（光学专业论文）紫外线诱导的细胞dna损伤模式研究.pdf

摘要d n a 是储存与传递遗传信息的重要生物大分子，其分子的完整性对生物体生命活动至关重要。过量的紫外辐射可引起细胞内d n a 碱基发生突变、d n a 断裂、d n a d n a交联、d n a 蛋白交联以及染色体畸变等损伤。d n a 损伤若不能及时修复，细胞将发生癌变或死亡。不同剂量紫外线对细胞d n a 的损伤模式不同，可能引起的修复机制有差别。因此，研究不同剂量紫外线诱导细胞d n a 损伤模式的变化对于进一步探讨d n a损伤修复机制，预防某些修复缺陷性疾病的发生有一定的现实意义，并对遗传学、肿瘤学、衰老学和毒理学等研究具有一定的理论价值。本文采用彗星电泳法检测紫外线对细胞d n a 损伤的效应以及不同种类细胞的敏感性差异；应用彗星电泳、d c f h d a 荧光探针检测法以及n a c 抗氧化剂等方法检测了低剂量紫外线对细胞d n a 的损伤；采用流式细胞仪、m t t 、细胞计数等方法检测了中等剂量u v c 对细胞d n a 的损伤；应用原子力显微镜和彗星电泳方法检测了高剂量紫外线对细胞d n a 的损伤。主要内容：1 、检测相同剂量不同功率紫外线诱导的细胞d n a 损伤。彗星电泳和h e 染色的实验结果表明：离体培养的k 5 6 2 细胞和原代培养的小鼠肝细胞经不同功率相同剂量的u v c 或u v b 照射后，d n a 损伤程度无差异。2 、检测不同波长u v 照射白血病k 5 6 2 细胞d n a 的损伤。彗星电泳的检测结果显示：照射剂量叫4 0j m 2 的u v a 不会对k 5 6 2 细胞d n a 造成即时性损伤；u v b 、u v c 可以造成k 5 6 2 细胞d n a 的损伤，并在一定范围内呈现照射剂量依赖效应。u v b 在2 0 -3 2 0j m 2 照射剂量下与细胞d n a 损伤的相关性为0 9 3 4 4 和0 9 5 6 ；u v c 在3 2 - - 1 8 0j m 2照射剂量下与细胞d n a 损伤的相关性为0 9 8 4 1 和0 9 9 4 ：相同照射剂量下u v c 对细胞d n a 的损伤程度显著高于u v l 3 。3 、检测了不同细胞对u v c 的敏感性。不同肿瘤细胞应答u v c 损伤的敏感性存在差异：s m m c 7 7 2 1 细胞的敏感性高于h e p g 2 细胞。正常细胞与肿瘤细胞应答u v c 损伤的敏感性也存在差异：h e p a l - 6 细胞的敏感性高于原代培养的小鼠肝细胞。不同活化程度的正常细胞对u v c 损伤的敏感性不同：活化淋巴细胞比静息淋巴细胞敏感性高。4 、检测了不同周期时相的k 5 6 2 细胞对于u v c 的敏感性：彗星检测发现g 2 期的细胞最为敏感，其次为m 期、s 期和g l 期。5 、k 5 6 2 细胞和原代培养的小鼠肝细胞在低剂量u v b 和u v c 照射后经孵育，彗星电泳能够检测出即时检测不能发现的细胞d n a 损伤。低剂量u v 照射后，胞i 为r o s 含量升高，并在细胞孵育后含量降低。实验组中加入r o s 清除剂n a c 后可以降低细胞d n a 的损伤。这提示低剂量u v 照射造成的延时损伤可能以r o s 引发的损伤修复有关。6 、k 5 6 2 细胞经中等剂量( 6 0j m 2 ) u v c 照射后的d n a 损伤在2 0 h 内修复或消失。u v c 致细胞d n a 损伤具有延时效应。u v c 照射细胞后，随孵育时间的延长细胞d n a损伤程度加剧，2 小时后d n a 损伤达到最大值，孵育4 小肘后d n a 损伤程度开始下降，孵育至2 0 小时损伤程度恢复至未照射细胞的水平。细胞计数的结果表明，照射后1 2 h细胞数目降至最低，而后细胞数目开始增加。u v c 照射使k 5 6 2 细胞周期被阻滞于g 1 s期或g 2 m 期。7 、优化了用于原子力显微镜观察的细胞d n a 提取系统。建立了用原子力显微镜观察d n a 的阳性模型。8 、k 5 6 2 细胞经高剂量u v 照射后的d n a 损伤严重。高剂量u v c 照射后，k 5 6 2细胞d n a 损伤严重，发生断裂、交联( d n a 链间或链内) ，k 5 6 2 细胞增殖能力减弱。高剂量u v b 照射后，d n a 小片段交联在一起。结论：相同剂量不同功率的u v c 或u v b 照射后，d n a 损伤程度无差异。u v 造成的细胞d n a 损伤与照射波段、剂量密切相关。u v c 对细胞d n a 的损伤能力大于u v b 。u v b 、u v c 造成的k 5 6 2 细胞d n a 的损伤在一定范围内呈现照射剂量依赖效应。我们得n u v b 、u v c 在一定剂量范围与d n a 损伤之间的线性方程。u b v ：y = 0 1 1 9 6 x 一0 0 5 3 4 ，r 2 = 0 9 3 4 4或y = 0 0 814 x 0 0 6 2 7 ，r 2 = 0 9 5 6 。u v c ：y = 0 2 018 x + 0 9 0 5 3 ，r 2 = o 9 8 41 或y = 0 12 51x + 0 6 914 ，r 2 = 0 9 9 4 。不同细胞应答u v c 损伤的敏感性存在差异，这可能与细胞的增殖速度不同有关；周期时相的细胞对u v c 的敏感性不同进一步证明了这一点。不同剂量紫外线诱导的细胞d n a 损伤有不同的模式。实验发现低剂量u v b 与u v c照射k 5 6 2 细胞和原代培养的小鼠肝细胞后经孵育，彗星电泳能够检测出即时检测不能发现的细胞d n a 损伤并且细胞内r o s 含量升高，进一步实验加入r o s 清除剂n a c 后可以降低细胞d n a 的损伤，表明延时检测到的d n a 损伤与r o s 有一定关系。中等剂量u v c 对nk 5 6 2 细胞d n a 的损伤具有延时效应并且在2 0 d 时内可以恢复。此剂量下的u v c 照射后细胞周期被阻滞在g 1 s 期或g 2 m 期。应用原子力显微镜直接观测到高剂量u v c 照射细胞后，k 5 6 2 细胞d n a 损伤严重，发生断裂、交联。与u v b 相比，u v c 照射后细胞d n a链的直径变细，d n a 链的交联可能多为链间交联。