（植物学专业论文）胞间连丝组分的研究—肌动蛋白和肌球蛋白的免疫金标记.pdf

s t u d i e so nt h ec o m p o s i t i o no f p l a s m o d e s m a t a - - l m m u n o - g o l dl a b e l i n go f a c t i na n d m y o s i n p o s t g r a d u a t e ：l i u n a s p e c i a l t y ：b o t a n y s u p e r v i s o r ：w a n go o n g m e ip r o f e s s o r a b s t r a e t p l a s m o d e s m a t a ( p d lm t h ei n t e r c e l l u l a ro r g a n e l l e st h a tc o n n e c t1 h ec y t o p l a s mo f a d j a c e m c e l l sa n dt h e r e b yu n i t eap l a n ti n t oai n t e r c o n n e c t e dc o m m u n i c a t i o no f n u t r i e n ta n di n f o r m a t i o ni n r e c e n ty e a r s ，t h es t u d i e so fp dh a v eb e e nf o c u s e do nt h et r a n s p o r t a t i o no fm a c r o m o l e c u l e s t h e c u r r e n ts t r u c t u r a lm o d e lo fp dt h a tt r a n s p o r tm a c r o m o l e c u l e sm o s t l yi m p l i c a t e dt h ee x i s t e n c eo f a e t i na n d m y o s i n a c c o r d i n g t ot h e s e , i ti su r g e n tf o ru st oi m p l i c a t ea c t i na n dm y o s i nt h a ta r et h e c o m p o s i t i o no fp d ，i nt h i ss t u d y ，w ev e r i f i e d t h ee x i s t e n c eo fa c t i na n dm y o s i nt h a ta r et h e c o m p o s i t i o no fp di nt h er o o tt o po fm a i z ea n do n i o nb yu s i n gi m m u n o g o l dl a b e l e da n dt h e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) i m m u n o g o l dc o l o c a l i z a t i o no fa c t i na n dm y o s i nw a s i n v e s t i g e t e d i nr o o tt o po fm a i z e w h i c ht ot e s tt h ec o m p o s i t i o no fp d t h ef u n c t i o no ft h e e c t o d e s m a t a - l i k ep dd u r i n g t h ed e t a c ho ft h er o o t t o p c e l lw a sd i s c u s s e d b yu s i n g i m m u n i h i s t o c h e m i c a la n da t p o s ec y t o c h e m i c a ll o c a l i z e dm e t h o d t h er e s u l t st h a ta e t i na n dm y o s i nl a b e l e dw i t hc o l l o i d a lg o l dp a r t i c l e s s u g g e s tt h a ta c t i na n d m y o s i nb o t he x i s ti np l a s m o d e s m a t ao f o n i o nc e l l sa n dm a i z er o o ta p e x e s ，n o to n l ya c t i nb u ta l s o m y o s i ni sl a b e l e di nt h es a m em a t e r i a l ，w h i c hp r o v i d e da ne v i