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米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因c d n a 克隆及序列分析 摘要 半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，其主要成分是木聚糖 ( x y l a n ) 。木聚糖的来源不同，分枝程度不同，其主链和支链带有多种不同类型的取代基 团。由于木聚糖结构的复杂性，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。b 一1 ， 4 内切木聚糖酶( e c 3 2 1 8 ) 能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和 少量的木糖，因此它是木聚糖降解酶中最关键的酶。 木聚糖酶是一种诱导型酶，为了提高r t - p c r 的扩增效率，本试验首先通过初步筛选， 确定米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ，a s3 4 3 8 2 ) 为最适宜产酶菌株，并对其产酶条件及 酶学性质进行了研究。通过分析比较酶的产生和细胞生长的关系，确定了该菌株的产酶模 式。在确定了最佳产酶诱导物和产酶模式的基础上，本文首次利用r t - p c r 技术从米曲霉 ( a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ，a s3 4 3 8 2 ) 中扩增得到编码木聚糖酶基因的c d n a 片段。同时， 应用分子生物学软件和国际互联网对基因序列及其推测氨基酸序列进行了分析。为分子生 物学方面的融合表达和定点突变奠定了基础，为木聚糖酶的蛋白质工程提供了理论依据。 本试验分两部分进行，试验结果如下： l 为了确定a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ，a s3 4 3 8 2 木聚糖酶的最佳产酶诱导物，本试验 对培养基中的碳源及碳源浓度进行了研究，结果表明：用浓度为2 的麸皮木聚糖液作为 碳源，能够使菌株很好地生长，并表现良好的产酶能力。 在此基础上，对其产酶条件进行了优化，优化后的工艺条件为：麸皮木聚糖液2 、 酵母膏1 、吐温8 00 5 、磷酸二氢钾2 6 、氯化钙o 5 、硫酸镁l 、硫酸亚铁o 0 1 6 、硫酸锌o 0 0 6 ，p h 值5 0 ，接种量5 ，在2 8 ，摇瓶转速1 5 0r p m 的条件下培养3 天，木聚糖酶活力达217 0 2 5 u m l 。 通过分析比较a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ，a s3 4 3 8 2 的生长曲线和产酶曲线，确定该菌株 的产酶模式为同步合成型。属于该类型的酶其所对应的m r n a 是很不稳定的，所以本试验 选择酶活提高最快时的菌体作为试验材料提取总i a 。 2 根据己发表的米曲霉木聚糖酶x y n g l 基因序列设计一对特异性引物，以米曲霉 ( a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ，a s3 4 3 8 2 ) 总r n a 为模板利用r t - p c r 技术扩增出木聚糖酶 x y n g 3 基因的c d n a 片段，将该片段连接到p m d l 8 t 载体中，经过菌液p c r 鉴定得到 1 0 个阳性克隆，将阳性克隆进行序列测定。经在线比对分析该基因与己报道的g 1 l 族木 聚糖酶基因在核苷酸和氨基酸水平上都有较高的相似性。借助软件分析表明：该c d n a 片 段全长1 0 5 4 b p ，含有一个完整的开放阅读框，起始密码子为a t g ，终止密码子为 姨， 连续编码2 2 1 个氨基酸；计算的理论分子量为：2 3 7 4 5 8 d a ，等电点为：4 7 2 ；疏水性分析、 信号肽分析及跨膜结构分析结果表明：该木聚糖酶为含有信号肽的分泌型酶。对该序列进 t 行同源建模和系统发育树分析，表明该酶属于水解酶类的g 11 家族。将该序列提交n c b i g e n b a n k ，获得的登陆号为e u 5 8 6 1 1 3 。 关键词：木聚糖酶，米曲霉，发酵工艺，e d n a ，序列分析 c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so f t h ec d n ae n c o d i n gx y n g 3f r o m a s p e r g i l l u so r y z a e a b s t r a c t n e x tt oc e l l u l o s e ，h e m i c e u u l o s ei st h es e c o n dr i c h e s ts o u r c ei nn a t u r e x y l a ni sam a j o rc o m p o n e n to f h e m i c e l h l o s ef r a c t i o no ft h ep l a n tc e l lw a l l s d e p e n d i n go nt h es o u r c e