作为神经激素的神经肽一方面是局部介质，另一方面又是某种调节子，它们往往协同作用于某一生理过程。w a n 等“”通过乙酸提取和层析纯化，色谱分析等方法确定了对虾的高血糖素家族c h h 肽的分子量为7 - 9 k u ，分子内有3 个二硫键，其序列分析表明同其它甲壳动物的c h h 家族相比具有相似性，其中的一个多肽具有平头末端。f i n g e r r n a n 呻1 在研究拳蟹( u c a p u g i l a t o r ) 时发现，其性腺抑制激素是由7 7 个氨基酸残基构成，分子量为2 k u ，具有游离n 末端，推测它的抑制作用是由于同卵黄蛋白竞争卵母细胞膜上相同的受体，从而抑制卵黄的发生；他在研究氯化镉对拳蟹卵巢生长的抑制时，发现镉的作用至少是部分的提高了性腺抑制激素的分泌，性腺抑制激素接着抑制胸神经节中性腺激素的分泌，或者是直接抑制卵母细胞的发育，还可能是抑制胸神经节中性腺激素分泌的同时，又抑制卵母细胞的发育。s o y e zr 第1 章绪论等”“在对美洲龙虾的性腺抑制激素两个同型体( 异源生物测试一个有生物活性，一个没有生物活性) 的氨基酸序列研究中发现，这两个同型体具有相同序列，7 7 个氨基酸残基，分子量为9 1 3 5 k u ，具有游离n 末端。k l e i j n “”发现美洲龙虾的两个性腺抑制激素同型体前体的e d n a ，编码3 1 个氨基酸残基的信号肽和8 1 个氨基酸残基的成熟肽，其间没有前体相关肽或其他序列。k l e i j n 等。”又通过对美洲龙虾的性腺抑制激素c d n a 的克隆与表达的研究，确定了只是眼柄神经内分泌中心具有分泌性腺抑制激素的功能；性腺抑制激素的前体是由一个信号肽和性腺抑制激素本身组成。1 9 9 8 年，k l e i j n 等“13 还对雌性美洲龙虾生殖周期中不同阶段的x 器官中性腺抑制激素的m r n a 水平，窦腺中的存储量以及在血淋巴中的浓度进行了研究，发现未成熟期，美洲龙虾x 器官中性腺抑制激素的m r n a 水平，和窦腺中性腺抑制激素的储存量都很低，但是到卵黄发生前性腺抑制激素在血淋巴中的水平却是高的，由此可见性腺抑制激素可以阻止卵黄发生的开始，并且性腺抑制激素和高血糖素在血淋巴中的含量的平衡，可能能够协调龙虾一年两次的生殖循环中生殖与蜕皮同步化；在眼柄中性腺抑制激素的m r n a 水平的含量在产卵后迅速降低( 仅在卵黄发生恢复前) ，在第二次卵黄发生期间，血淋巴中性腺抑制激素的浓度比整个卵巢周期中的任何时候都低；它的上升是在产卵前卵黄原蛋白浓度下降时，这种在血淋巴中的上升，在产卵后和卵黄发生早期都保持不变“。m e u s y 等”1 研究认为蟹类的性腺抑制激素分子量在2 - 3 k u 之间。o t s u 发现性腺抑制激素既无种类特异性，也无性别特异性“。免疫化学研究发现，甲壳动物性腺抑制激素的结构明显不同于窦腺中其他的神经肽，这使得采用多克隆抗体筛选性腺抑制激素成为可能。但从免疫化学标准上看，性腺抑制激素又不具有严格的种间特异性。美洲龙虾的卵黄抑制激素抗血清又能与其他种类如锯额长臂虾( p a l a e m o ns e r r a t u s ) 、罗氏沼虾、滨蟹和鼠妇( p o r c e l l i od i l a t a t u s ) 的窦腺提取物交叉反应；另外，美洲龙虾的性腺抑制激素免疫反应主要定位于电子密度高的中等大小的颗粒( 直径l l o 1 8 5 n m ) ，而鼠妇的则主要定位在大颗粒中( 直径2 0 0 2 7 0 n m ) ”“。