（分析化学专业论文）玉米秸秆发酵制乙醇的试验研究.pdf

捅要 以秸秆生物发酵制乙醇，不仅能够缓解全球能源危机，还可以减少因化石能源利j j 带来的温 室效应及秸秆焚烧对环境造成的污染。在能源危机及环境污染变得越来越严重的情况下，利用秸 秆纤维为原料米生产燃料乙醇成为一项迫切的、具有重要战略意义的任务。本论文以弓2 夏玉米秸 秆为原料，通过多种方法对样品进行预处理，并对纤维素酶解糖化及乙醇发酵过程中的各种影响 因素进行了考察，通过正交实验对工艺参数进行了优化。 分别采j h 有机溶剂处理，酸处理、碱处理、以及酸碱结合预处理方法对玉米秸秆进行预处理。 通过比较发现酸碱结合预处理的效果最好：处理后糖化率达到6 6 1 6 ，而且这种处理方法能使纤 维素和半纤维素达剑较好的分离，在后续发酵中可以使木糖和葡萄糖在各自的最佳条件卜单独发 酵，提高乙醇产量。 利用纤维素酶对预处理后的秸秆进行降解糖化，以糖化率为指标，对酶解过程中底物浓度、 酶解温度、酸度、酶解时间及酶用量等影响冈素进行了考察。确定酶解糖化的最佳工艺参数为： 底物浓度为1 ，酶用餐为2 0 0 0 u m l ，p h 4 9 ，温度为4 5 ，反应时间为4 8 小时，在此条件下， 糖化率达剑8 6 2 4 。 同定化酶比游离酶有较好的稳定性，可以重复使用和同收，义便于连续操作，所以本文刚硅 胶做载体，戊二二醛作交联剂，制备了同定化纤维素酶，并用于酶解玉米秸秆。对影响l 矧定化的因 素及影响酶解的冈素进行了考察，通过止交试验优化得山最佳的f i l i f 定化条件为：交联剂戊二醛浓 度为1 ，p h 值为5 0 ，嘲载量为1 0 0 m g g 。以糖化率为指标进行酶解影响冈素考察，确定最佳 时间是4 8 h ，底物浓度是2 ，温度是5 0 ，p h 为4 0 ，给酶量是0 6 m g g 。 对乙醇发酵过程中的各种影响冈素包括酸度、发酵时间、接种量和发酵温度等进行了考察， 并通过正交试验优化了r 1 ：艺参数，确定最佳发酵：f 艺条件为：p h 5 5 ，反应时间为5 4 小时，接种 量为1 0 ，温度为4 2 ，在此条件下，乙醇产量为0 2 1 3g g 。 关键词：玉米秸秆，预处理，糖化，发酵，乙醇 a b s t r a c t t h ef u e le t h a n o lp r o d u c e db yc o r ns t a l kf e r m e n t a t i o nn o to n l ye a s et h eg l o b a le n e r g yc r i s i sb u ta l s o r e d u c et h eg r e e n h o u s ee f f e c ta n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nc a u s e db yu s i n go ff o s s i le n e r g ya n ds t r a w b u r n i n g w i t ht h ew o r s eo fe n e r g yc r i s i sa n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ， i th a sb e c o m em o r ea n dm o r e u r g e n tt op r o d u c ef u e le t h a n o lt h r o u g hf e r m e n t a t i o no fc o r ns t a l k i nt h i sp a p e r ，t h ec o r ns t a l k sf r o m n i n g x i af a r mw a su s e da sr a wm a t e r i a lf o rt h ep r o d u c t i o no fe t h a n o lb yb i o - f e r m e n t a t i o n ，t h ef a c t o r s i n f e c t e dt h es a m p l ep r e t r e a t m e n t ， e n z y m a t i cs a c c h a r i f i c a t i o no fc e l l u l o s e ， a n dc o i u s co ff e r m e n t a t i o n w e r ee x a m i n e da n dt h ec o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e dt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t i nt h ep r o c e s so fs a m p l ep r e t r e a t m e n t ，c o r ns t a l k sw e r er e s p e c t i v e l yp r e t r e a t e db yo r g a n i c s o l v e n t s ，d i l u t e da c i d ，d i l u t e da l k a l i n ea n dt h