s ，i t sb a c k b o n em a yc a l t yv a r i o u s s u b s t i t u e n t sl i k ea r a b i n o s ea n dg l u c u r o n i ca c i d t y p i c a l l y , b a c k b o n ed e p o l y m e r i z a t i o ni sa c c o m p l i s h e db yt h e a c t i o no fe n d o x y l a n a s e sa n d1 3 - x y l o s i d a s e s x y l a n a s ec a nh y d r o l y z e3 - l ，4 - g l y c o s i d i cl i n k a g e so ft h ex y l a n b a c k b o n et op r o d u c es h o r tc h a i nx y l o - o l i g o s a c c h a r i d e sw i t hv a r i o u sl e n g t h ，h e n c ee n d o - 1 3 一x y l a n a s ei st h e c r u c i a le n z y m ec o m p o n e n to fm i c r o b i a lx y l a n o l y t i cs y s t e m s x y l a n a s ei sa ni n d u c i b l eo l z y m e i no r d e rt oi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo fr t - p c r , a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n a s3 4 3 8 2w a sc h o s e na st h em o s ts u i t a b l es p e c i e sw i t ht h ei n i t i a ls c r e e n i n g t h ep r o d u c i n gc o n d i t i o n so f x y l a n a s ew e r eo p t i m i z e d t h es t r a i n sp r o d u c e dm o d e lw a si d e n t i f i e db ya n a l y z i n gt h ec u r v e so fe n z y m e p r o d u c t i o na n dt h eg r o w t ho fc e l l s i nt h i sp a p e r , m a t u r ep e p t i d ee n c o d i n gr e g i o nw i m3 n o n - e n c o d i n gr e g i o n o fe d n ae n c o d i n gx y l a n a s ef r o ma s p e r g i l l u so r y z a ec o h na s3 4 38 2w a sf i r s t l ya m p l i f i e dw i mr t p c r t h i st h e s i sw a sd e s c r i b e di nt h ef o l l o w i n gt w os e c t i o n s 1 i no r d e rt od e c i d et h eb e s ti n d u c t o rf o rx y l a n a s ep r o d u c t i o n ，t h ec a r b o ns o u r c ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no f c a r b o ns o u r c ei nt h ec u l t u r em e d i u mw e r eo p t i m i z e d w h e nw eu s e dw h e a tb r a ne x t r a c t 嬲c a r b o ns o u r c ea n d t h ec o n c e n t r a t i o no f c a r b o ns o u r c ew a s2 ，t h ea c t i v i t yo ft h ex y l a n a s ew a sr e l a t i v e l yh i g h e rt h a nb e f o r e o nt h i sb a s i s ，t or e s e a r c ht h eo p t i m i z a t i o no fx y l a n a s ep r o d u c t i o nc o n d i t i o n s ，t h ec u l t u r em e d i u ma n dt h e c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：w h e a tb r a ne x t r a c t2 ，y e