（植物学专业论文）水稻重大害虫二化螟线粒体基因组学研究.pdf

合肥工业大学 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业大 学硕士学位论文质量要求。 答辩委员会签名：( 工作单位、职称) 挑叩缸，蠊铳以雪，索钯 擞 急、1 簧 p n 2 冲圊科投媸暑权按 一多事弋 吁膨一无_ 即j| 导师：魏兆军教授 ， ，_ 、1 、 一 j ， 多 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得 佥日巴王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签字：汪爱民签字日期：伽1 年心月彤e t i 陵函 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金肥互些太堂 有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人 授权金胆王些太堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：i 五l 汤玩 导师签名： 别乒 签字日期： v m l 年醇月w 日 签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 3 ， 、 j ， 水稻重大害虫二化螟线粒体比较基因组学研究 摘要 二化螟( c h i l os u p p r e s s a l i s ) 是水稻危害最大的几种害虫之一，属于螟蛾科 昆虫的一种，又称钻心虫。本文首次报道二化螟的线粒体全基因组序列，比较 二化螟线粒体基因组序列与其它鳞翅目昆虫的差异，为进一步研究鳞翅目类昆 虫分子系统演化建立了基础。 为了测定二化螟线粒体基因组序列，设计了l o 对适合于二化螟线粒体扩增 的引物，采用l a p c r 方法扩增了二化螟线粒体基因组不同片断，克隆后或利用 p c r 产物测序，把不同片断拼接后获得二化螟的线粒体全基因组序列。 二化螟线粒体基因组全长1 5 4 6 5 b p ，包含了3 7 个基因和1 个非编码的a t 富含 区。3 7 个基因包括1 3 个蛋白编码基因、2 2 个t r n a 基因、2 个r r n a 基因。二化螟 线粒体基因碱基组成具有明显的a + t 的偏向性，a + t 含量为7 9 7 0 ，结果表明 线粒体基因组具有很强的从g c 向a t 的进化选择性。二化螟的1 3 个p c g s 中c o x l 的起始密码为c g a ，其他1 2 个基因的起始密码为a t n 。除t r n s l 似g m 外，二化 螟线粒体基因组其余2 1 个t r n a 编码基因的二级结构为典型的三叶草型。二化螟 的a t 富含区被确定位于，刀泖印行肘之间，长度为3 2 9b p 。 已经测定的2 2 种鳞翅目昆虫线粒体基因组a t 含量的平均值为8 0 4 6 ： 2 2 种鳞翅目昆虫线粒体基因组a t 富含区的平均长度为4 2 6 b p ，草原毛虫的a t 区最 短3 1 9 b p ，野蚕的a t 富含区最长，达至u 7 4 7 b p 。2 2 种鳞翅目昆虫线粒体基因组a t 富含区中，桑尺蠖的a + t 含量最高9 8 2 5 ，黑纹粉蝶的a + t 含量最低8 9 1 7 。 基于2 2 种鳞翅目的13 个蛋白质编码基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序 列的m l 和b i 的4 种系统进化树结构类似，夜蛾总科n o c t u o i d e a 、螟蛾总科 p y r a l i d a e 和风蝶总科p a p i l i o n o i d e a 关系较近。二化螟属于螟蛾总科，与小蔗螟、 亚洲玉米螟、欧洲玉米螟亲缘关系较近。基于单个基于构建的系统树与基于全 部1 3 个蛋白基因的系统树结构明显不同。 