d e n c et h a ta c t i na n dm y o s i nc o e x i s t a n de x i s tr e s p e c t i v e l yi np d t h ee o l o c a l i z a t i o no fa c t i na n dm ) ，o s i ni np dw a so b s e r v e df i r s t l y , t h er e s u l t sf u r t h e re v i d e n tt h et w op r o t e i n sc o e x i s ti nt h ep l a s m o d e s m a t aa n di m p r o v e dar e l i a b l e p r o o f f o rt h es y m p a s m a t i ct r a n s p o r t a t i o nt h a td e p e n do nt h ei n t e r a c t i o no f a c t i na n dm y o s i n f r o mt h eo b s e r v a t i o no fm a i z er o o tc a pc e l l s ，i tw a sf o u n dt h a tc y t o p l a s mp dc h a n g e d o b v i o u s l y t h ep l a s m o d e s m a t ao fs l o u g h i n gc e l l w a l lh a sb e c o m es t r e t c h e d w i t ht h e i n c r e a s eo fi n t e r s t i t i a l s p a c e , t h e # t r e t c h e dp dw e r g b r o k e ni n t o m a n ye c t o d e s m a t _ a l i k e t h a t e x i s t e di nt h eo u t e rc e l lw a l l 。o fd e t a c h e dc e l l sf o r mt h er o o tc a p i nt h i s i n v e s t i g a t i o n ，t h e n o r m a l s t r e t c h e da n de c t o d e s m a t a 1 i k eh a db e e no b s e r v e db y m m u n o h i s t o c h e m i c a l1 0 c a l i z a t i o n sd e m o n s t r a t e da c t i na n dm y o s i nl o c a l i z e di ns t r e t c h e dp da n de c t o d e s m a t a - l i - k e f r o mt h ei n v e s t i g a t i o no fu l t r a s t r u c t u m ll o c a l i z z t i o no fa t p a s ea c t i v i l y , i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea c t i v i t ye x i s t e di ns t r e t c h e da n de c f o d e s m a t a - l i k e o fd e t a c h e dc e l l s t h er e s u l ts u p p a r t st h ea b i l i t yo fs y m p l a s m a t i ct r a n s p o r t a t i o na r ec a r r i e do u ti nt h e s e s t r e t c h e dp da n de c t o d e s m a t a - l i k ea sw e l l k e y w n r d s ：p a s m o d e s m a t a ；a c t i n ；m y o s i n ； o n i o n ；m a i z e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中刁i 包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得通j b 壅些盍堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一嗣工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确钓说观并表示了滋意。 学位论文作者签名：嘉! 