a s te x t r a c t1 ，t w e e n - 8 0o 5 0 ，k h 2 p 0 42 6 ， c a l c i u mc h l o r i d e0 5 ，m a g n e s i u ms u l f a t e1 ，f e r r o u ss u l f a t e0 0 1 6 ，z i n cs u l f a t e0 0 0 6 ，p h5 0 ，i n o c u l u m l e v e lo f5 ，s h a k i n gf l a s k s p e e d 15 0 r p m u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，x y l a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d 2 1 7 0 2 5 u m la f t e rt h r e ed a y sa t2 8 t h eg r o w t hm o d e lo f a s p e r g i l l u so r y z a ec o h na s3 4 3 8 2w a si d e n t i f i e da sp r o d u c i n gs y n c h r o n i z et y p e b yc o m p a r i s o nt h ec u r v eo fg r o w t ha n de n z y m ep r o d u c t i o n m r n at h a tc o r r e s p o n d st ot h i st y p eo fe n z y m ei s v e r yu n s t a b l e ，s ow es e l e c t e dt h eh y p h o s t r o m aw i t ht h ea c t i v i t yi n c r e a s i n ga tt h ef a s t e s ts p e e da st h em a t e r i a l f o re x t r a c t i n gt h et o t a lr n a 2 o n ep a i ro fp r i m e r sw a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da c c o r d i n gt ot h ex y l a n a s ex y n g l g e n es e q u e n c eo f t h ea s p e r g i l l u so r y z a e t h et o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mt h eh y p h o s t r o m ao fa s p e r g i l l u so r y z a ec o h na s 3 4 3 8 2 n ep r o d u c t so f r e v e r s et r a n s c r i p t i o nf r t ) r e a c t i o nw e r eu s e da sp c r t e m p l a t e s t h ee d n ae n c o d i n g x y l a n a s ew a sa m p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t h ee d n ae n c o d i n gx y l a n a s ew a sc o n n e c t e d w i t ht h ev e c t o rp m d18 - t t h er e c o m b i n a n tw a si d e n t i f i e db yp c r , a n dt h e ns e q u e n c e d t h eb l a s tr e s uit s s h o w e dt h eh o m o l o g yo ft h i ss e q u e n c ea n do t h e rr e p o r t e de n d o l ，4 - x y l a n a s eg e n es e q u e n c e so fg ll f a m i l y w a sv e r yh i g h t h i sx y l a n a s eg e n ec o n s i s t i n go f10 5 4b a s ep a i r s ，w a sa ni n t e g r a lo p e nr e a d i n gf j r a m e s t a r t t h c o d o nw 嬲a t ga n dt e r m i n a lc o d o nw a st a a t h i ss e q u e n c ee n c o d e d2 21a m i n oa c i d sc o n t i n u o u s l y t h e m o l e c u l a rw e i g h ti sa p p r o x i m a t e l y2 3 7 4 5 8 d a ，p iv a l u ei s4 7 2 ；t h es e q u e