关键词：线粒体基因组；二化螟：比较基因组学：系统发育 4 ， 3 - m o l e c u l a rc h a r a c t e r so ft h ec o m p l e t em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo f t h ed i s a s t e rr i c ep e s t ，c h i t os u p p r e s s a l i s ( l e p i d o p t e r a ： p y r a l i d a e ) a bs t r a c t t h es t r i p e dr i c eb o r e rc h i l os u p p r e s s a l i s ，o n ek i n do fp y r a l i d a ei n s e c t ，i sah a r m f u l f l e ep e s t i nt h ep r e s e n tr e a e a r c h , t h em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fc h os u p p r e s s a l i si s s e q u e n c e df i r s t l y , a n dc o m p a r e dw i t l lo t h e rs e q u e n c e dm i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fo t h e r21 l e p i d o p t e r a ni n s e c t s a n dt h e n , t h ep h y l o g e n e f i cr e l a t i o n s h i p so fl e p i d o p t e r a ni n s e c t sw e r e r e c o n s t r u c t e d 、 ，i mt h ec o n c a t e n a t e ds e q u e n c e so ft h e13p c g so ft h em i t o c h o n d r i a l g e n o m e t os e q u e n c et h em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fc h i l os u p p r e s s a l i s ，10p a i r so fp r i m e r sw e r e d e s i g n e da n du s e df o ra m p l i f i c a t i o no fm i t o c h o n d r i a lg e n o m eu s i n gl a p c rm e t h o d a f t e r a m p l i f i c a t i o n , 10f r a g m e n t sw e r eo b t a i n e d ，w h i c hc o v e r e dt h ef u l lm i t o e h o n d r i a lg e n o m eo f c h i l 0s u p p r e s s a l i s a f t e rs e q u e n c i n g ，t h ef u l ls e q u e n c eo ft h em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo f c h os u p p r e s s a l i sw a so b t a i n e d t h ef u l ll e n g t ho fm i t c o h o n d i r a lg e n o m e so fc h i l os u p p r e s s a l i si s15 4 6 5 b p ，c o n t a i n i n g 3 7g e n e sa n da n o n - c o d i n ga t - r i c hr e g i o n t h e s e3 7g e n e si n c l u d e13p r o t e i nc o d i n gg e n e s ， 2 2t r n a g e n e sa n d2r r n ag e n e s t h e 黼b i a si so b v i o u s l yo b s e r v e di nm i t o c h o n d r i a l g e n o m eo fc h i l os u p p r e s s a l i s ，舔t h ea + tc o m p o s i t i o ni s7 9 7 0 t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t h eg c a te v o l u t i o n a r yp r e s s u r ei sr e a l l ys t r o n g t h es t a r tc