通过反相高效液相色谱分离出美洲龙虾窦腺中的性腺抑制因子，用虾( p a l a e m o n e t e sv a r i a n s ) 做体内活性检测，聚丙烯酰胺尿素凝胶电泳后，银染显示这个多肽抑制因子的分子量在7 - 8 k u 。它表现出专一的生物学活性，对泥污鲸螯虾( o r c o n e c t e s l i m o s u s ) 没有高血糖活性，而且也不与螯虾( a s t a c u s ) 的抗高血糖素血清发生免疫反应”“。l a v e r d u r e 等o ”用分子杂交技术，定位了美洲龙虾眼柄中性腺抑制激素的分泌细胞，q 河北大学理学硕士学位论文并指出其m r n a 大小为2 5 k b 。e s o m i 等嘲通过e d n a 克隆、表达、重组蛋白产物和免疫定位的方法研究挪威龙虾( n e p h r o p sn o r v e g i c u s ) 的性腺抑制激素，发现其c d n a 开放阅读框架为3 3 9 b p 编码一个1 1 2 个氨基酸的多肽，与美洲龙虾的性腺抑制激素有9 6 的相似性，其前体由一个3 3 个氨基酸的信号肽，和一个8 1 个氨基酸的成熟肽组成。通过反相高效液相色谱，分离出墨西哥小龙虾的性腺抑制激素，其含量是5 4 n g 窦腺。其生物活性鉴定，是通过将分离的样品与异源生物南美白对虾的卵巢体外一起培养，确定对卵黄蛋白生物合成的抑制作用来进行的。质谱分析确定其分予量为8 3 8 8 k u ，其末端是通过丹磺酰氯的方法封闭的，由7 2 7 4 个氨基酸组成，没有色氨酸、组氨酸和蛋氨酸。在卵巢和肝胰腺组织中都有卵黄蛋白抗体免疫活性，眼柄提取物对两种组织中的蛋白合成都有抑制作用，眼柄中的这种抑制因子是热稳定性的，其分子量为3 3 k u 。其提取方法为：用研钵在蒸馏水中研碎眼柄组织，提取物煮沸5 m i n ，之后1 0 0 0 0 9 、4 c 离心3 0 m i n ，上清液冷冻保存。此即为粗提物，以备色谱进一步纯化。眼柄提取物能够抑制卵巢和肝胰腺中与抗卵黄抗体有免疫反应的那些蛋白的合成。这一性质说明它也有性腺抑制的活性，如果事实果真如此，那么性腺抑制激素就能直接抑制卵黄的发生，而不是通过抑制源于性腺的性腺刺激因子来抑制卵黄的发生。目前尚不能肯定眼柄中的活性因子不是性腺抑制激素，而是其他具有抑制蛋白合成的因子”。等足类土鳖( a r m a d i l l i d i u mv u l g a r e ) 和轮鼠妇( a r m a d i l l oo f f i c i n a l i s ) 的卵黄发生抑制激素的n 末端是有区别的，2 9 个氨基酸中有8 个不同。这一发现证明卵黄发生抑制激素具有种间特异性。对比美洲龙虾和土鳖“的卵黄发生抑制激素，发现两种激素n末端都有一段7 个氨基酸( g - n r d l y - e ) 的序列，这一保守序列可能具有重要的生物活性。土鳖性腺抑制激素由8 3 个氨基酸残基组成的，分子量为9 4 8 5 k u 。土鳖的性腺抑制激素和高血糖素，是在神经分泌细胞不同的核周质中合成，并且储存在窦腺的不同神经轴突末端，而且一种肽可能参与不同的生理过程”。c h a v e s m l 对去除了眼柄的克氏原螯虾( p r o c a m b r u sc l a r k i i ) 注射窦腺等价物，发现日注射量为4 个安腺时，在第六天能够抑制因去除眼柄导致的雌虾卵巢增长的5 0 。放射示踪实验表明，注射后1 2 2 4 h 内性腺抑制活性达到最高峰，剂量研究表明，至少需两个窦腺等价物才能明显抑制因去除眼柄导致的卵巢的不断生长。国内还未见河蟹性腺抑制激素的其它相关的研究，应用先进的生物技术手段，开展1 0 第1 章绪论河蟹内分泌激素的系统研究，不仅可以弥补这一领域的空白，还可以直接与生产实践相结合，有效的解决生产中遇到的问题，还能为国内相关研究提供基础性资料，从而缩短同国外相关研究的差距。