n c ec o n t a i n sas i g n a lp e p f i d ea n da t r a n s m e m b r a n cd o m a i n t h ef i g u r eo ft h e3 ds t r u c t u r eo ft h ex y l a n a s ew a sc o n s t r u c t e db ys w i s s - m o d e t h e p h y l o g e n e t i et r e ea n dt h em o d e li n d i c a t e dt h a tt h ex y l a n a s eb e l o n g st ot h eg llf a m i l yo fh y d r o l a s e t h e n u c l e o t i d es e q u e n c ew a ss u b m i t t e dt ot h en c b ig e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri se u 5 8 6 1 1 3 k e yw o r d s ：x y l a n a s e ，a s p e r g i l l u so r y z a e ，z y m o t e c h n i q u e ，c d n a ，s e q u e n c ea n a l y s i s i v 英文缩略词表 缩写词英文全称中文名称 a m pa m p i c i l i n b p b a s ep a i r ( s ) c b d c d d d h 2 0 d n s d n t p e b e d t a 口t g k d a l b m c s 0 d o r f p c r p h t a e c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n c a t a l y t i cd o m a i n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 3 , 5 - d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d d e o x y r i b o n u c i e o s i d et r i p h o p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d i s o p r o p y l - t h i o - p - - d - g a l a c t o p - - y r a n o s i d e k i l o d a l t o n l u r i a b e r t a n im e d i u m m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf l a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o w e ro fh y d r o g e n t r i sc 1 a c e t a t e e d t ab u 髓r ，r e嘶s e d t ab u f f e r t r i s t r i s h y d r o x y m t h y i - a m i n o m e t h a n e 氨苄青霉素 碱基对 纤维素结合域 催化域 双蒸水 3 ，5 二硝基水杨酸 脱氧三磷酸核糖核苷 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异丙基硫代d d 一半乳糖苷 千道尔顿 l b 培养基 多克隆位点 光密度 开放阅读框 聚合酶链式反应 酸碱值 t a e 缓冲液 t e 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 x g a l5 - b r o m o 一4 一c h l o r o i n d o l y l d g a l a c t o s i d e5 溴一4 氯3 一吲哚p d - 半乳糖苷 独创性：声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：签字同期： 年月 | 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在f i 旧 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 签字同期： 一名： 列 签。；，： _ l 期： 年月h 年月f 二1 吉林农业大学硕士学位论文米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因c d n a 克隆及序列分析 第一章前言 木聚糖( x y l a n ) 是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合 物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生物质资源。它存在 于陆生植物的细胞壁以及植物的几乎所有部位。