ec o m b i n a t i o no fa l k a l ia n da c i d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ec o m b i n a t i o no fa l k a l ia n da c i di sb e t t e rt h a no t h e rs o l v e n t sf o rt h ep r e t r e a to fc o r ns t a l k s ，w h i c hg i v e t h es a c c h a r i f i c a t i o nr a t eo f 6 6 1 6 ，a n df u r t h e r m o r e ，c e l l u l o s ea n dh e m i c e l l u l o s ec a nb es e p a r a t e db y t h i sm e t h o dw h i c hi sb e n e f i c i a lf o rt h ef o l l o wf e r m e n t a t i o no fx y l o s ea n dg l u c o s eu n d e re a c hb e s t c o n d i t i o n s ，w h i c hc a ni n c r e a s ee t h a n o lp r o d u c t i o n t h ep r e t r e a t e dc o ms t a l k sw a ss a c c h 撕f i e db yc e l l u l a s e ，a n dt h ei n f l u e n c ef a c t o r so nt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t e ，s a c c h a r i f i e dt e m p e r a t u r e ，s a c c h a r i f i e d a c i d i t y ，s a c c h a r i f i e dt i m ea n de n z y m ed o s a g ew e r es t u d i e du s i n gh y d r o l y s i sr a t ea si n d e x t h e o r t h o g o n a l t e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m a lh y d r o l y s i s c o n d i t i o n sw e r e ：c o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t e ( 1 ) ，e n z y m ed o s a g e ( 2 0 0 0 u m 1 ) ，p hv a l u e ( 4 9 ) ，t e m p e r a t u r e ( 4 5 。c ) ，a n dt i m e ( 4 8 h ) u n d e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o nt h es a c c h a r i f i c a t i o nr a t ei sr e a c h8 6 2 4 t h ei m m o b i l i z e de n z y m ei sm o r es t a b l ei nt h ea c t i v ea n dc a nb eu s e df o rm a n yt i m e s ，i l lt h i sp a p e r t h ec e l l u l a s ew a si m m o b i l i z e do ns i l i c ag e l sw i t hg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s l i n k i n ga g e n ta n dw a su s e dt o h y d r o l y z ec o r ns t a l k t h ef a c t o r si n f e c t e dt h ea c t i v eo fi m m o b i l i z e de n z y m ea n dt h ef a c t o r si n f e c t e dt h e e n z y m a t i cs a c c h a r i f i c a t i o nw e r es t u d i e dr e s p e c t i v e l y t h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t s ，t h ec o n d i t i o n so f i m m o b i l i z e dc e l l u l a s ew e r eo p t i m i z e dw h i c hw e r e ：g l u t a r a l d e h y d el ，p hv a l u e5 0 ，a m o u n to f e n z y m ei m m o b i l i z e do nc h i t o s a nlo o m gs i l i c a t h ee n z y m a t i cs a c c h a r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ： r e a c t i o n t i m e4 8 h ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e2 ，t e m p e r a t u r e ( 5 0 。