1 2 研究目的和意义中华绒螯蟹，俗称河蟹、毛蟹、大闸蟹。主要产于我国，由于两个螯肢上密生绒毛而得名，是我国一种重要的经济蟹类，在我国东部沿海，北起辽河口，南至闽江口，都有天然河蟹苗分布，长江口是河蟹最大的产卵场。河蟹隶属于节肢动物门( a r t h r o p o d ) 、甲壳纲( c r u s t a c e a ) 、十足目( d e c a p o d a ) 、方蟹科( g r a p s i d a e ) 、弓腿蟹亚科( v a r u n i n a e ) 、绒螯蟹属( e r i o c h e i t ) 。目前，北欧诸国、英国的泰晤士河、朝鲜沿海以及北美洲都有河蟹的分布。近年来，国内河蟹养殖业在沿海各地蓬勃兴起，它以优良的生物学品质、极高的营养价值和独特的风味蜚声海内外，是我国名优淡水养殖品种。国内有关河蟹形态学、组织学方面的研究较多，对其生殖生物学、遗传学等许多方面已有很多学者进行过比较系统的研究，为该品种的养殖生产提供了宝贵的基础资料，但有关内分泌方面的研究却是刚刚起步，尤其是与养殖效益密切相关的内分泌的研究，同国外相比差距较大。河蟹性早熟是养殖过程中普遍存在的问题，会给养殖业带来巨大的损失，性早熟的根本原因是幼蟹体内神经激素的分泌代谢失调，尤其是与性腺抑制激素的分泌和代谢失调密切相关。为了根本解决河蟹性早熟问题，河蟹生殖内分泌激素，尤其是性腺抑制激素基本性质的研究就成为关键环节之一。河蟹性腺抑制激素的研究具有重要的理论和实践意义，结合生物化学方法分离纯化河蟹的性腺抑制激素，并对其部分生化特性进行初步的研究，能为甲壳动物内分泌系统调控关系与功能研究提供基础实验数据：并为早日解决河蟹养殖过程中的性早熟问题提供基础资料。河北大学理学硕士学位论文第2 章中华绒螯蟹性腺抑制激素的分离2 1 引言位于眼柄的x 一器官( x - o r g a n ，x o ) 一窦腺( s i n u s # a n d ，s g ) 复合体是甲壳动物重要的神经内分泌调节系统之一，是重要的生理活动调控中心。高血糖素家族中的激素，因为具有相似的结构：氨基酸序列同源，通常都是7 2 7 8 个氨基酸残基的长度，且成熟肽中都具有六个保守的半胱氨酸残基形成三个二硫键，所以高血糖素、蜕皮抑制激素和性腺抑制激素同属于甲壳动物高血糖素家族，这些神经激素在甲壳动物正常的生理活动中起着重要的作用，它们都是在眼柄x - 器官的神经分泌细胞中合成，经神经分泌细胞轴突运送到窦腺储存，并释放进入血液。根据甲壳动物性腺抑制激素具有酸性等电点和热稳定性，以及分子量较小等性质“3 “1 ，将它初步分离出来，为深入研究性腺抑制激素的生理生化性质，以及它的作用机制打下基础。2 2 材料与方法2 2 1 材料未性成熟的河蟹于2 0 0 4 年6 月购自自洋淀，体重2 0 - 3 0 9 。于水族箱( 1 0 0 c m 4 0 e m5 0 c m ) 中暂养，水位1 0 c m 左右，缸底铺细沙，间歇充氧，循环水，饲喂混合食物( 小鱼、土豆、水草等) 。