在造纸制浆过程中，释放出含有大量木 聚糖的工业废料，这些废料被倾倒进河流与湖泊中，沉积下来，造成严重的生态破坏【2 】。 在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸杆、甘蔗渣等中也存在大量的木聚糖，一直没有 得到很好地利用，尤其在我国，这种现象尤为突出。通过酸水解或酶水解可将木聚糖转化 成寡木糖和单糖，酸水解速度快，但伴随有毒化合物产生，对随后的微生物发酵过程也有 影响。而酶水解条件温和，且无毒性副产物产生。因此，发展高效的酶水解法处理半纤维 素废料有着广阔的应用前景【3 】。 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称，作为一种多酶体系广 泛地存在于各种微生物中。在近四十年的研究历程中，科学家们已从不同来源的微生物中 分离到大量的不同类型和功能的木聚糖酶【3 ，4 】，对其酶学性质、催化机制以及分子结构也 有了比较详尽的研究。随着生物技术的不断发展和进步，特别是基因工程技术和蛋白质工 程技术的广泛应用，对木聚糖酶有了更深的了解，己经克隆出多种木聚糖酶基因，并己工 业生产多种木聚糖酶产品p 1 。木聚糖酶在饲料工业、制浆造纸工业、食品工业、能源工业 中都显示出广阔的应用前景，己经引起科学家们的广泛关注。 1 1 木聚糖和木聚糖酶简介 植物细胞壁主要由纤维素( c e l l o s e ) 、半纤维素( h e m i c e l l o s e ) 和木质素( 1 i g n i n ) 等物质组 成。半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，其主要成分是木聚糖 ( x y l a n ) ，约占植物细胞干重的1 5 3 5 。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木 糖基通过糖苷键相连。根据糖苷键的类型可将木聚糖分为两种，d 1 ，4 木聚糖和d 1 ，3 木聚 糖。前者存在于陆生植物的细胞壁中，它的主链由b 1 ，4 糖苷键相连的p d 吡喃木糖残基 聚合而成；而后者存在于海洋藻类的细胞壁中，其主链由p d 吡喃木糖残基通过p 1 ，3 一糖 苷键聚合而成【6 】。自然界中的木聚糖多为异聚多糖，侧链上连着多种不同的短取代基，主 要有o 乙酰基、4 o 甲基d 葡糖醛酸残基、l 阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中 其它几种结构性多糖( 如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等) 以共价或非共价键连接，组成 植物细胞重要的结构一细胞壁【7 1 。也正由于这些侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围 很大，从仅由d 1 ，4 糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。不同植物或 同植物不同的生长阶段，木聚糖的组成成分及其多聚程度都有所不同。硬木木聚糖由 o 乙酰基4 o 甲基葡糖醛酸木糖聚合而成，聚合度为1 5 0 2 0 0 ，且具有高度的乙酰化；软 吉林农业大学硕士学位论文米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因c d n a 克隆及序列分析 木木聚糖是非乙酰化的，由阿拉伯一4 o 甲基葡糖醛酸木糖聚合而成，聚合度为7 0 1 3 0 引。 而同型木聚糖分布很少，仅见于茅草，烟草和某些种子的外壳中。不同植物所含木聚糖的 多少也有差别，一般硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的1 5 3 0 ，软 材中一般占干重的7 1 0 。而在一些一年生植物如小麦、甘蔗、棉子壳中，木聚糖含量 非常高，一般都能高达3 0 以上【。 图1 1 【3 j 是木聚糖的主要结构特征，由图可以看出，木聚糖的主链与纤维素很类似， 只是其单体为d 木糖而非d 葡萄糖。一般在c 2 、c 3 位上易乙酰化，葡糖醛酸残基则以 o 键连在c 2 位上，阿拉伯糖残基多出现于c 2 、c 4 位上。这些侧链的类型及杂合程度 的不同直接影响木聚糖的溶解性、天然构象及与其它结构多糖分子的结合情况，因而也极 大地影响了木聚糖酶的作用方式及效犁8 ，9 1 。 j f i - 4 i - o - t l i o p r 一 _ o i l n k 图1 - l 木聚糖的结构 f 吨1 - 1s t r u c t u r eo fx y l a n 由于木聚糖结构的复杂性，一个木聚糖分子的完全酶解需要一个复杂酶系不同组分之 间的协同作用才能将其降解为基本单糖【9 1 1 1 。其中作用于主链的有三种酶：内切o 一1 ，4 木 聚糖酶( 1 , 4 b d 木聚糖木聚糖水解酶，e c 3 2 1 8 ) ，它在不同位点上优先作用于木聚糖和 长链木寡糖，从p 1 ，4 木聚糖主链的内部切割木糖苷键，水解产物主要为木二糖和木二糖 以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖产生；外切d 1 ，4 木聚糖酶( 1 , 4 p d 木聚糖 木聚糖水解酶，e c 3 2 1 9 2 ) ，作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产物为木糖；d 木糖苷 酶( 1 , 4 p d 木聚糖木聚糖水解酶，e c 3 2 1 3 7 ) ，该酶作用于木寡糖的末端，产物为木糖。 