c ) ，p hv a l u e ( 4 0 ) ，e n z y m e d o s a g e ( 0 6 m g g ) t h ef a c t o r si n f e c t e dt h eb i o - f e r m e n t a t i o ni n c l u d i n ga c i d i t y ，f e r m e n tt i m e ，t h eq u a n t i t yo f i n o c u l a t i o n ，t e m p e r a t u r ew e r eo p t i m i z e d ，t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n tt h ep a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e d w h i c hw e r e ：p h 5 5 ，t i m e ( 6 6 h ) ，1 0 i n o c u l u ms o l u t i o n ，t e m p e r a t u r e4 2 c u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n ，t h ep r o d u c t i o nr a t i oo f e t h a n o li s0 2 1 3 9 g k e yw o r d s ：c o r nt a l k ，p r e t r e a t m e n t ，s a c c h a r i f i c a t i o n ，f e r m e n t a t i o n ，e t h a n o l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生签名： 玄 ，之及 时间： 2 咖年雩月涉同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：壶7 左劣 时间： 叫晖岁月涉只 导师签名： 杨歇呐 时问： 2 小年岁月答r 宁理大学硕f 学位沦文篇一章文献综述 曼i i _11i i i ： _ _ - - 量 第一章文献综述 1 1 能源问题与生物质利用 1 1 1 能源问题现状 能源是人类社会赖以生存和实现可持续发展的动力。目前世界上使用的8 0 的能源为不可再 生的化石燃料，而这些化石能源坚持不了几代人的时问就会逐渐枯竭耗尽【l l 。根据世界能源委员 会( 舰c ) 公布的数字，煤炭、石油、天然气三大资源按照当前储量和2 0 0 0 年预测的年平均能 耗计算分别只能使用3 1 7 年、5 8 8 年和6 6 5 年【2 】。另外人们在使用化石燃料的同时也向大气中排 放大量的二氧化碳、二氧化硫等气体，使全球变暖，严重影响着人类的健康和人们赖以生存的自 然环境。随着化彳i 燃料的不断消耗和日趋枯竭，以及人们环保意识的不断加强，研究开发可再生 的清洁能源成为2 l 世纪人类需要解决的问题之一。生物质能属于清洁能源，不仅可以从根本上 缓解能源危机，而且有助于国家的环境建设和c 0 2 减排，因此火力发展以生物质能源为代表的新 一代可再生能源是重要的出路。我国能源问题更加严峻，人均能源资源量远低丁世界平均水平， 另外中国能源还存在环境污染严重、能源价格不合理、可再生资源开发利川率低等问题。开发生 物质能源成为解决中国能源问题的关键冈烈引。 1 1 2 生物质能源的开发利用 生物质能源是由植物的光合作用同定于地球上的太阳能，最有可能成为2 l 世纪主要的新能 源之一。地球上每年植物光合作刚同定的能量相当于全世界每年耗能量的1 0 倍。生物质遍布世 界各地，其蕴藏量极人，仅地球上的植物每年生产量就相当于现阶段人类消耗矿物能的2 0 倍， 或相当丁世界现有人口食物能量的1 6 0 倍【4 】，可谓取之不尽、用之不竭。生物质能源的主要的开 发方式包括：沼气技术、生物质热裂解( 生物质发电) 、生物质液体燃料等。其中生物质液体燃 料技术成为当前发展的热点。该技术原材料资源丰富，同时燃料乙醇作为安全、清洁的燃料及汽 油添加剂目前己经j “泛应用睁。j 。 传统的燃料乙醇生产主要以玉米、小麦或甘蔗为原料，但其原料成本高达总成本的4 0 1 8 j 。 中国地少人多，决定了基r 粮食为原料的乙醇人规模生产必将导致“与人畜争粮，与粮食争地”的 不利局面。在我国利用甘蔗等糖料作物生产燃料乙醇也将受到士地资源和原料成本的限制而无法 人规模推广。 木质纤维原料中纤维素约占干重的3 5 4 5 ，半纤维素约占2 0 - 4 0 ，采用适宜技术可 将它们水解成可发酵性糖，进一步发酵生产乙醇f 9 1 2 】。