2 2 2 仪器d y c z 一2 4 d 型垂直板电泳槽( 北京市六一仪器厂)d y y 一1 6 b 型恒流稳压电泳仪( 北京市六一仪器厂)d y c z 一2 4 e 型垂直板电泳槽( 北京市六一仪器厂)d y y 6 c 型恒流稳压电泳仪( 北京市六一仪器厂)y 9 2 一i i 超声波细胞粉碎机( 宁波新芝科器研究所)t g l 1 6 g a 高速冷冻离心机( 上海市安亭科学仪器厂)a k t ae x p l o r e r l 0 0 型蛋白液相色谱仪( a m e r s h a mp h a r m a c i a 公司)第2 章中华绒螯蟹性腺抑制激素的分离反相柱r e s o u r e c ”r p c3ml(amershamp h a r m a c i a 公司)b c d 一2 7 1 b h e 型冰箱( 广东科龙电器集团)x t l i 型连续变倍体视显微镜( 北京电子光学设备厂)2 2 3 方法2 2 3 1 中华绒螯蟹性腺抑制激素的粗提液将未性成熟河蟹的眼柄从基部剪断( 不区分性别) ，在预冷的t r i s h c l 缓冲液( 0 0 1 m o l l ，p h7 4 ，含o 7 的n a c i ) 中解剖出视神经节，去除结缔组织后置于1 5 m l的离心管中，收集5 0 1 0 0 只眼柄视神经节后，冰浴超声波破碎( 1 9 0 w ，5 s x l 5 次，间隔5 曲，之后4 、1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ，取上清液在8 5 。c 下水浴5 m i n ，之后再次4 、1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ，取上清液7 5 c 冻存以备进一步分离纯化。取粗提的样品进行天然和变性的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为5 ，p 4 6 8 ；分离胶浓度为8 ，p h 8 8 ，电极缓冲液为t r i s - g l y ( 2 5 m m o l l ，p h 8 3 ) 。进行稳压电泳，起始电压为8 0 v ，待指示剂进入分离胶后将电压调为1 5 0 v ，49 c 电泳2 h 左右。电泳结束后用考马斯亮蓝1 1 2 5 0 染色5 m i n ，于1 0 甲醇和1 0 乙酸中脱色，过夜。t r i c i n e 电泳( t r i c i n es d s p a g e ) 采用1 6 5 、6 c 的分离胶。p h 8 4 5 ：和5 、3 c的浓缩胶，p h 8 8 ：阳极缓冲液为0 2 m o l lt r i s ，p h 8 9 ；阴极缓冲液为0 1 m o l lt r i s 和o 1 m o l l t r i c i n e ，p h 8 2 5 。起始电压为5 0 v ，3 0 m i n 后待指示剂完全进入分离胶后将电压调至1 5 0v ，电泳1 5 h 左右。电泳结束后用5 0 乙醇、8 乙酸固定1 h ，之后考马斯亮蓝r 2 5 0 染色2 m i n ( 1 0 9 l 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，2 5 乙醇、1 0 乙酸) ，之后2 5 乙醇、8 乙酸中脱色至背景无色。加样的同时加入标准分子量蛋白m a r k e r ：鸡蛋清溶菌酶( 1 4 4 k u ) 。电泳后的凝胶，在考马斯亮蓝r 2 5 0 染色后，都进行银染染色，即对凝胶进行复合银染。参照钟叔平、柳荣等m “1 的方法，并略有改进，对考染后凝胶脱色至背景无色后进行复合银染。主要步骤如下：( 1 ) 将用考马斯亮蓝r 2 5 0 染色并脱去底色的凝胶置于5 0 乙醇、1 0 乙酸溶液中轻摇l h 以上，其间换液2 3 次；( 2 ) 于1 0 ( v v ) 戊二醛溶液中固定3 0 r a i n ：( 3 ) 用大量蒸馏水充分漂洗凝胶3 0 r a i n ，其间至少换液3 次；( 4 ) 将凝胶移入干净的培养皿内，在轻轻振摇条件下用氨银染液染