狭义上的木聚糖酶仅限于第一类一内切b 一1 ，4 木聚糖酶【12 1 。另外在海洋微生物中还存在一 种p 1 ，3 木聚糖酶( 1 ，3 d d x y l a n o h y d r o l a s e ，e c 3 2 1 3 2 ) 。由于木聚糖多为异聚多糖，主 链和侧链上均具有多种取代基团，因此将它彻底水解还需要一些特异性酶的作用，主要有： 2 吉林农业大学硕士学位论文米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因e d n a 克隆及序列分析 乙酰酯酶、a l 阿拉伯糖酶、0 【葡糖醛酸酶、d 木糖苷通透酶、酚酸酯酶等i l i 。 木聚糖酶在自然界中分布很广，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和 反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在木聚糖酶。研 究较多的是微生物产生的木聚糖酶，微生物常常产生不止一种类型的木聚糖酶即具有多样 性，而且这些木聚糖酶的特性也存在差异。造成木聚糖酶多样性的原因很多，从遗传学水 平看，通常是由于不同基因表达为几种同工酶形式，或同一基因的不同等位基因引起的【13 】； 从生化水平看，与基因是否转录有相应的m r n a 、m r n a 的剪切，酶分泌后的蛋白酶消 化修饰、翻译后糖基化修饰、亚基的自动聚合、底物结构的复杂性及酶本身来源的广泛性 等有关【l4 j 。根据糖苷键水解酶催化区域的氨基酸序列组成和疏水簇分析，到目前为止己将 水解酶家族分为5 8 个家族，可以将所有水解酶氨基酸序列全部包括在内【l5 1 。所有的木聚 糖酶都属于f 1 0 或g 1 l 族，不同木聚糖酶分子在其氨基酸组成的数目上相差很大，但它 们的催化区在大小上比较一致，同一族中的木聚糖酶催化区域具有较高的同源性，根据已 知酶可以推测未知酶的催化特性。高分子量木聚糖酶( 一般分子量大于3 0 k d a ) 多属于f 1 0 族，对木聚糖的水解速度快，水解产物为低分子量的寡糖( 聚合度1 5 d p ) ，该族还包括 对纤维素和木聚糖都有水解作用的非特异性的葡聚糖酶；低分子量木聚糖酶属于g 1 l 族， 对木聚糖的水解速度慢，水解产物为聚合度5 1 0 d p 左右的木寡糖。 1 2 木聚糖酶的理化性质和底物特异性 木聚糖酶的性质主要来源于对细菌和真菌木聚糖酶的研究。细菌产生的木聚糖酶蛋白 亚基比较单一，相对分子质量范围在8 1 4 5 k d a ，可分为相对分子质量大于3 0 k d a 的耐酸 木聚糖酶和相对分子质量小于3 0 k d a 的耐碱木聚糖酶【1 3 1 。真菌产生的木聚糖酶蛋白亚基 则比较复杂，分子量大小变化也较大，但低分子量木聚糖酶的耐碱性却是共同的。不同来 源的木聚糖酶氨基酸组成相差不大，主要为a l a 、g l u 、g l y 、s e r 和t h r 等；从很多木聚 糖酶的氨基酸组成及其三维结构分析可以看出，g l u 、a s p 、t y r 、t r p 、g l y 、s e r 对其催化 特性及耐碱、耐热性等是非常关键的。一般情况下，木聚糖酶最适温度在4 0 6 0 之间【l 酬， 细菌所产木聚糖酶比真菌所产木聚糖酶热稳定性好。但真菌中也有耐高温的，如 c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a 产生的木聚糖酶能在8 0 下存活l 小时。稳定的p h 值范围是3 1 0 ， 最适p h 值为4 7 ，但p e n i c i l l u mh e r q u e 1 7 】和a s p e r g q l l u sk a w a c h i i i s l 所产木聚糖酶的最适p h 值范围则在2 - 6 的酸性区域。等电点变化范围在3 1 0 之剐1 9 】。金属离子对不同来源的木 聚糖酶的影响各不相同。c u ”、z n 2 + 、f e 2 + 和f e 3 + 对木聚糖酶有一定的抑制作用；而c 0 2 + 和m n 2 + 等对其酶活有一定的激活作用【2 0 , 2 1 】。 许多真核微生物产生的木聚糖酶都含有碳水化合物，即属于糖蛋白。一些原核微生物 如粪堆梭菌( c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u m ) ，链霉菌属( s t r e p t o m y c e ss p ) 和碱性嗜热菌b a c i l l u ss p 等产生的木聚糖酶也被发现属于糖蛋白。糖蛋白是碳水化合物以共价键与蛋白质结合在一 起，或者碳水化合物与蛋白质一起形成能够分离的混合物。糖基化对糖苷键水解酶在极端 气 吉林农业大学硕士学位论文 米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因c d n a 克隆及序列分析 环境中的稳定性起着重要的作用，例如在大肠杆菌中表达碱性嗜热菌b a c i l l u ss p 木聚糖酶 基因，表达产物( 重组酶) 的温度稳定性、与木聚糖的结合能力都比野生型木聚糖酶差，主 要是因为去掉了糖基。