朝奸 签字日期： 弦q 年 ；月黟f 1 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解逦j e 壅些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阕。本人授权迢韭壑些太堂可以将论文能全部或部分魂容编八有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名：亩1 炙卯 导师签名 签字日期；叶年f 月3 ，日 善殇 签字日期：卫唧年舌月岁3 英文缩写 a e r a f s b s a c d d d g d g d f a c t i n p d p i p e s s e l t m v v 英文缩写表 a b b r e v i a t i o n s 英文名称 a p p r e s s e de n d o p l a s m i cr e t i c u l u m a c t i nf i l a m e n t s b o v i n es e r u ma l b u m i n c y t o c h a l a s i nd 2 d e o x y d g l u c o s e d i e t h y l e n eg l y c o ld i s t e a r a t e f i l a m e n t o u sa c t i n p l a s m o d e s m a t a p i p e r a z i n e n ，n - b i s - 2 - e t h a n e s u l f o n i ca c i d s i z ee x c l u s i o nl i m i t t o b a c c om o s a i cv i r u s v a c u o l e 化学试剂 试剂名称 p i p e s n m a d d s a d m p 一3 0 s p i p o n 8 1 2 u r a n y lm a g n e s i u m o s m i u m 代l r ox i d e f 锇酸) 戊二醛 b s a ：甲砷酸钠 兔抗肌动蛋白抗体 兔抗肌球蛋白抗体 鼠抗肌球蛋白抗体 胶体金标i 4 。b 抗鼠i g g 抗体 其它试剂均为国产分析纯 s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a 嗽牺蛳趴跗剐跗跗跗她 胞问连丝组分妁研究 一 l 引言 胞间连丝是植物体的种超细胞结构( s u p r a c e l l u l a rs t r u c t u r e ) ，它把一个个独立 的“细胞王国”转变成相互连接的共质体( s y m p l a s t ) ，为植物体的物质运输和信息传 递提供了一个直接的从细胞到细胞的细胞质通道l l 】，使植物细胞之问能够相互交流信 息来协调生命的长久发展，促进生理过程的完整。并且共同作用来增强对病原菌的防 御反应2 1 。 胞间连丝十分纤细，在光镜下难以观察到其细微结构，但在电镜下观察到的胞问 连丝并非是单纯的实心丝状物1 1 , 3 - 5 1 。一般认为，胞间连丝是一具有管状结构连接相邻 细胞的细胞器，周围衬有质膜，并且与两侧细胞的质膜相连，中央是压缩内质网 ( a p p r e s s e de r ) 或称连丝微管( d e s m o t u b u l e ) ，与两侧细胞的内质网相连。在压缩内质网 与质膜之间有细胞质通道，此通道在胞间连丝两端变窄，形成胞间连丝的颈区，6 】。 大量实验表明，胞间连丝的结构极其复杂，虽然目前对胞间连丝组分的性质及其在胞 间连丝上的精确排列还不十分清楚，但对胞间连丝的结构提出_ 许多模型，其中以 d i n g 提出的模型为胞间连丝的基本模式。d i n g 3 等人采用冰冻固定和冰冻置换的方 法，并以计算机分析为辅助手段，以烟草叶肉细胞为材料，提出了胞问连丝结构模型 ( 图1 1 ，认为胞问连丝是一个复杂的孔道，在其压缩内质网的外侧和质膜内侧有许多 蛋白质球状颗粒，直径约3 r i m ，颗粒之间有一种叫做辐( s p o k e ) 的丝状物连接， 从而将细胞质通道分割为8 1 0 个微孔道，物质可经过这些微孔道进行胞间转移。在 此模型中，压缩内质网由包埋于内质网膜内侧脂中的蛋白质颗粒所充斥，无空腔存在。 并假设辐的动态变化可以调节胞质通道的大小，因而对胞问连丝的分子扩散上限 ( s i z ee x c l u s i o nl i m i t 。s e l ) 大小有调节功能。 图1 艟闻连丝结构模型嘲 f i 9 1 n o d e io fs t r u c t u r eo fp i e s m o d e a m a t a 胞问连丝作为一种特殊的细胞器是植物体内胞间物质与信息交流的通道t 过去一 河北农业大学硕士学位论文 直认为胞间连丝是一种简单的静态结构，s e l 般为8 0 0 1 0 0 0 d a 7 , s 】，只允许二些小 分子物质如离子、代谢物和小的信息分子在胞间进行无选择的自由扩散。但随着胞间 连丝及其分子组成的不断研究发现，胞间连丝的结构极其复杂，在不同组织和不同生 长发育阶段发生一定变化，而且通透性可加以调节1 9 。