o d o no ft h ec o x f o u n di n13 p c g so fc h i l 0s u p p r e s s a l i si sc g a ，a si sa t ni n1 2o t h e rg e n e s e x c e p to ft r n s l ( a g n ) t h eo t h e r21t r n ag e n e so fc h os u p p r e s s a l i sm i t o c h o n d r i a lg e n o m e sh a v eat y p i c a l c l o v e r l e a fs t r u c t u r e t h e ( a + d r i c h e dr e g i o nl o c a t eb e t w e e nr r n sa n dt r n m , 谢mt h e l e n g t ho f3 2 9b p t h ea v e r a g ea tc o n t e n to f2 2m i t o c h o n d f i a lg e n o m eo fl e p i d o p t e r a ni s8 0 4 6 t h e a v e r a g el e n g t ho fa t - r i c hr e g i o nf r o m 2 2m i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fl e p i d o p t e r a ni s4 2 6 b p ， w i t h i nt h er a n g ef o r m319 b p ( o c h r o g a s t el u n i f e r ) t o7 4 7 b p ( b o m b y xm a n d a r i n a ) a m o n g 5 、 l t h ea t - r i c hr e g i o no f2 2s p e c i e so fm i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fl e p i d o p t e r a n , p h t h o n a n d r i a a t r i l i n e a t ai st h eh i g h e s t ，w h i c hr e a c hu pt o9 8 2 5 ，a r t o g e i am e l e t ei st h el o w e s t ，w h i c hi s 8 9 1 7 b a s e do nt h ec o n c a t e n a t e dn u c l e o t i d es e q u e n c ea n d c o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i d s e q u e n c eo f13p r o t e i nc o d i n gg e n e sf r o m2 2l e p i d o p t e r as p e c i e s ，f o u rp h y l o g e n e t i ct r e e ， w e r ea b t a i n e du s i n gm la n db im e t h o d s ，w h i c hs h o w e ds i m i l a rs t r u c t u r e t h er e l a t i o n s h i p o fn o c t u o i d e a , p y r a l i d a ea n dp a p i l i o n o i d e aa r ec l o s e r c h i l os u p p r e s s a l i sb e l o n gt o p y r a l i d a e ，a n dh a v ec l o s e rr e l a t i o n s h i pw i t hd i a t r a e as a c c h a r a l i s ，o s t r i n i af u r n c a l i sa n d o s t r i n i an u b i l a l i s t h ep h y l o g e n e t i et r e eb a s e do nas i n g l eg e n ei ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t f r o mt h o s eb a s e do nc o n c a t e n a t e d13g e n e s k e y w o r d s ：m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ；c h i l os u p p r e s s a l i s ；c o m p a r a t i v eg e n o m i c s ； p h y l o g e n e t i c s 6 ? 