我国是一个农业大国，植物纤维资源十分 丰富，仅农作物秸杆每年产量就达7 亿吨【1 3 - 1 4 1 。农作物秸秆除少数被气化利用外，一部分被直接 做炊事用，处丁低热值利用和环境污染严重的水平。火量的农作物秸秆不能被合理有效地利用， 近儿年尤其是农业主产区的秸秆发生了大面积资源的焚烧，不仅造成环境污染和火火隐患增加， 更严重的是影响公路和比航交通安全，对生态和环境造成了极人的损害，同时巨大的秸秆生物质 资源造成了巨人的浪费。 宁砭尺学弼! f 学位论上第一币文献纭：述 曼曼苎曼曼! 曼量蔓曼! 曼蔓! 曼曼曼鼍曼皇曼鼍曼舅曼皇舅_ m_ m!mm n i 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼舅舅曼曼蔓曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼 利用秸秆生产乙醇，对我国经济和社会的可持续发展具有十分重大的意义 1 5 j 。( 1 ) 缓解能源 危机，近年来，随着经济持续快速发展，能源需求不断增加，我国正面临着严峻的能源安全形势， 能源需求将持续增长。因此开发利用生物质能源是我国缓解能源危机重要战略举措。( 2 ) 减轻环 境污染，燃料酒精能减轻对化石燃料的依赖，减轻化石燃料燃烧对环境产生的不利影响，由木质 纤维素生产燃料酒精形成了基本上封闭的碳循环，没有二氧化碳净排放，有利于减轻温室效应。 1 2 木质纤维素生产燃料乙醇的国内外发展概况 1 2 1 国外纤维燃料乙醇的发展概况 现代： 业的迅速发展，大规模开发利用作为清洁能源的可再生资源显得日益重要。生物质能 源的开发利用早己引起世界各国政府和科学家的关注。有许多国家都制定了相应的开发研究计 划，例如：美国的“能源农场”、巴西的“酒精能源计划”、印度的“绿色能源1 j 稃”和日本的“阳 光计划”等发展规划。其它诸如丹麦、荷兰、德国、法国、加拿大、芬兰等国，多年来一直在进 行各自的研究与开发，并形成了各具特色的生物质能源研究与开发体系，拥有各自的技术优势【i 酬。 巴两是目前世界上年产燃料乙醇最多、强制推，1 ：乙醇汽油最早的国家，也是世界上唯不使 用纯汽油作为汽车燃料的国家。第二次世界人战之后，随着石油供应得缓和，巴西乙醇汽油的应 用停滞不前，直到1 9 7 4 年第一次世界彳i 油危机才促使巴西政府下决心推行乙醇汽油计划。从1 9 7 5 年开始实施“燃料乙醇计划”，以甘蔗为原料生产燃料乙醇替代车用汽油i i7 - 1 8 ,经过多年的努 力，巴两“燃料乙醇计划”达到了预期目的。自从1 9 8 5 年以来，燃料乙醇产量平均年产量达l o o o 万吨，累计替代石油约2 亿吨。目前巴两所有车用汽油均添加2 0 2 5 的燃料乙醇，并且已有 人量使刚纯燃料乙醇的汽车，2 0 0 5 年销售的汽车有7 0 为可以完全燃用纯燃料乙掣j 。此外， 巴西还开发了以甘蔗渣为原料制乙醇的新技术( 迪丁尼快速水解法d h r ) ，d h r 技术可减少水解 蔗渣的时间而获得高的转化率，它的技术性和经济性得到了认可【2 0 | 。 美国是当今世界第二大燃料乙醇生产国，乙醇产量仅次于巴西。与巴西不同的是，美国主要 以玉米为原料生产乙醇，所耗玉米占全国玉米总产量的7 8 。早在2 0 世纪3 0 年代美国就开展 了变性燃料乙醇的研究及应_ f i 工作，1 9 7 9 年，美国国会为减少对进口原油的依赖，从寻找替代能 源的角度出发，制定了联邦政府“乙醇发展计划”，开始人力推广使用含有1 0 乙醇的混合汽油。 1 9 9 9 年，美国环保局与国会合作，针对汽油增氧荆m t b e ( 甲基叔丁醚) 对水资源的污染，制定了 2 0 0 2 2 0 1 1 年期间新的国家清洁燃料替代计划，一些州己明令禁j ：使用m t b e ，由燃料乙醇取而 代之。目前美国已有2 0 个州生产燃料乙醇，专业工厂已超过7 0 家，总生产能力超过1 0 0 0 万吨 年，计划剑2 0 1 2 年将要扩人剑2 2 0 0 万吨年，并预计届时每天可以减少8 万桶原油的消耗【2 卜2 4 1 。 迄今为i ：，全世界已经有几十套纤维质原料经纤维素酶水解成单糖的中试生产线或小试生产 线。这些试验或试生产机构包括美国陆军n a t i c k 研究发展中心、美国加州人学劳伦斯伯克莱实 验室、美国阿肯色大学生物鼙研究中心、美国宾夕法尼弧大学、日本石油替代品发展研究协会、 瑞典林产品研究实验室、芬兰技术研究中心【2 5 1 。综上所述，在国外，以纤维质为原料生产酒精止 逐步走向一个技术成熟的过渡阶段，但距纤维乙醇产业化发展的目标仍然需要很k 的路要走。 2 宁夏上学硕 学位论文第帝文献巧：述 1 2 2 国内燃料乙醇的发展概况 我国的燃料乙醇生产在近几年才受到政府高度重视，经国务院批准，原国家计委t - 2 0 0 1 年4 月1 7 日发布实施车用汽油添加燃料乙醇的决定，同时，国家质量监督检验总局颁布了变性燃 料乙醇( g b l 8 3 5 0 2 0 0 1 ) 和乙醇汽油( g b l 8 3 5 l 一2 0 0 1 ) 的国家标准，为我国进一步推 广使用变性燃料乙醇提供了规范。