“，在一些情况下，大分子物质 如病毒的核酸、蛋白质或植物内源核酸、蛋白质可以经胞间连丝进行胞间转移 1 2 - 1 6 i 。 这些大分子是如何通过胞间连丝运输的昵? 对此，l u c a s 1 7 】提出了内源蛋白k n l 等转录因子通过胞间连丝的模式，w a i g a n n 和z a m b r y s k i d s 根据病毒m p 的研究提出 了m p 经过胞间连丝的转移模式。在这两种模式中认为大分子通过胞间连丝转移有两 种可能：一种是大分予在分子伴侣的作用下使其构象发生变化，成为非折叠状态，从 而使其易通过胞间连丝；另一种可能是大分子与胞问连丝微通道末端的锚定蛋白结 合，使胞问连丝微通道上相关蛋白之间的交联作用松弛，微通道的s e l 增加，大分 子通过胞间连丝。d i n g l l 9 】综合前人研究结果也提出了蛋白质等大分子通过胞间连丝的 转移模式，提出大分子经胞间连丝的每一步都需要特异的蛋白与蛋白之间的相互作 用，从而调控着大分子的运输过程。 随着分离、纯化细胞壁组分的方法不断改进，以及显微注射技术的应用，加快了 胞间连丝相关蛋白的研究。研究表明，胞间连丝相* 蛋白包括肌动蛋白h ( a c t i 柚、肌 球蛋白( m y o s i n ) 2 0 - 2 1 1 、钙网蛋f i t 2 2 】( c a l r e t i c u l i n ) 、中心蛋白】( c e n t r i n ) 、微管蛋白 1 2 ：l t u b u l i n ) 、蛋白激酶等类似的蛋自质【2 4 。5 1 ，至于这些蛋白在胞阃连丝上的精确定位 以及在胞间物质运输中的作用尚待进一步研究。 d i n g 等 2 6 1 以烟草为材料，利用显微注射技术研究肌动蛋白纤缝- ( a e t i nf i l a m e n t s ， a f s ) 在胞间连丝运输中的作用。把不同分子量的荧光标记葡聚糖与细胞松弛素d ( c d ) 一同注入烟草叶肉细胞，3 - 5 r a i n 内分子量为2 0 k d 的葱聚糖由注射细胞向周围细胞转 移；但单独注射葡聚糖或与鬼笔环肽一同注射时，葡聚糖不发生转移。这些结果表明： a f s 参与了胞间连丝的运输调节。另外，b a s k i n 等“”利用b d m ( 2 , 3 - b u t a n e d i o n e 2 - m o n o x i m e ) 对植物材料进行预处理；超微结构上观察到胞间连丝的颈口比对照缩小。 已知b d m 在动物中的作用是手砗i 割飘动蛋告，踊磷蛋自，( a o t i n m y o s i n ) 的相对滑动， 使a c t i n m y o s i n a d p p i 的组成垅蜊她蚤簿寝状悫。咽忱撵测b d m 在植物细胞中有可 能起到同样重要的作用，从而便谥商螭渊鼢物处于紧张态构象不易滑动，导致 胞问连丝颈口缩小【3 0 1 。因此推测胞闽连丝之魇以允许大于它自身s e l 的大分子通过， 也许是由于a c t i n m y o s i n 相互作用支配着胞间连丝孔径扩张的结果。所以，很有可能 微丝限制着胞间连丝的孔径，一旦微丝被解聚或肌球蛋白沿着微丝的运动受抑制，最 过二者间的相互作用而推动大舫子巷卿施与细胞之间共质体转移的观点仍缺乏实 验依据。一旦彻底弄清胞间连丝相关蛋白在胞间连丝上的精确定位、特性及基因结构， 就能利用这些分子作为工具，来探索植物细胞阋曩组织间日存在的精确协调的相互关 2 胞问连丝组分的研究 系；同时也将会大大促进植物体内胞间物质运输、信息传递与病毒转移机理的研究。 胞间连丝作为植物细胞的一种细胞器，在植物的生长发育和衰老过程中，同其它 细胞器一样，其形态、结构和功能都发生着明显的变化。v e r m e r 和m cc u l l y 【2 8 】、g u i n e l 和m c c u l l y 2 9 1 在对玉米根冠及粘液鞘的形态观察中，曾注意到根冠外缘层细胞胞壁 上存留有胞间连丝的踪迹，但只简单的归结为胼胝质堵塞或残存的疤痕，而未予以深 究。张伟成等圳通过对根冠细胞脱落进程的系统观察发现，根冠外层细胞胞间连丝正 经历着明显的结构变动；外沿正脱落细胞与内侧存活细胞间的胞间连丝先是延伸，随 后随着胞间隙扩展而断裂，前者因之脱落而散布于根际粘液质层，此时存活细胞界丽 胞壁上存留的胞间连丝其断裂端与质外体空间相接而内侧则仍与质膜相连并保持其 围有状态，不同的是连丝通道孔径明显扩大；存活细胞分界壁的这种特征似可与表皮 细胞壁上的外连丝相比拟，或可称为类外连丝结构；并通过不透膜荧光染料对其传输 功能进行进一步检验的结果发现，萤黄可进入细胞并分散于整个细胞质中，表明壁上 存留的类外连丝是荧光染料进入细胞的唯一可能的共质通道。细胞内原生质经壁上通 道向外穿越，也显示根冠细胞壁上类似外连丝的孔道确实是开放的并与根际环境相沟 通。本课题组张迎迎 3 1 1 的研究工作表明，在蒜萌发进程中，由于近中央孔道的细胞逐 渐衰败使得存活细胞与衰败细胞的分界壁上出现大量类外连丝，并证明不透膜的荧光 物质可以由类外连丝进入存活细胞。另有其它实验表明，类外连丝大多仍具有活跃的 生理活性参与细胞内外物质的传输过程【3 2 。”i 。