爹 ? 致谢 在此论文完成之际，我向所有关心、支持和帮助我的老师、同学和亲友表 示衷心地感谢! 首先要感谢导师魏兆军教授的精心指导和关怀。三年来，老师渊博的学识、 严谨的治学态度、朴实的生活作风和极大的工作热情，给我留下了深刻的印象， 作为学生的我在各方面受益匪浅，在学业上逐步建立了良好的知识框架并掌握 了一定的独立科研能力，在生活中培养了健康的生活习惯与人生理念。在此， 向老师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢! 此外，在三年的学习和生活中，还得到了许多老师热情而无私的关怀与帮 助，在此，向他们致以衷心的感谢。该论文的顺利完成要特别感谢本实验室各 位同仁在各方面提供的无私帮助，特别是洪桂云和于淼的帮助。在实验室的每 一天都让我觉得自已身在一个温暖的大家庭，即使在繁忙的工作中也让我感觉 到快乐和充实。 我还要感谢我的家人和亲朋，感谢他们在这三年中给予我的关心、爱护、 理解和支持，是他们的无私与关爱，帮助我完成了学业。 本研究得到了教育部新世纪优秀人才基金项目、安徽省第四批优秀青年科 技基金项目的资助，在此一并表示感谢! 作者：汪爱民 2 0 11 年4 月1 5 日 7 崖 驴 、 l 目录 第一章绪论l 1 1 线粒体基因组研究概况1 1 1 1 线粒体与线粒体基因组的研究背景1 1 1 2 线粒体基因组特点l 1 1 3 昆虫线粒体基因组各组分的特征2 1 2 鳞翅目昆虫及其线粒体基因组研究概况5 1 2 1 鳞翅目昆虫及其经典系统树5 1 2 2 鳞翅目昆虫线粒体基因组研究概况8 1 3 二化螟及其危害9 1 4 课题研究背景、意义、主要内容和技术方案1 0 1 4 1 研究背景、内容和意义1 0 1 4 2 实验方案1 l 第二章二化螟线粒体全基因组结构分析1 2 2 1 实验材料与方法1 2 2 1 1 昆虫样品采集1 2 2 1 2 主要实验仪器1 2 2 1 3 实验试剂1 3 2 1 4 二化螟总基因组d n a 提取1 3 2 1 5 引物设计1 3 2 1 6 二化螟线粒体基因组片段的扩增1 4 2 1 7p c r 产物纯化1 5 2 1 8 连接1 6 2 1 9j 目 化1 6 2 1 10 序列测定1 6 2 1 1 l 序列拼接16 2 2 结果与分析1 6 2 2 1 二化螟基因结构和基因顺序1 6 2 2 。2 基因间间隔与重叠1 8 2 2 3 碱基组成情况18 2 2 4 二化螟编码蛋白质基因的分析1 9 2 2 5 二化螟t r n a 基因及结构预测2 0 2 2 6r r n a 基因注释及分析2 l 2 2 7a t 富含区。2 l 2 3结论2 2 第三章二化螟与其它鳞翅目昆虫线粒体基因组比较研究2 4 3 1 材料与方法2 4 3 1 1 材料 。2 4 3 1 2 鳞翅目昆虫线粒体基因组整体比较。2 5 3 1 3 鳞翅目昆虫线粒体蛋白质编码基因比较2 5 3 1 4 鳞翅目昆虫线粒体t r n a 、r r n a 以及a t 富含区的比较2 5 8 二 3 2 结果与分析2 5 3 2 1 鳞翅目昆虫线粒体基因组比较2 5 3 2 。2 鳞翅目昆虫线粒体蛋白质编码基因比较2 7 3 2 3 鳞翅目昆虫线粒体组r r n l 和r r n s 基因比较2 9 3 2 4 鳞翅目昆虫线粒体组t r n a 基因的比较3 0 3 2 5 鳞翅目昆虫线粒体组a t 富含区比较分析3 l 3 3l 砉论3 2 第四章基于线粒体基因组序列的鳞翅目昆虫系统发育关系的构建3 3 4 1 材料与方法。3 3 4 1 1 外群的选择3 3 4 1 2 参考数据序列来源3 4 4 1 3 序列比对。3 4 4 1 4 m l 法构建系统发生树3 4 4 1 5 b i 法构建系统发生树3 4 4 2 结果与分析3 5 4 2 1 鳞翅目昆虫线粒体蛋白编码基因序列的加工3 5 4 2 2 基于线粒体蛋白质基因氨基酸序列的系统发生分析3 5 4 2 3 基于线粒体蛋白质基因核甘酸序列的系统发生分析3 8 4 2 4 基于单个基因氨基酸序列的系统发育分析。