我国第一套大型变性燃料乙醇生产装置于2 0 0 1 年在河南南阳 天冠集团建成投产，到“十五”期末，全国变性燃料乙醇生产总量达到了1 0 2 万吨，其中包括吉林 变性燃料乙醇有限责任公司3 0 万吨年( 一期) 、河南天冠集团3 0 万吨年、安徽丰原生物化学股份 有限公司3 0 万吨年和黑龙江华润酒精有限公司己投产的l o 万吨年。 目前我国有一些科研机构、大学和企业在这方面也开始了研发丁作，取得了一些进展。由浙 江大学主持的“利用农业纤维废弃物代替粮食生产酒精”的项目已在河北完成中试并正式投入工 业化生产。该项目采片j 玉米芯为原料，出酒率为2 2 2 ( w w ) 2 6 1 。华东理i t 大学承担的国家“8 6 3 ” 课题“纤维素废弃物制取乙醇技术”项目以废木屑为原料，以稀盐酸水解和氯化亚铁为催化剂的水 解i ：艺以及水解产物葡萄糖与木糖的共发酵的条件研究，转化率达到了7 0 ，并于2 0 0 5 年已建 成了纤维乙醇6 0 0 吨年的示范性+ 1 ：厂1 2 7 】。山东大学微生物技术国家重点实验室开展“纤维素原料 转化乙醇关键技术”研究，对预处理方法试验：酸水解j ：艺、蒸汽爆破、低温氨爆破等方法，对纤 维素酶高产菌的筛选和诱变育种、刚基冈手段提高产酶量或改进酶系组成、纤维素酶生产技术、 天然废物利川策略等研究【2 鼬9 1 。但以纤维素为原料生产燃料乙醇的技术条件的研究还不成熟，f t 艺技术的改进和基础理论的研究仍在进行之中。我国以纤维质废物为原料生产燃料乙醇仍需进一 步的深入研究。 1 3 木质纤维素水解制备燃料乙醇概述 1 3 1 木质纤维素水解原料及其性质 术质纤维原料主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，构成了植物的细胞壁，对细 胞起保护作用，另外在木质纤维素中还存在很少量的灰分、蛋白质和浸提物等等。不同物质中纤 维素，半纤维素和术质素的含量不同，表1 1 给出了部分生物质原料的组成【3 0 】。 3 ：墨銮主：士：箸：毒茎：耋耋彗誊蓄 表1 1 部分生铀匪罐料的组成 术质纤维素的内部存在着、n 纤维索、纤维素和木质素相互变联的母体结构，在这个结构中半 纤维素和木质桑以化学键紧密结构，纤维素以氢键同巾纤维素或者小质索相结合，这些共唰组成 个紧密而完整的结构3 1 , 3 2 1 。木质纤维素结构如f ni - 一”。 圉卜j 木质纤维素结构i 童图 4 宁夏人学硕 j 学 暖论文第一节文献综述 纤维素是d 葡萄糖以b - 1 4 糖苷键结合起来的链状高分子化合物。根据聚合度的不同可以分 为q 一纤维素和b 纤维素；根据聚集状态，即纤维素的超分子结构，可分为结晶区和无定型区。天 然丝状纤维素相邻分子通过葡萄糖基2 、3 、6 位上的羟基形成氢键相互结合形成纤丝，并在一定 空间内形成结晶区域。结晶区域的紧密结构在纤维素降解过程中成为主要阻力。 半纤维素是由五碳糖和入碳糖组成的短链异源多聚体。半纤维素主要可以分为三类：木聚糖 ( 它的骨架由聚b l ，4 一木糖构成，其侧链由阿拉伯糖、葡糖酸、阿拉伯酸组成) ；甘露聚糖( 包 括葡糖甘露聚糖、半乳甘露聚糖) 和阿拉伯半乳聚糖j 。由于半纤维素在化学结构上具有支链， 所以它的物理结构是无定形的，聚合度很低，所含糖单元数在6 0 2 0 0 基本没有结晶结构，因此， 不如纤维素稳定，在各种剧烈环境中都较容易降解，在1 0 0 摄氏度左右就能在稀酸里水解，也可 在酶催化下完成水解。从不同的植物组成可见，植物体中、i - 纤维索含量略少或接近纤维素，因此 ? 卜纤维素的有效利用是开发利用燃料乙醇的关键之一。 术质素是以苯基丙烷为基本结构单元连接的高分枝多分散性高聚物。木质素有一定的塑性， 不溶丁水，一定浓度的酸或碱可使其部分溶解。木质素不能水解为单糖，且对纤维素酶和、卜纤维 素酶降解纤维原料中的碳水化合物有空间阻碍作用，从而降低反应速率。冈而对本质纤维素进行 预处理，除去木质素，或破坏术质素层，尽量使纤维素结晶度降低【弭3 5 】，提高纤维素的糖化率是 生物质燃料乙醇生产的关键步骤。表l - 2 总结了植物细胞壁中纤维素、半纤维素和小质素的结构 和化学组成【j q 。 表i - 2 植物细胞壁中纤维素、半纤维素和木质素的结构和化学组成 5 宁夏人学硕f ：学f t 论史第章文献综述 1 3 2 木质纤维素预处理 纤维素被j 纤维素和木质素层包围，使纤维素酶无法接近，所以在水解前必须进行预处理， 改变天然纤维结构，把纤维素同半纤维素和木质素分离开，降低纤维素的结晶度，增加基质的孔 隙度，增大酶与纤维素的接触面积，从而提高酶解的效率。影响木质纤维素水解的主要因素有三 个：原料内孔面积、纤维素结晶性、木质素和j 纤维素的包覆作用【3 刀。m c m i l l a i l 【3 7 l 指出，除去半 纤维素和本质素后，纤维素中形成了更理想的反应通道，可以使纤维素更好地与酶接触。酶的消 化性与半纤维素的去除直接成止比。从原理上讲，有效的预处理可以去除木质素和半纤维素，降 低纤维素的结晶性，从而增人原料的可接近表面积，使得酶容易接近纤维素表面进行水解。预处 理方法的选择主要从提高效率、降低成本、缩短处理时间和简化：序等方面考剧弱j 。表1 3 列出 了各种预处理方法对木质纤维素水解因素的影响。 表卜3 预处理方法对木质纤维素水解因素的影响 6 宁夏大学硕f j 学位论文第章文献综述 ! , , i i i i l l = l i i l l i 曼曼皇! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! ! 曼曼皇曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼寰 预处理是水解前的重要环节，是酶解经济性的重要制约冈素。预处理方法归纳起来包括物理 法、物理化学法、化学法和生物法。 物理法 常用的物理处理方法微波预处理，高温热水处理，超微碾磨粉碎、挤压膨化法、高能辐射、 紫外线光分解、冷冻研磨、快速减压利超声波处理等【3 9 1 。 微波预处理，微波是一种新型节能的无温度梯度的加热技术，微波处理具有热效率高、易操作、 方便和无污染的特点，在很多领域被广泛应用【舡4 】。研究表明微波能够部分降解木质素和半纤维 素，从而增加其可及度，提高植物纤维素的酶水解的效率【4 2 1 。 高温热水预处理植物纤维素原料可以除去其中部分木质素和几乎全部的半纤维素，增加其可 及度，提高植物纤维素的酶水解的效率f 4 3 j 。 物理化学方法 蒸汽爆破法( 自动水解) ：蒸汽爆破法是常用的木质纤维原料预处理方法洲。在此方法中， 通过高压饱和蒸汽处理，压力骤减，使原料经受爆破性减压而碎裂。蒸汽爆破法的典弛反应条件 为：1 6 0 2 6 0 ( 相应的压力为0 6 9 4 8 3 m p a ) ，作j 【 j 时间为几秒或几分钟。该方法由于高温引 起半纤维素降解，木素转化，使纤维素溶解性增加。然而木聚糖的部分破坏、术素碳水化合物复 合体的不完全破坏及阻碍微生物活性的化合物的产生都限制了蒸汽爆破法的发剧4 5 | 。 化学法1 4 6 4 9 1 化学法主要是指以酸、碱、有机溶剂作为物料的预处理剂，破坏纤维素的晶体结构，打破术 质素与纤维素的连接，同时使半纤维素溶解。化学法有稀酸处理法、臭氧分解法、碱处理法、湿 氧化法和有机溶剂法等。 碱预处理操作简便，设备要求较低，用碱处理天然纤维素材料可显著提高酶解效率。碱水解 的机理是基于连接木聚糖半纤维素和其他组分内部分子之间( 比如木素和其他、卜纤维素之间) 酯 键的皂化作用。连接键的脱除增加了木质纤维原料的多孔性。稀氢氧化钠处理引起术质纤维原料 润胀，结果导致内部表面积增加，聚合度降低，结晶度下降，木质素和碳水化合物之间化学键断 裂，木质素结构受到破坏。常用的碱包括n a o h 、k o h 、c a ( o h ) 2 和氨水等。 稀酸预处理通常采用0 3 3 的h 2 s 0 4 于11 0 - 2 2 0 下处理一定时间。由于半纤维素被酸水 解成单糖，纤维残渣形成多孔或溶胀型结构，从而促进了酶解效果。但稀酸预处理对纤维原料中 木质素的脱除效果不佳，这在一定程度上也限制了纤维原料的酶解效率。此外，稀酸处理后所得 的处理液中含有大量的木糖，可川来进行微生物发酵转化为其他产品，因而这部分被降解的j f 纤 维素也可以得剑经济合理的运朋。 臭氧处理使木质素受到很人程度的降解，? 扛纤维素受到影响比较小，纤维素儿乎不受影响。 臭氧处理可在常温常压下进行，有效去除术质素，方法简单，能分解氨、碱处理不能分解的舣子 叶类的木质纤维素，不产生对进一步反应起抑制作用的物质。缺点是需要臭氧餐较人，生产成本 昂贵。 有机溶剂法是利用有机溶剂或者有机溶剂与无机酸催化剂( h c l 或硫酸) 的混合溶液在高温 下溶解木质素，引起纤维素的润胀，进而除去小质素并有利于木质纤维素的后续水解。常川有机 溶剂主要有甲醇、乙醇、丙酮乙烯基乙二醇、三甘醇及四氢化糠基乙醇。 7 j 。夏大学f j ) ! 学f 逻论丈第一节戈献综述 i i e i i i 一一i _ 皇 生物法 虽然有许多微生物能产生木质素分解酶，但活性低，一时难以得到利用。木腐菌分解木质素 的能力较强，通常分为三种：白腐菌、褐腐菌、软腐菌，而白腐菌是分解木质素的能力较强。瑞 典等北欧国家则利用无纤维素酶的担子菌突变株对纤维素材料进行脱木质素处理，取得了显著的 效果。微生物处理方法具有：肖约化工原料、能源和减轻环境污染等方面的优点，但微生物处理方 法的一个最大缺点是处理周期长。 总之，无论用哪种预处理方法对木质纤维素进行预处理，对后续水解反应都有一定的促进作 用，但也有其相应的局限性。预处理对木质纤维素的水解有重要作用，因此，预处理方法的研究 对木质纤维素制取燃料乙醇大规模工业化生产有重要促进作用。 1 3 3 木质纤维素水解糖化 木质纤维素的酸水解 稀酸糖化：稀酸水解t 艺采_ h j 两步法【5 0 l ：第一步稀酸水解在较低的温度下进行，在此过程中， 半纤维素非常容易被水解得到木糖等五碳糖产物；第二步稀酸水解是在较高的温度下进行，重新 加酸水解残留吲体( 主要为微品纤维素) ，得剑可发酵水解产物葡萄糖。在稀酸水解中，对无机酸 研究得比较多，常刚的无机酸为硫酸、盐酸和磷酸等【5 。，稀酸水解i ：艺需要较高的温度和乐力 ( 1 2 0 2 2 0 和i m p a 以上) ，而且水解过程中会生成对发酵有害的副产品。 浓酸糖化：浓酸水解的原理是结晶纤维素在较低的温度下可完全溶解丁7 2 的硫酸、4 2 的 盐酸和7 7 8 3 的磷酸中，导致纤维素的均相水解。浓硫酸水解的主要优点是糖的同收率高。 然而酸对水解反应器的腐蚀作用是一个重要问题。而且采用了人量硫酸，需要回收重复利j 【l j 。 木质纤维素的酶水解 酶水解上艺与酸水解j r 艺的不同在于利川纤维素酶将纤维素、半纤维素降解为可发酵糖，然 后发酵获得燃料乙醇。