然而肌动蛋白和肌球蛋白是否在类外连 丝中存在，是否为胞间物质运输提供动力仍不清楚。近年来研究表明，根冠脱落细胞 属于细胞程序化死亡【3 4 l ，死亡过程中的胞内物质外运可能要借助胞间连丝完成。另外 根部对外界物理因子的感受、传导及物质的摄取与运输也可能通过类外连丝进行，因 此论证在根冠细胞的胞间连丝处存在肌动蛋白和肌球蛋白将为阐明类外连丝的选择 运输功能提供理论依据。 本研究分别以洋葱和玉米根尖为材料，在前人研究的基础上，以验证肌动蛋白和 肌球蛋白在胞间连丝中的存在开展以下研究工作：( 1 ) 观察洋葱根尖分生组织的细胞 超微结构，对分生组织区细胞胞间连丝作肌动蛋白和肌球蛋白免疫金单标记，同时对 玉米根冠细胞胞间连丝作肌动蛋簖口肌球蛋白免疫金单标记，为验证肌动蛋白和肌球 蛋白在胞间连丝中广泛存在提供证据：( 2 ) 对玉米根冠细胞中正常胞间连丝作免疫金 双标记，为关于肌动肌球蛋白在胞问连丝一e 通过二者间的相互作用而推动大分子进 行细胞与细胞之间共质体转移的观点提供可靠的实验依据；( 3 ) 观察玉米根冠细胞脱 落过程中细胞及胞间连丝的变化，对伸长胞间连丝和类外连丝作肌动蛋白和肌球蛋白 免疫金单标记，为进一步论证伸长胞间连丝和类外连丝仍具有共质传输能力及其可能 的分子调控机制提供可靠的实验佐证；( 4 ) 对根冠细胞脱落过程中a t p 酶分布状态 进行实验研究，为阐明胞间连丝参与大分子主动运输提供佐证。 河北农业大学硕士学位论文 2 1 材料 2 1 1 洋葱 2 材料与方法 洋葱似，f f z 删c e p al ) 在室温2 3 2 5 c ，光照1 5 0 0 0 l u x ，每天光照1 4 小时，土培1 0 天后，取其根尖制作电镜样品包埋块( 图版i ，a ) 。 21 2 玉米 玉米( z 棚州毋口l ) 籽粒经7 漂白粉液消毒0 5 小时，置潮湿培养皿中，于2 0 2 5 。c 的黑暗中发芽。3 天后取其根尖部分包埋( 图版i ，b ) 。 图版i 实验材料取材部位( 箭所示) a ：洋葱根尖取材部位； b ：玉米根尖取材部位 p l a t ei l h es a 呷i ；n gp a r to ft e s tr t e r ia i ( a r r o w ) t h 日8 岬i in gp a r t 。f 。n i 。n r o o tt i p b t h es a m p l i n gp a r to f 帕i 2 。tt j p 2 2 电镜切片制备 2 2 1 免疫电镜样品制备 切取玉米和洋葱根尖长约1 毫米， 2 5 戊二醛溶液( o0 5 mp h 7 0 p i p e s 缓冲液 配制) 固定3 h ，同时抽气直到组织块下沉为止。 ( 2 ) 洗涤 p i p e s 缓冲液( o 0 5 m o l lp h 7 0p i p e s ) 冲洗3 次，每次3 0 m i n a ( 3 ) 后固定 1 锇酸( o 0 5m o i l p h 7 0p i p e s 缓冲液配制) 后固定2 h 。 ( 4 1 洗涤 河北农业大学硕士学位论文 2 1 材料 2 1 1 洋葱 2 材料与方法 洋葱似，f f z 删c e p al ) 在室温2 3 2 5 c ，光照1 5 0 0 0 l u x ，每天光照1 4 小时，土培1 0 天后，取其根尖制作电镜样品包埋块( 图版i ，a ) 。 21 2 玉米 玉米( z 棚州毋口l ) 籽粒经7 漂白粉液消毒0 5 小时，置潮湿培养皿中，于2 0 2 5 。c 的黑暗中发芽。3 天后取其根尖部分包埋( 图版i ，b ) 。 图版i 实验材料取材部位( 箭所示) a ：洋葱根尖取材部位； b ：玉米根尖取材部位 p l a t ei l h es a 呷i ；n gp a r to ft e s tr t e r ia i ( a r r o w ) t h 日8 岬i in gp a r t 。f 。n i 。n r o o tt i p b t h es a m p l i n gp a r to f 帕i 2 。tt j p 2 2 电镜切片制备 2 2 1 免疫电镜样品制备 切取玉米和洋葱根尖长约1 毫米， 2 5 戊二醛溶液( o0 5 mp h 7 0 p i p e s 缓冲液 配制) 固定3 h ，同时抽气直到组织块下沉为止。 ( 2 ) 洗涤 p i p e s 缓冲液( o 0 5 m o l lp h 7 0p i p e s ) 冲洗3 次，每次3 0 m i n a ( 3 ) 后固定 1 锇酸( o 0 5m o i l p h 7 0p i p e s 缓冲液配制) 后固定2 h 。 ( 4 1 洗涤 胞间连丝组分的研究 2 3 图像的观察与处理 2 3 1 透射电子显微镜观察 在j e m 一1 0 0 c x 透射电子显微镜下观察制备的不同超薄切片，并照相，曝光时 间控制在5 秒钟之内。 23 2 图像的后处理与打印 图像后处理利用p h o t o s h o p 7 0 软件进行排版。 打印机型号为e p s o ns t y l u sp h o t o 7 5 0 。 