4 0 4 3 讨论4 3 结论与展望4 5 参考文献4 7 攻读硕士学位期间发表的论文5 4 9 广 - 插图目录 图1 1 线粒体t r n a 的三叶草型结构3 图1 2 经典鳞翅目昆虫系统发育树6 图1 3 主要实验流程1 1 图2 1 二化螟线粒体基因组的组成结构图1 8 图2 22 2 种鳞翅目昆虫c o x l 基因的起始密码子和终止密码子比较1 9 图2 3 二化螟t r n a 的二级结构2 l 图2 4 二化螟线粒体a t 富含区结构2 2 图4 1 基于全部蛋白质基因氨基酸序列b i 系统树3 6 图4 2 基于全部蛋白质基因氨基酸序列m l 系统树3 7 图4 3 基于全部蛋白质基因核甘酸序列的b i 系统树3 9 图4 4 基于全部蛋白质基因核甘酸序列m l 系统树4 0 图4 5 基于单个蛋白编码基因的氨基酸序列的b i 系统进化树。4 3 图4 6 经典鳞翅目昆虫系统发育树。4 4 1 0 i i - f ， 插表目录 表2 1 扩增二化螟线粒体基因组所用引物1 4 表2 2l a p c r 反应体系( 单位：“l ) 1 5 表2 3p c r 反应体系及浓度( 单位：“l ) 1 5 表2 4 二化螟线粒体基因组1 7 表2 5 二化螟线粒体碱基组成1 9 表2 6 二化螟线粒体基因组1 3 个蛋白质编码基因密码子的碱基组成( 单位： ) 2 0 表3 1 鳞翅目昆虫线粒体基因组全序列2 4 表3 2 鳞翅目昆虫线粒体基因组碱基组成2 6 表3 3 鳞翅目昆虫线粒体l3 个蛋白编码基因碱基组成2 7 表3 - 4 鳞翅目昆虫线粒体1 3 个蛋白编码基因密码子的碱基组成2 8 表3 5 鳞翅目昆虫线粒体基因组的r r n a 的碱基组成2 9 表3 6 鳞翅目昆虫线粒体基因组的t r n a 的碱基组成3 0 表3 7 鳞翅目昆虫线粒体基因组a t 富含区的碱基组成。3 l 第一章绪论 1 1 线粒体基因组研究概况 1 1 1 线粒体与线粒体基因组的研究背景 线粒体( m i t o c h o n d r i o n ) 自发现和命名以来，人们从生物化学、分子生物学、 分子生物能学、分子遗传学等各个角度对线粒体进行了广泛的研究i 卜2 1 。是真核 生物细胞内的重要细胞器，在真核生物细胞内，是新陈代谢和生物能量转换的 中心，是细胞内氧化磷酸化和形成a t p 的主要场所，有细胞”动力工厂”( p o w e r p l a n t ) 之称。主要在细胞中进行氧化磷酸化和脂肪酸以及某些蛋白质的生物合 成，并参与细胞的代谢、发育和衰老过程1 3 - 7 】。线粒体有自身的d n a 和遗传体 系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器， 线粒体基因组中的基因与线粒体的氧化磷酸化作用密切相关，关系到细胞内的 能量供应。近年来发现线粒体基因组的改变与多种人类疾病以及衰老有密切的 关联 4 , 8 - 1 1 , 】。 1 1 2 线粒体基因组特点 ( 1 ) 昆虫线粒体基因组的大小 线粒体是一种半自主性的细胞器，线粒体基因组是在细胞质中存在的，是 除核基因之外的d n a 遗传信息。主要能编码线粒体自身所需的蛋白质、t r n a 及r r n a 。线粒体d n a 具有进化快、结构简单、单拷贝、含量丰富等特点。 昆虫线粒体d n a 是一个共价闭合的环状双链螺旋d n a ，但目前也发现有少 数线状线粒体基因组的存在【4 , 1 2 】。有趣的是，昆虫线粒体d n a 的转录有一个显 著的特点，其中大多数基因都是从其中一条链上转录的，这个问题值得我们再 深入研究。 线粒体基因组的大小变化极大，在不同物种间，线粒体基因组长度差异显 著，就是在同一物种的不同个体间以及同一个体内，线粒体基因组的长度变化 都很大。已知的是哺乳动物的线粒体基因组最小，果蝇和蛙的稍大，酵母的更 大，而植物的线粒体基因组最大。昆虫的线粒体d n a 的大小一般在1 4k b 一1 8k b ， 而酵母的m t d n a 贝, t j 比较特别，长度是昆虫线粒体的5 倍，例如酿酒酵母的线粒 体基因组约长8 4k b ，植物m t d n a 的长度又是酵母的5 倍。此外，不同的生物种 类的线粒体基因组在结构及编码能力方面也存在较大的变化 4 , 1 3 , 1 4 】。 ( 2 ) 昆虫线粒体基因组的结构 昆虫线粒体基因组结构较稳定，大多数昆虫的m t d n a 包含1 3 个蛋白质编码 基因( p r o t e i nc o d i n gg e n e ，p c g s ) ，1 6 s 和1 2 s 的2 个核糖体基因( r i b o s o m a lr n a g e n e ，r r n a 基因，) ，2 2 个转移r n a s 基因( t r a n s f e rr n ag e n e ，t r n a s ) ，及1 个无 结构基因区域，包含复制起点的控制区( c o n t r o lr e g i o n ) ( 称为a + t r i c h 区) ，共 由3 7 个基因和1 个a t 富含区组成。其中1 3 个蛋白质编码基因包括7 个n a d p 还原 酶复合体的亚单位基因( n a d l ，n a d 2 ，n a d 3 ，n a d 4 ，n a d 5 ，n a d 6 及n a d 4 l ) ，3 个细胞色素 氧化酶亚基基因( c o x l ，c o x 2 和c o x 3 ) ，2 个a t p 酶亚基基因( 口舻8 ，a t p 6 ) ，1 个细胞 色素b 基因( c y t b ) ，2 个r r n a 基因分别为r r n l 和r r n s ，以及2 2 个t r n a 基因，包括 t r n m 、| r n i 、g n q 、t r n w 、t r n c 、t r n y 、，n l 2 ( u u r ) 、| r n k 、t r n d 、t r n g 、t r n a 、 t r n r 、t r n n 、t r n s l ( a g n ) 、t r n e 、l r n f 、l r n h 、t r n t 、t r n p 、t r n s 2 ( u c n ) 、t r n l l ( c u n ) 、 f ，力矿1 5 51 6 1 。 序列分析发现，昆虫线粒体的结构有四个显著特点： 基因排列非常紧凑，基因间的序列很少或没有，有的邻近基因互相重叠。 编码效率高，结构基因内无内含子。 t r n a s 基因分散在1 3 个编码蛋白基因和2 个r r n a s 之间。 很多线粒体蛋白质编码基因含有不完整的t 或t a 终止密码子，通过转录 后的加工，补全终止密码子。 大多数调节序列都位于a t 富含区。 ( 3 ) 线粒体基因组的碱基组成 线粒体基因组的a t 碱基含量明显比g c 含量高很多，有显著的不均一性。 碱基组成的g + c 含量从1 5 一5 0 之间变化。进化高等的动物类群的g + c 含量 相对较高，例如脊椎动物为3 7 5 0 ；进化地位低的无脊椎动物，例如昆虫， 其m t d n a 的a + t 含量很高，可高达8 0 ，而g + c 含量就很低【4 1 1 ，17 1 。 1 1 3 昆虫线粒体基因组各组分的特征 ( 1 ) 蛋白质编码基因 昆虫m t d n a 的1 3 个编码蛋白基因中，n a d l ，n a d 4 、n a d 4 l 和n a d 5 这几个基 因是l 链编码，剩下的9 个编码蛋白基因由h 链编码。除掉n a d 4 l n a d 4 、a t p 6 a t p 8 、 a t p 6 c o x l 、n a d 5 n a d 6 这几个基因是紧密相连或相互重叠之外，其他编码蛋白 基因都是被t r n a 基因隔开。线粒体基因组中的启动子和终止子都是采用压缩的 方式进行连接，有的有多个碱基重叠，不同于核d n a 的编码方式，有研究认为 是r n a 自我剪接的结果。1 3 个蛋白编码基因的表达产物都是线粒体内膜呼吸链 的组分，其中最保守的为c y t b 、c o x l 、c o x 2 、c 0 x 3 ，而a t p 6 和a t p 8 基因进化速率 较快，变化差异比较大。 昆虫线粒体蛋白质编码基因的密码子有其自身特点。昆虫线粒体遗传密码 子与正常核基因遗传密码子是有不同的，线粒体基因的密码子在不同的生物类 群中也存在差异【4 , 1 引。 昆虫线粒体蛋白质编码基因中，a t n 是最常用的起始密码子，还存在一些 2 比较特殊的起始密码子，如a c g 、t t a 、t t g 、g t g 、t c g 等；还有一些四连 体起始密码子，如a t a a 、a t t a 、a t c a 。这些非正常的起始密码子会在转 录成m r n a 后，通过剪接加工校正过来，从而完成正常的翻译过程f 4 1 。 线粒体终止密码子：一种是完整的终止子，例如t a a 和t a g ，另一类是不 完整的终止密码子，如t a 和t ，不完整的密码子在各物种中各有不同，可以通 过转录为m r n a 后的加工，将不完整的终止密码子加工为完整的t a a 4 , 1 9 l 。 ( 2 ) t r n a 基i 网( t r n ag e n e s ) 线粒体中只存在2 2 种t r n a ，理论上来说需要3 2 种t r n a 来识别全部的氨基 酸密码子，但由于线粒体遗传密码子的特殊性，使2 2 种t r n a 就可以满足线粒体 蛋白质翻译中识别全部的氨基酸密码子的需要。线粒体的2 2 个t r n a 分子长度通 常在6 0 b p 一7 6 b p 左右，线粒体t r n a 的二级结构也是三叶草型，包括7 b p 的氨基酸 接受臂，4 b p 的双氢尿嘧啶臂，5 b p 的t w c 臂和5 b p 的反密码子臂，以及一个可变 环组成。4 个臂的碱基对都存在高比例的错配，一般来说氨基酸接受臂和反密码 子臂这2 个都较为保守，而d h u 环与t w c 环的变化较大，在昆虫线粒体基因组 t r n s l ( a g n ) 基因中存在d h u 臂缺失现象和t w c 臂缺失现象【4 ，2 0 ，2 1 1 ( 图1 1 ) ，左图 为缺少d h u 臂的m t d n a 的t r n a 一- 级结构，右图为m t d n a 的t r n a 典型的三叶草 型结构。此外，我们还发现一些物种的线粒体t r n a 基因在结构和排列顺序上存 在显著的变化1 4 ，l l ，2 1 1 。 g a a 拥肼甜g 叼u a a u u a u u a u c u u u a u g u uaau uac - a ua g u gaau u u u a u u u a a u g ：u a m i n o a c y l s t e m gc - u u u u aacu ua a u uug a u y 争y a u a uuaa a aac uug a u ua d h u a r m u u ：a a a 蛔 u gc 蒯湘蝴 图1 - 1 线粒体t r n a 的三叶草型结构 f i g 1 - 1s e c o n d a r yc l o v e r l e a f s t r u c t u r eo f m i t o c h o n d r i a lt r n a s 3 蓝 - - - - c u u a a a c u u ( 3 ) r r n a 基因( r r n ag e n e s ，核糖体r n a 基因) r r n a 有大小亚基组成，在蛋白合成中有重要的作用，其功能主要是把翻译 系统中各种组分聚集在一起，与t r n a 及m r n a 结合在一起，在翻译起始、延伸 和终止因子的参与下进行蛋白质的合成，形成正确的空间排布及高级结构，以 完成将遗传信息从m r n a 到多肽链的转变。昆虫线粒体基因组中有两个r r n a 基 因，分别是r r n l 基因和r r n s 基因，r r n l 基因和r r n s 基因进化速率很慢，相对m t d n a 其他基因来说它们是相当保守的 4 , 2 2 - 2 8 1 。 ( 4 ) 控制区 在昆虫m t d n a 中，有一段a + t 含量很高且长度可变的非编码区，约占全部 m t d n a 长度的6 左右。是调控m t d n a 复制及转录的起始区，在昆虫中，控制 区a + t 含量极高，称a + t 富含区，在脊椎动物中，控制区称为d 环( d 1 0 0 p ) ，是 不编码基因的。由于不编码基因，在进化中变异程度高，所以控制区是各物种 在线粒体基因组d n a 序列和大小上存在很大不同的主要原因，控制区的碱基突 变率比线粒体基因组其他区域高5 一l o 倍，是核基因组单拷贝基因的2 5 1 0 0 倍， 目前控制区以及被广泛应用于物种的起源进化，亲缘关系和群体结构的研究。 脊椎动物和无脊椎动物的线粒体d n a 中的富含区存在很大的差异。在无脊 椎动物中，a t 富含区的a + t 含量明显高于脊椎动物，而且无脊椎动物的a t 富含 区在m t d n a 中的位置基本都不一样 1 9 1 。例如昆虫线粒体基因进化中，t r n a 基 因会有一定几率发生基因重排，这样会导致线粒体所有基因的位置都会发生改 变。 通常在昆虫线粒体a t 富含区中，a + t 含量基本都在8 5 以上，在线粒体富 含区a t 含量最高的昆虫蜜蜂和果蝇中，a + t 含量高达9 6 。在大多数的昆虫中， 在昆虫线粒体基因组中a + t 富含区最短的昆虫为r u s p o l i ad u b i a7 0b p 4 , 2 9 l ，a t 富含区最长的昆虫为黑腹果蝇d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r4 6 0 1b p 4 , 3 0 】，两者相差 4 5 3 lb p 。