纤维素酶包括多种水解酶，构成了一个复杂的纤维素酶系。按其性质可将 纤维素酶分为3 类：葡聚糖内切酶( 简称e g ) ，这类酶作用丁纤维素分子内部的1 ：结晶区，随机 水解阻1 ，4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生人量带非还原性末端的小分子纤维素。葡聚 糖外切酶( 简称c b h ) ，或称微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或c l 酶。这类酶作用于纤维素分子 末端，水解p 1 ，4 糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。1 3 - 葡萄糖苜酶( 简称b g ) ，或称纤维素二 糖酶。天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠这3 种组分的协同作刚才能完成【5 2 1 。在纤维 素水解过程中，首先由内切型d 一葡聚糖酶优先在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的无定形 区进行切割，产生新末端，生成较小的葡聚糖；然后再由外切型- 1 3 一葡聚糖酶作刚丁末端基释放出 纤维二糖和其他更小分子的低聚糖；最后由p 葡萄糖茁酶将纤维二糖分解为葡萄糖分子【5 3 1 。 酶法水解较酸解法有明显的优势，酶法水解是在高效专一的纤维素复合酶作刚卜进行的，具 有反应温度低、副产物少、不生成有毒降解产物过程能耗低、糖产率高等优点【5 4 1 。但酶解破坏纤 维素结构形成糖也需要比较长的停留时间，需要进行原料的预处理，酶的同收( 提高这种水解方 法的经济性) 等，其中关键问题是要降低成本。从长远看来，酶法水解是一种更为合理更有发展 潜力的糖化方法。 8 宁夏人学顾f 学位论文第节文献综述 1 3 4 酶的固定化 酶的同定化( i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e s ) 是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进 行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、 专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、可多次重复使用等一系列优点。酶 的同定化及其酶促反应研究是最具发展前景的生物技术前沿领域之一，它对阐明酶在体内的作用 方式、作剧规律和调。1 ，机制有重要价值，它将在人类社会可持续发展战略中发挥重要作用5 6 1 。 酶的固定化方法5 硒1 1 包埋法 包埋法指将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶i 司定化。包埋法分为网格型和微囊犁两类，其 制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力。 吸附法 这是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用同定化酶的方法。吸附法( a d s o r p t i o n ) 包 括物理吸附法( p h y s i c a la d s o r p t i o n ) f i l l 离子交换吸附法( i o n b i n d i n g ) ，可供选择的载体涉及天然和合 成的无机和有机高分子材料，有时酶的纯化和固定化可同时实现。 共价结合法 共价结合法是酶蛋白分子上功能团和同相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连 接以同定酶的方法。由于酶与载体间连接牢同，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使刚性， 成为目前研究最为活跃的一类酶同定化方法。 交联法 交联法是川舣功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，是酶分子和双功能试剂或多功 能试剂之间形成共价键，得到二向的交联网状结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的 分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的固定化酶。常片j 交联 剂有戊二醛、双重氮联苯胺2 ，2 ，一二磺酸等【6 2 1 。 1 3 5 木质纤维素糖化液发酵 木质纤维素发酵制乙醇的方法有分步糖化发酵法( s h f ) ，同步糖化发酵法( s s f 法) 、同步 糖化共发酵法，非等温同时糖化发酵法( n s s f 法) 、固定化细胞发酵法等。 分步水解糖化发酵法( s h f ) ：纤维素酶法水解与乙醇发酵分步进行，这是目前以玉米为原料 生产燃料乙醇技术的最常用的方法，其优点是酶解和发酵都可在各自最适条件卜进行，4 5 5 c i 酶解，3 0 - - - 3 5 乙醇发酵，但是在这个过程中乙醇的产量会受剑末端产物，低细胞浓度和底物基 质的抑制【6 3 】，导致乙醇的转化率较低。