参与木聚糖酶糖基化的糖有多种，例如t a l a r o m y c e s b y s s o c h l a m y d o i d e sy h 5 0 产生的木聚糖酶中的碳水化合物残基有甘露糖、葡萄糖和果糖。 广义地讲，木聚糖酶的底物特异性包括对底物的特异性、对糖苷键的特异性和对支链 取代基底物的特异性。通过研究底物特异性和水解产物，可以探明木聚糖酶的作用机制。 研究木聚糖酶的底物特异性和水解动力学除了使用天然复杂的底物外，为了更准确地了解 木聚糖酶的作用机制还普遍使用系列木寡糖和人工合成底物。研究发现两族木聚糖酶的催 化特性明显不同，一般而言，f i o 族木聚糖酶能作用于许多底物，而g l l 族木聚糖酶对 底物则相对专一【2 2 】。 根据底物的特异性，木聚糖酶可分为特异性和非特异性木聚糖酶。特异性木聚糖酶只 对木聚糖作用，而非特异性木聚糖酶具有交叉活性，除作用于木聚糖外，还对其它一些纤 维素材料起作用。木聚糖酶的这种非特异性主要是由于催化区的氨基酸有许多不同的活性 位点。关于木聚糖酶对糖苷键的特异性，一般认为木聚糖酶只作用于d 1 ，4 糖苷键，实际 上少数木聚糖酶也作用于b 1 ，2 或p 1 ，3 糖苷键。木聚糖酶除了裂解主链糖苷键外，根据 其能否释放出支链的阿拉伯糖，可分为脱支酶和非脱支酶。许多真菌如n e u r o s p o r ac r a s s a 和a s p e r g i l l u sn i g e r 等产生的木聚糖酶属于脱支酶，能够从阿拉伯木聚糖中释放出阿拉伯 糖。最近，从a s p e r g i l l u s a w a m o r i 中分离出一种特异高效的脱支酶，对支链表现出高度的 特异性，反而不能降解木聚糖主链。另外还有一些木聚糖酶对主链上含有取代基邻近的糖 苷键表现出很高的亲和性，如a n i g e r 、t v i r i d e 等产生的木聚糖酶只作用于主链上含有取 代基邻近的糖苷键【2 2 之4 1 。 1 3 木聚糖酶的生产与评价 1 3 1 木聚糖酶生产菌种 自然界中有很多微生物能产生木聚糖酶。目前研究得较清楚的有芽胞杆菌b a c i l l u s c i r c u l a n sw l l 2 、b c o a g u l a n s 、丑s p 1 1 1s 、召s p w - 1 ，链霉菌t r e p t o m y c e ss p k t - 2 3 、 s f i v i d a n s t 7 、c r y p t o c o c c u sf a l v u s ，曲霉a s p e r g i l l u ss p 、a n i g e r ，镰刀菌f u s a r i u m a v e n a c e u m ，裂褶菌s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e ，木霉t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ，t k o n i n g i i ，多 孔菌t r a m e t e sh i r s u t a 等【2 5 1 。鉴于丝状真菌产酶的许多优点，例如：产生的木聚糖酶为胞 外酶，便于酶的分离纯化；产木聚糖酶的水平一般比细菌和酵母菌都高，同时可以产生降 解木聚糖支链所需的几种辅助酶等。特别是便于工业化推广应用，因而人们对丝状真菌产 酶研究的较多，尤其是对丝状真菌中的木霉属和曲霉属的研究。根据不同的应用要求需要 选择不同的木聚糖酶生产菌株，用于生产选择性降解木聚糖的木聚糖酶。如纸浆漂白用酶， 要求不含纤维素酶或纤维素酶酶活很低；而低聚木糖生产用酶则要求不含p 木糖苷酶或b 4 吉林农业大学硕士学位论文 米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因c d n a 克隆及序列分析 木糖苷酶酶活很低。由于自然界中的木聚糖总是伴随着纤维素的存在而存在，因而在自然 界中只产木聚糖酶或只产内切木聚糖酶的菌种较少。因此，利用基因工程技术来构建重组 木聚糖酶是获得专一性木聚糖酶的重要途径之一。 1 3 2 木聚糖酶的诱导和抑制机理嘲1 木聚糖是一种大分子聚合物，不能穿过细胞壁，直接进入微生物细胞内。在液体发酵 过程中，伴随着微生物细胞的生长，首先分泌少量的组成型木聚糖酶，把木聚糖降解成低 聚木糖、木二糖和木糖，这些糖通过细胞膜透过酶进入细胞内，诱导其它木聚糖酶基因开 始合成并分泌一些木聚糖酶到细胞外。这些木聚糖酶有木聚糖酶、木糖苷酶、转糖苷酶， 除继续降解木聚糖外，还进一步降解低聚木糖成木二糖。p 一木糖苷酶把木糖转成木二糖或 经转糖苷酶转移到二聚糖中的合成位置异构物上。这些二糖由细胞膜中的转移酶进入细胞 内，诱导木聚糖酶基因，分泌第二阶段的木聚糖酶。 由细菌和真菌产生的木聚糖酶通常是诱导型的，但也有少部分木聚糖酶是组成型的。 一般来讲，木聚糖酶的诱导机制是很复杂的，其诱导水平也因微生物的不同而相差较大， 对于某一种微生物可以产生最大木聚糖酶活性的诱导物可能是另外一种微生物产木聚糖 酶的抑制剂【2 7 ，28 1 。 底物的衍生物和酶反应终产物在木聚糖酶的诱导中起到重要的正向作用，它们在浓度 较高时也可能成为产酶的抑制剂。 1 3 3 产酶影响因素 丝状真菌由于能分泌胞外木聚糖酶而且产酶水平高于酵母和细菌而格外引起研究人 员的关注，但是丝状真菌木聚糖酶的产生往往是和纤维素酶的产生相联系的。