此外在亲缘关系比较相近的物种中，a t 富含区长度也有相当大的变 化，主要原因是不同物种a t 富含区的串联重复序列的数目不同。a t 富含区的 这一系列特征对于昆虫系统进化方面的研究有重要意义。 目前，在无脊椎动物线粒体a t 富含区序列多集中在对昆虫线粒体a t 富含 区序列的研究上。z h a n g 等【4 ，3 i ，3 2 】分析了草地蝗虫( c h o r t h i p p u sp a r a l l e l u s ) 和 沙漠蝗虫( s c h o s t o c e r c ag r e g a i a ) 的a t 富含区序列，发现草地蝗虫和沙漠蝗虫 都有8 个短的保守区域，它们分布于整个a t 富含区，所以不能明显地区分保守 区和可变区。而发现果蝇和其它昆虫的a t 富含区的结构有明显的不同：果蝇的 a t 富含区5 有一段保守区，而其余部分是可变区。所以z h a n g 等【4 3 2 l 主张把昆虫 线粒体基因组的a t 富含区按结构区分为两大类群：第一类是像果蝇这样，有两 4 个不同结构区域，包含保守区与可变区；第二类是以蝗虫、蚊类及蝶类等昆虫 为代表，保守区分散在a t 富含区内，所以无法区分出明显的保守区和可变区。 同时，z h a n g 等【3 2 1 还提出了可能是由不等交换引起的非同源重组是导致a t 富含 区发生串联重复序列的可能原因。线粒体的a t 富含区经常被用于种群遗传学和 分子进化等方面的研究【4 , 3 3 - 3 6 ，正是因为其具有这些结构和进化的特征。 1 2 鳞翅目昆虫及其线粒体基因组研究概况 1 2 1 鳞翅目昆虫及其经典系统树 昆虫纲( i s e c t a ) ，以前也称为“六足虫纲”，是整个动物界中最大的一个类 群。昆虫纲不仅在节肢动物门中种类和数量最多的一个纲，在整个动物界中种 类和数量也是最多的一个纲。世界昆虫约有1 0 0 万种，也有人估计为2 0 0 万种， 另外每年还约陆续发现5 0 0 0 - - 一1 0 0 0 0 个新种。在我国大约有1 2 - - 一1 5 万种昆虫。 昆虫种类繁多，约占动物界种数的8 0 ，习性差异很大，分布范围很广，全世 界除了水域凡是有植物生长的地域都会有昆虫，是最昌盛的动物类群【3 7 1 。 鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 昆虫纲中第二大目，又称为蝶蛾类，完全变态，幼 虫一般称为毛虫。蛹为被蛹。成虫称蛾或蝶，鳞翅目昆虫所独有的特征，在其 翅和体上密被鳞片，故得名鳞翅目昆虫。全世界种类达二十万种，其中蝶类约 1 80 0 0 种，不足l o ，鳞翅目是昆虫纲四大目之一，其种类仅次于鞘翅目，大 多数种类与国民经济有重大关系。这其中大部分为农林植物的重要害虫，如螟 虫、粘虫、松毛虫和菜粉蝶等；但也有一些是很好的资源性昆虫，如家蚕、柞 蚕和蓖麻蚕等。 鳞翅目下的分类阶元不同的分类系统有所差别，h e p p n e r 将鳞翅目蛾类划分 为5 9 个科。k r i s t e n s e n ( 1 9 9 9 ) 将鳞翅目分为4 7 总科、1 2 6 科及2 5 0 亚科【3 引，经典 的鳞翅目系统树如图1 2 所示。根据上颚发达与否，分成轭翅亚目( z e u g l o p t e r a ) 、 无喙亚目( a g l o s s a t a ) 异蛾亚目( h e t e r o b a t h m i i n a ) 和有喙亚目( g l o s s a t a ) ， 其中9 8 以上的鳞翅目昆虫都属于有喙亚目。因为蛾类和蝶类在形态上十分接 近，而在有喙亚目中，习惯上将触角形状为球杆状膨大，并且无翅缰的统称蝶 类，触角通常丝状或羽状，或者膨大而有翅缰的统称蛾类。 鳞翅目昆虫的详细分类包括以下1 5 个总科： ( 1 ) 谷蛾科( t i n e i d a e ) ，体型小，翅展一般在2 0h i m 以下。体色呈灰、 黄、褐色。头上有直立的毛和鳞。触角比前翅短，柄节常有栉毛。翅狭长，后 翅顶端尖，臀角处缘毛特长，长于翅宽。前后翅中室内均被m 脉基部分割。幼 虫腐食性，也有取食干的动物、植物和菌类的。常见的贮藏物害虫有谷蛾 n e m a p o g o ng r a n d 等。 ( 2 ) 菜蛾科( p l u t e l l i d a e ) ，体型小而狭长，色暗。触角在静止时伸向前方。 5 下唇须第2 节有三角形的毛丛。翅狭长，后翅菜刀形，m l 与m 2 共柄。幼虫小， 绿色，圆筒形。趾钩单序环，臀足较长而往后斜伸。幼虫为害叶表面或潜叶、 潜茎。主要害虫有小菜蛾p u l t e l l ax y l o s t e