河北农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 洋葱根尖分生组织纲胞和胞问连丝的超微结构观察及肌动肌球蛋白 的免疫金标记 3 1 1 分生组织细胞与胞间连丝的结构特点 在电镜下我们可以观察到洋葱根尖分生组织区细胞小而等径，细胞壁薄，液泡小 而分散，原生质浓厚，细胞器丰富，有大量的线粒体、质体：细胞排列紧密；细胞核 相对较大等特点( 图版i i 。a ) 。充分显示出细胞正处于旺盛的生理活动时期。另外， 在相邻细胞问的细胞壁卜可以观察到大量呈分散状的胞间连丝，存在于胞问连丝中的 连丝微管清晰可见。胞问连丝南径大约为5 0 6 0 n m ，属于正常胞问连丝范畴( 图版i i ， b ) 。 3 1 。2 肌动蛋白和肌球蛋白在朐问连丝上的免疫金定位 来自肌动蛋白的免疫金定位结果显示，在分生组织细胞质中可观察到大量金颗 粒，在较高的放大倍数f ，亦可观察到胞间连丝上有金颗粒存在( 图版i i ，c 、d ) 。 对肌球蛋白的免疫金定位结果也与之相似，即可在胞质中观察到大量金颗粒，胞间连 丝上被标记的金颗粒也清晰可见( 图版i i ，e 、f ) 。这一结果充分表明，在洋葱根尖 分生组织内有肌动蛋白和肌球蛋白存在，并且二者在相邻细胞间的胞间连丝上也有分 布。早些时候，w h i t e 等【4j 在满江红、大麦、烟草中证明胞间连丝中存在肌动蛋白； r a d f o r d l 2 0 】在玉米和洋葱根间中证明了在胞间连丝处存在肌球蛋白：b l a c k m a n 2 1 1 在珊 瑚轮藻中证明了胞问连丝中存在肌动蛋白和肌球蛋白。这些研究中对肌动蛋白和肌球 蛋白是否属于胞问连丝所用材料不同，并且在同一材料中，还没有证据表明在高等植 物的胞间连丝上同时有肌动蛋白和肌球蛋白存在。在对照实验中没有发现金颗粒。我 们的实验是利用弹葱根尖作为实验材料，证明了肌动蛋白和肌球蛋白存在于胞间连丝 中，这为论证肌动蛋白和肌球蛋白共同属于正常胞间连丝组分又提供了一个新的实验 依据。 河北农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 洋葱根尖分生组织纲胞和胞问连丝的超微结构观察及肌动肌球蛋白 的免疫金标记 3 1 1 分生组织细胞与胞间连丝的结构特点 在电镜下我们可以观察到洋葱根尖分生组织区细胞小而等径，细胞壁薄，液泡小 而分散，原生质浓厚，细胞器丰富，有大量的线粒体、质体：细胞排列紧密；细胞核 相对较大等特点( 图版i i 。a ) 。充分显示出细胞正处于旺盛的生理活动时期。另外， 在相邻细胞问的细胞壁卜可以观察到大量呈分散状的胞间连丝，存在于胞问连丝中的 连丝微管清晰可见。胞问连丝南径大约为5 0 6 0 n m ，属于正常胞问连丝范畴( 图版i i ， b ) 。 3 1 。2 肌动蛋白和肌球蛋白在朐问连丝上的免疫金定位 来自肌动蛋白的免疫金定位结果显示，在分生组织细胞质中可观察到大量金颗 粒，在较高的放大倍数f ，亦可观察到胞间连丝上有金颗粒存在( 图版i i ，c 、d ) 。 对肌球蛋白的免疫金定位结果也与之相似，即可在胞质中观察到大量金颗粒，胞间连 丝上被标记的金颗粒也清晰可见( 图版i i ，e 、f ) 。这一结果充分表明，在洋葱根尖 分生组织内有肌动蛋白和肌球蛋白存在，并且二者在相邻细胞间的胞间连丝上也有分 布。早些时候，w h i t e 等【4j 在满江红、大麦、烟草中证明胞间连丝中存在肌动蛋白； r a d f o r d l 2 0 】在玉米和洋葱根间中证明了在胞间连丝处存在肌球蛋白：b l a c k m a n 2 1 1 在珊 瑚轮藻中证明了胞问连丝中存在肌动蛋白和肌球蛋白。这些研究中对肌动蛋白和肌球 蛋白是否属于胞问连丝所用材料不同，并且在同一材料中，还没有证据表明在高等植 物的胞间连丝上同时有肌动蛋白和肌球蛋白存在。在对照实验中没有发现金颗粒。我 们的实验是利用弹葱根尖作为实验材料，证明了肌动蛋白和肌球蛋白存在于胞间连丝 中，这为论证肌动蛋白和肌球蛋白共同属于正常胞间连丝组分又提供了一个新的实验 依据。 胞问连丝组分的研究 一 图版i i 洋葱撮尖分生组织细胞超撇结构及胞间连丝蛋白免疫金标记 。 a ：洋葱根央分生组织细胞( x 6 0 0 0 ) ：b ：分生组织细胞胞问连丝( ) 8 0 0 0 。1 0 0 ) ； c d ：胞阃连丝中肌动蛋白的免疫金标记( c x4 0 0 0 0 ，o 2 5 0 0 0 ) ； ef ：胞间连丝中肌球蛋白的免疫金标记( e 2 0 0 0 0 。