以木聚糖为 碳源从而有选择性地生产木聚糖酶在a s p e r g i l l u ss p p 和t r i c h o d e r m as p p 中己经获得了成 功，而在以纤维素为碳源时，这些菌株会在产生木聚糖酶的同时也产生纤维素酶。将有些 真菌培养在不含纤维素的木聚糖上，并且控制培养基中较低的n c 比，是产生无纤维素酶 活性的木聚糖酶的策略之一。对于有些微生物，如n e u r o s p o r ac r a s s a 和t h e r m o m o n o s p o r a c u r v a t a ，要获得最大的木聚糖酶活性，培养基中纤维素类物质是不可缺少的。对于廉价的 半纤维素类底物，如麸皮、米糠、稻草、麦草、玉米秸秆、甘蔗渣等，使用a s p e r g i l l u ss p p 、 b a c i l l u ss p n c i m 5 9 ，p e n i c i l l i u mp u r p u r o g e n u m ，t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s ，t r i c h o d e r m a h a m a t u m 、t r i c h o d e r m ar e e s e i 来生产木聚糖酶是非常合适的【2 9 3 6 1 。 影响木聚糖酶活性和产率的其它参数还包括氮源、培养温度、培养基起始p h 、培养 时间、接种量、通风和搅拌程度等【3 7 4 5 1 。 7 影响木聚糖酶产率的因素除通常的发酵条件外还有一些关键的因素，各种因素对木聚 糖酶的表达有综合效应，它们包括底物的可接近性，低聚木糖的释放速率、数量和化学特 性，所能产生的木糖数量。木糖既起到碳源作用又对木聚糖酶的形成产生抑制作用。通常 5 吉林农业大学硕士学位论文米曲霉木聚糖酶x y n g 3 基因c d n a 克隆及序列分析 诱导物分子的缓慢释放可以提高木聚糖酶的活性。发酵过程中一部分木聚糖酶会结合在不 溶性底物上而被丢失。木聚糖酶生产菌种产生的代谢性酶，如蛋白酶和转糖苷酶，也会影 响到木聚糖酶的产量，这些代谢酶通常在对数生长末期得到最佳的表达。 1 3 4 木聚糖酶的评价 由于木聚糖结构与组成的复杂性，木聚糖降解酶制剂实际上是参与木聚糖酶解过程中 诸多酶系的混合物。木聚糖酶制剂的活性并不单指木聚糖酶或b 木糖苷酶的活性，而是所 有参与水解木聚糖上特定糖苷链的酶的共同效应的总和。分别用燕麦木聚糖、山毛榉木聚 糖、玉米木聚糖来评价酶的活性，结果在一种底物上酶a 的活性比酶b 高，而在另一种 底物上酶b 的活性却可能比酶a 高，高低相差可达3 4 倍。木聚糖酶的活性只能是指在特 定木聚糖上的相对活性，因为不同来源的木聚糖结构与组成不一样，不同来源的木聚糖酶 中各酶系的活力也不相同 4 6 , 4 7 1 。 木聚糖酶酶活的测定方法通常有d n s 法、s o m o g y i n e l s o n 法、浊度法和 r b b x y l a n ( r e m a z o lb r i l l i a n tb l u er d x y l a n ) 法【4 8 。5 1 】。前两种方法是测定酶反应后所释放 出的还原糖量，以d n s 法应用较广泛，s o m o g y i - n e l s o n 法测定值较d n s 法低，且试剂有 一定的毒性。缺点是氧化剂与还原剂的存在容易得出假性结果，另外酶解产物中聚合度不 同的低聚木糖比例不一，也会造成测定误差。由于不同聚合度的木聚糖的溶解性随环境条 件的变化而发生很大变化，因而根据酶解液的透光度来比较酶活性的浊度法的缺点也是显 而易见的。r b b x y l a n 法基于从r b b x y l a n 中释放出的染色碎片来测定酶活力，准确性高， 还可用于产木聚糖酶微生物的筛选，可通过直接观测筛选平板上微生物周围是否出现透明 圈来判断，但r b b x y l a n 的价格较昂贵 5 2 , 5 3 1 。 s u n g t a i kl e e & j a y jl e e ”】报道了木聚糖气巴蓝( c i b a c r o nb l u e ) 染色法：用交联剂将 水溶性染料气巴蓝与木聚糖交联，原来可溶的木聚糖变成了不溶物。气巴蓝木聚糖是一 种蓝色粉末，p h 4 2 9 6 稳定，可高温灭菌。木聚糖酶作用于染料含量已知的气巴蓝木聚 糖后释放出可溶性染色片段，溶液显蓝色。测定上清液的吸光度，即可方便得出被水解的 木聚糖量。气巴蓝染色法无须其它染色法中的乙醇沉淀步骤，是目前最快捷、准确的木聚 糖酶活性检测方法。气巴蓝木聚糖亦可用于木聚糖酶高产菌株的筛选，在含有气巴蓝木 聚糖的琼脂平板上，产酶菌落周围可见染料扩散，蓝色的深浅与酶的活性有关。此法比传 统的刚果红染色法更为简捷、准确，是替代传统刚果红染色法的新方法。 1 4 木聚糖酶的催化机制 木聚糖酶的水解反应是典型的酸碱和亲核水解反应，根据产物异头物构象的不同，木 聚糖酶降解木聚糖的催化反应可分为两大类，即保持异头构型的两步置换反应( 图1 2 a ) 和形成倒位异头构型的一步置换反应( 图1 2 b ) 。 ( 1 ) 保持异头构型的两步置换反应。木聚糖酶的两步置换反应作用方式与溶菌酶反应 6 吉林农业大学硕士学位论文米曲霉木聚搪酶x y n g 3 基因e d n a 克隆及序列分析 机制相似，催化反应第一步是活性位点的g l u 羧基提供一个质子给