为了克服乙醇产物的抑制，必须不断的从发酵罐中移出， 采取的方法有：减乐发酵法、快速发酵法、阿尔法一拉伐公司的b i o t i l e 法。对细胞进行循环利川， 可以克服细胞浓度低的问题。筛选在高糖浓度下存活并能利川高糖的微生物突变株，以及使菌体 分阶段逐步适应高基质浓度，可以克服基质抑制。 同步糖化发酵法( s s f ) ：g a u s s 等人于1 9 7 6 年提出了在同一个反应罐中同步进行纤维素水解 和乙醇发酵的同步糖化发酵法t 6 4 1 ，即纤维素的酶水解过程和糖的乙醇发酵在同一容器内进行。这 9 宁夏人学硕 + 学f 论文第一章 丈献综述 i i i i i l a i i i l ：a l - i i - -ii曼-曼 种方法的优点在于酶水解产物葡萄糖不断地被发酵成乙醇，从而解除了葡萄糖对纤维素酶的反馈 抑制，有利于酶水解反应地进行，从而提高了糖化和发酵效率；在工艺上采用一步发酵法，简化 了工艺，减少了设备投资，生产中能耗降低，因此这种方法越来越受到人们重视。同步糖化发酵 法的优点显而易见，但同时也有三个明显的制约因素：一是木糖的抑制作用，二是糖化和发酵的 最适温度不协调一致，三是终产物乙醇的抑制作用。 纤维素类物质的主要成分除纤维素外，尚有半纤维素和木质素。木质素本身对纤维素酶并无 抑制作用，当木糖浓度达到5 时，木糖对纤维素酶的抑制率可达1 0 。消除术糖抑制的办法是 找剑一个能将木糖转化为乙醇的酵母，然后和利用葡萄糖转化为乙醇的酵母同时进行混合培养。 在纤维素糖化过程中，纤维素酶的最适作用温度是5 0 左右，而酵母发酵的最高温度是3 7 - 4 0 0 c 。 如何使这两个过程的温度不协调性尽可能趋向一致，这是高效率生产乙醇的重要因素。有人提出 解决的办法是筛选耐高温的产乙醇酵母，进行高温同步糖化发酵。 发酵液中高浓度的乙醇除对酵母发酵有抑制作用外，也对纤维素酶具有不同程度的抑制作 用。根据目前的研究结果看，同步糖化过程中乙醇的抑制作用比单一糖化过程中葡萄糖的抑制作 用要小，但抑制作用的人小，要根据酶，基质来源的不同而有所差异。 同步糖化共发酵法( s s c f ) ：纤维原料酶解、己糖发酵和戊糖发酵同时进行，可采h j 混菌发酵 或木糖代谢i ：程菌进行。s s f 和s s c f 都面临的主要问题是开发合适的微生物菌群。有研究者指 出，在糖化过程中，温度升高2 0 ，纤维素的水解速率提高一倍。因此，开发出可以在5 0 。c 温度 以上作用的微生物，对纤维素酶的成本降低有很大帮助1 6 引。 非等温同时糖化发酵( n s s f 法) ：在纤维素酶糖化过程中，纤维素酶的最适温度为5 0 左 右，而酵母发酵的控制温度是3 1 3 8 1 2 。z h a n g w e nw u 等m 1 提出了利用1 等温同时糖化发酵 法生产乙醇。该工艺使水解和发酵可在各自最佳的温度下进行，能很好地解决了纤维素酶糖化与 酵母发酵两个过程中温度不协调的矛盾，也可消除水解产物对酶水解的抑制作用，但显然也使f 艺流程复杂化了。而且由于酿酒酵母对温度变化比较敏感，因此应用该t 艺造成体系中产生较多 的死酵母细胞，应及时从发酵罐底排出，以免影响乙醇发酵，同时造成酿酒酵母使用代数减少。 固定化细胞发酵：固定化细胞发酵具有能使发酵罐内细胞浓度提高，细胞可连续使用，使最 终发酵液乙醇浓度得以提高。常用的载体有海藻酸钠、卡拉胶、多孔玻璃等。同定化细胞的新动 向是混合固定细胞发酵，如酵母与纤维二糖酶一起同定化，将纤维_ 二糖基质转化成乙醇，此法引 人注目，被看作是秸秆生产乙醇的重要方法【6 丌。 1 3 6 木质纤维素发酵目前存在的问题 近年来，国内外对利用生物质尤其是秸秆纤维来生产燃料乙醇进行了人量的研究，但该技术 一直未能在规模生产中推广应用。究其原因，主要表现为以下三个方面。( 1 ) 生物秸秆糖化前的 预处理效果不理想：天然纤维素原料的结构复杂，纤维素、半纤维素和术质素三者结合牢l 乩现 有技术很难使三者得到有效分离或降解，从而增加了后续酶解的难度，进而影响生物发酵的效率。 ( 2 ) 纤维素酶的成本太高，生产过程中，酶刚餐偏人。( 3 ) 戊糖和己糖不能同时发酵。在秸秆 纤维的糖化液中3 0 为戊糖( 以术糖为主) ，7 0 为己糖( 以葡萄糖为主) ，这些糖类是燃料乙醇 产生的直接物质。但是目前生产乙醇的微生物都仅仅可以利用己糖，并将己糖转化形成乙醇，而 l o 宁夏人学硕l 学化论史 第帝史献综述 无法将戊糖转化形成乙醇，造成糖化液中3 0 的戊糖成分不能被利用，直接导致燃料乙醇的产率 低。故五碳糖的发酵效率也是决定发酵过程经济性的重要因素。 1 4 课题研究内容 ( 1 ) 预处理荆的选择：以玉米秸秆为原料，先将原料粉碎，然后选用不同的预处理剂对原料进 行预处理，包括酸处理、碱处理、酸碱结合处理、不同有机溶剂处理，测定处理前后样品中纤 维素、半纤维素和木质素的含量及样品水解糖化率，通过比较选择合适的预处理剂。 ( 2 ) 酶解糖化条件的选择： 以纤维素酶作为水解酶，对预处理后的秸秆样品进行酶解糖化，以 糖化率为指标，对影响酶解糖化过程中的主要冈素，包括底物浓度、酶解温度、酶解酸度、酶解 时间及酶刖量进行考察。确定酶解糖化的最佳上艺。 ( 3 ) 纤维素酶同定化：同定化酶比游离酶有较好的稳定性，可以重复使h j 和同收，又便于连续 操作。本文拟以硅胶做载