f 2 5 0 0 0 ) 注：b 中小照片为阁中方框部分的放大 p d ：胞问连丝；n ：细胞桉；n u ：核仁：v ：液泡 p l a t ei iu l t r a s l r u c t u r eo fo n o nr o o tm e r i s t e ma n dm u n o - g o l d l a b e l e dt h ep r o t e i ni ni t s p l a s m o d e s m a t a a ： m e r i s t e mc e l lo f r o o tt l p ； b ：p l a s m o d c s m a t ao f m e r i t e m ； c d ：a c t i ni nt h ep l a s m o d c s m a t al a b e l e d w i t hr e d i r e c tm m a t m o - g o l d ； e - f ：m y o s i ni nt h ep l a s m o d e s m a t a l a b e l e dw i t hi n d i r e c t ；i m m u n o - g o l d ， t h el i t t l ep h o t oi nb i st h em 鲫e du n a g co ft h ep a n ep m p d ：p l a s m o d e s m a t a ；n ：n u d c u s ； n u ：n u e l e o l e ；v ：v a c u o l e 3 2 玉米根冠细胞和胞问连丝的超微结构观察及肌动肌球蛋白的免疫 金标记 。 在根的生长发育过程中，根冠外部细胞不断脱落。在根冠处通常有三种类型的细 胞：正常缅施、正在脱落细胞和已脱落缅胞。有研究已经表明，在根冠细胞脱落过程 9 胞问连丝组分的研究 一 图版i i 洋葱撮尖分生组织细胞超撇结构及胞间连丝蛋白免疫金标记 。 a ：洋葱根央分生组织细胞( x 6 0 0 0 ) ：b ：分生组织细胞胞问连丝( ) 8 0 0 0 。1 0 0 ) ； c d ：胞阃连丝中肌动蛋白的免疫金标记( c x4 0 0 0 0 ，o 2 5 0 0 0 ) ； ef ：胞间连丝中肌球蛋白的免疫金标记( e 2 0 0 0 0 。f 2 5 0 0 0 ) 注：b 中小照片为阁中方框部分的放大 p d ：胞问连丝；n ：细胞桉；n u ：核仁：v ：液泡 p l a t ei iu l t r a s l r u c t u r eo fo n o nr o o tm e r i s t e ma n dm u n o - g o l d l a b e l e dt h ep r o t e i ni ni t s p l a s m o d e s m a t a a ： m e r i s t e mc e l lo f r o o tt l p ； b ：p l a s m o d c s m a t ao f m e r i t e m ； c d ：a c t i ni nt h ep l a s m o d c s m a t al a b e l e d w i t hr e d i r e c tm m a t m o - g o l d ； e - f ：m y o s i ni nt h ep l a s m o d e s m a t a l a b e l e dw i t hi n d i r e c t ；i m m u n o - g o l d ， t h el i t t l ep h o t oi nb i st h em 鲫e du n a g co ft h ep a n ep m p d ：p l a s m o d e s m a t a ；n ：n u d c u s ； n u ：n u e l e o l e ；v ：v a c u o l e 3 2 玉米根冠细胞和胞问连丝的超微结构观察及肌动肌球蛋白的免疫 金标记 。 在根的生长发育过程中，根冠外部细胞不断脱落。在根冠处通常有三种类型的细 胞：正常缅施、正在脱落细胞和已脱落缅胞。有研究已经表明，在根冠细胞脱落过程 9 河北农业大学硕士学位论文 中，根冠细胞间的胞闯连丝被拉伸、伸长，最终断裂。所以，在电镜下我们能够观察 到三种状态的胞间连丝：正常的胞间连丝、伸长的胞间连丝和类外连丝。本项研究以 玉米根冠为试材，这就为我们掭讨肌动肌球蛋白是否可以属于不同状态胞间连丝的 结构组分提供了一个很好的实验体系；同时并为进一步探讨在根冠细胞不断脱落过程 中，伸长的胞间连丝和类外连丝出现和存在的生物学意义奠定实验基础。 3 2 1 玉米根冠细胞的显徽和超微结构特点 在光学显微镜下，无论是玉米根冠部分的纵切图或横切图，均可看到许多不规则 的薄壁细胞形成了根冠主体。其中，外层细胞排列疏松，在外壁上分泌有大量粘液。 在根冠周围的粘液质中，链够观察到已经脱落下来的薄壁细胞教落在其中( 图版i i l ， a 、b ) 。 在电镜下观察发现，那些处于即将脱落的细胞，其胞质稠密，富含细胞器，有较 多的小液泡分散在细胞中( 图版i ，c ) 。而在刚刚脱落的细胞中，胞质依然保持稠 密，仍然可见许多小液泡存在，与即将脱落的细胞相比无多大差异( 图版，d ) 。 早期脱落的细胞，其胞质较稀薄，液泡较大，还能看到部分这样的细胞己发生质壁分 离( 图版i ，e ) 。上世纪八十年代，g u i n a l 等人i 2 9 1 在以玉米根为材料，研究根冠特 性时就发现，随着根的生长根冠细胞不断更迭与脱落，而脱落细胞仍可在根际粘液 席由在活客日汶与棱们在本实验中经电镜观察所得的结栗是基本一致的。 圈版i i i 玉米根冠细胞结椅 河北农业大学硕士学位论文 中，根冠细胞间的胞闯连丝被拉伸、伸长，最终断裂。所以，在电镜下我们能够观察 到三种状态的胞间连丝：正常的胞间连丝、伸长的胞间连丝和类外连丝。本项研究以 玉米根冠为试材，这就为我们掭讨肌动肌球蛋白是否可以属于不同状态胞间连丝的 结构组分提供了一个很好的实验体系；同时并为进一步探讨在根冠细胞不断脱落过程 中，伸长的胞间连丝和类外连丝出现和存在的生物学意义奠定实验基础。 3 2 1 玉米根冠细胞的显徽和超微结构特点 在光学显微镜下，无论是玉米根冠部分的纵切图或横切图，均可看到许多不规则 的薄壁细胞形成了根冠主体。其中，外层细胞排列疏松，在外壁上分泌有大量粘液。 在根冠周围的粘液质中，链够观察到已经脱落下来的薄壁细胞教落在其中( 图版i i l ， a 、b ) 。 在电镜下观察发现，那些处于即将脱落的细胞，其胞质稠密，富含细胞器，有较 多的小液泡分散在细胞中( 图版i ，c ) 。而在刚刚脱落的细胞中，胞质依然保持稠 密，仍然可见许多小液泡存在，与即将脱落的细胞相比无多大差异( 图版，d ) 。 早期脱落的细胞，其胞质较稀薄，液泡较大，还能看到部分这样的细胞己发生质壁分 离( 图版i ，e ) 。上世纪八十年代，g u i n a l 等人i 2 9 1 在以玉米根为材料，研究根冠特 性时就发现，随着根的生长根冠细胞不断更迭与脱落，而脱落细胞仍可在根际粘液 席由在活客日汶与棱们在本实验中经电镜观察所得的结栗是基本一致的。 圈版i i i 玉米根冠细胞结椅 胞问连丝组分的研究 a ： 根冠横切图( x 4 0 0 ) ：b 根冠级切图( x 4 0 0 ) ：c ：正在脱落细胞( x 5 0 0 0 ) d ：脱落细胞( x 8 0 0 0 ) ： e ：脱落细胞( x 4 0 0 0 ) m u ：粘液质r c ：根冠细胞s c ：正在脱落细胞d c ：脱落细胞 p i a t c s t r u c t u r eo f m a i z er o o tc a pc e l l a ：t r a n s v e r s ev i e wo f r o u tc a p ； b ：l o u g i t u d m a iv i e wo f r o o tc a p ； c ；s k m g h i a gc e l l ；d ：d d 剐抽e dc e l l ；e ：d c t a c l r ：dc e l l m u ；m u c i l a g e ；p c ：r o o tc a pc e l l ；s c ：s l o u g h i n gc e l l ；d c ：d e t a c h e dc e l l 3 2 2 根冠细胞胞间连丝结构的动态变化 电镜下，可以观察到根冠正常细胞间相邻细胞壁密接处有成束胞问连丝存在， 胞问连丝的孔径大约为4 0 5 0 r a n ，其中间的连丝微管清晰可辨( 图版i v ，a ) 。我们在 光镜下己观察到根冠细胞的胞间隙中充斥着大量粘液质，但胞间连丝的存在使得细胞 与细胞之闯维系着原生质体的相互沟通。 在根冠细胞脱落时，外沿细胞与“母体”间的胞间隙逐渐扩大，原来相邻细胞间 呈密接联系细胞壁相互脱离，使得固有的胞间连丝随着细胞壁脱离而被拉长，从而形 成伸长胞问连丝( 图版，b ) 。伸长胞间连丝的长度由原来的o 6 如7 m 可伸长至 1l l2 9 m 。随着胞间隙进一步扩展，胞间连丝发生断裂，进而细胞脱落。此时，根 冠外层细胞的外侧壁以及已脱落细胞的胞壁上出现了大量胞间连丝的残存物，它们的 一端常经壁上孔道而向外突出，与根际环境直接沟通，但内侧仍与质膜相连( 图版， c ) ，此类胞间连丝称为类外连丝。类外连丝的孔径可达到8 0 - - - 9 0 n m 。 上述结果表明，在玉米根冠细胞不断脱落过程中，胞闯连丝的结构发生了剧烈 变更。在电镜下我们观察到三种结构状态的胞间连丝，即正常的胞间连丝、伸长胞问 连丝和类外连丝。 团版根冠细胞胞问连丝的类型 a ：正常胞间连丝( 2 0 0 0 0 ) ：b 伸长胞问连丝( x 2 0 0 0 0 ) ；c ：类外连丝( 2 0 0 0 0 ) p l a t g l vp d t y p o f m a t r r o o t c a p o e u a ! n o r m a lp d ； b ：s t r e t c h i n gp d ； c ；e o x m 8 m a t a - l i k e 胞问连丝组分的研究 a ： 根冠横切图( x 4 0 0 ) ：b 根冠级切图( x 4 0 0 ) ：c ：正在脱落细胞( x 5 0 0 0 ) d ：脱落细胞( x 8 0 0 0 ) ： e ：脱落细胞( x 4 0 0 0 ) m u ：粘液质r c ：根冠细胞s c ：正在脱落细胞d c ：脱落细胞 p i a t c s t r u c t u r eo f m a i z er o o tc a pc e l l a ：t r a n s v e r s ev i e wo f r o u tc a p ； b ：l o u g i t u d m a iv i e wo f r o o tc a p ； c ；s k m g h i a gc e l l ；d ：d d 剐抽e dc e l l ；e