关键词：紫外线，彗星电泳，原子力显微镜，d n a 损伤a b s t r a c td n ai sa ni m p o r t a n tb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e t h ei n t e g r i t yo fd n ai se s s e n t i a lf o rc e l lo ro r g a n i s m e x c e s s i v eu l t r a v i o l e tr a d i a t i o nc a nc a u s ed a m a g ei nd n a ，s u c ha sb a s ep a i r sm i s s ，d n ab r e a k a g e ，d n a - d n ac r o s s l i n k i n g ，d n a - p r o t e i nc r o s s l i n k i n g ，a n dc h r o m o s o m a la b e r r a t i o n s i fd n ad a m a g ec a nn o tb et i m e l yr e p a i r e d ，c e l lc a n c e ro rd e a t hw o u l do c c u lu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n v ) “md i f f e r e n te n e r g yl e a dt od i f f e r e n td n ad a m a g em o d e l ，t h er e p a i rm e c h a n i s m sa l s om a yb en o tt h es a m e t h e r e f o r e ，w es t u d yt h ed n ad a m a g em o d e li n d u c e db yd i f f e r e n te n e r g yu v i th a sac e r t a i np r a c t i c a ls i g n i f i c a n c ef o re x p l o r i n gd n ad a m a g er e p a i rm e c h a n i s m sa n dp r e v e n t i n gs o m er e p a i rd e f e c t i v ed i s e a s e s t h ee f f e c t so fd n ad a m a g ei n d u c e db yd i f f e r e n tw a v e sa n dd o s e so fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n( u v ) i nd i f f e r e n tc e l l sw e r et e s t e db yc o m e ta s s a y t h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nw a sd e t e c t e db yt h ef l o wc y t o m e t e r ( f c m ) t h ee f f e c t so fi n t e r m e d i a t ed o s eu v co nk 5 6 2c e l lw a si n v e s t i g a t e db ym t tt e s t ，c e l lc o u n ta n dc o m e ta s s a y t h ee f f e c t so fl o wd o s eu v co nk 5 6 2c e l lw a si n v e s t i g a t e db yd c f h d at e s ta n dc o m e ta s s a y t h ee f f e c t so fh i g hd o s eu v co nk 5 6 2c e l lw a si n v e s t i g a t e db yc o m e ta s s a ya n da t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) r e s u l t s ：1 t h ep r i m a r yc u l t u r e dm o u s eh e p a t o c y t ea n dh u m a nl e u k e m i ak 5 6 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e db yu v bo ru v cw i t l lt h es a m ed o s eb u td i f f e r e n tp o w e r t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ed a m a g eo fd n ah a dn od i f f e r e n c e 2 t h eh u m a nl e u k e m i ak 5 6 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e db yu v a ，u v ba n du v c t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tu v ac o u l d n ti n d u c ed n ad a m a g ei m m e d i a t e l y , w h i l eu v ba n du v cc o u l di n d u c ec e l l u l a rd n ad a m a g ei nad o s em a n n e r , a n du v cc o u l dl n d u c ed n ad a m a g em o s ts e r i o u s l y t h er e l a t i v i t yo fu v b ( 2 0 - 3 2 0 j m 2 ) b e t w e e nd n ad a m a g ei s0 9 3 4 4 0 9 5 6 t h er e l a t i v i t yo f u v c ( 3 2 - 1 8 0 j m 2 ) b e t w e e nd n ad a m a g ei so 9 8 4 i 0 9 9 4 3 t h es e n s i t i v i t i e so fd i f f e r e n tc e l l st ou vw e r ed i f f e r e n t t h el o w e s td o s eo fu v ci n d u c e dt h eh u m a nh e p a t o m as m m c - 7 7 21c e l l u l a rd n ad a m a g ew a s10 4 j m 2 ，b u tt h ed o s eo fu v cc o u l di n d u c ed n ad a m a g eo fh - h e p a t o m ah e p g 2c e l lw a sa b o v e16 8 j m 2 t h el o w e s td o s eo fu v ci n d u c e dm o u s eh e p a t o m ah e p a l 一6c e l l u l a rd n ad a m a g ew a s1 6 j m 2 ，b u tf o rt h ep r i m a r yc u l t u r e dm o u s eh e p a t o c y t ew a sa c h i e v e dt o2 4j m 2 t h ea c t i v a t e dh u m a nl y m p h o c y t ew a sm o r es e n s i t i v et h a nt h er e s t i n gh u m a nl y m p h o c y t et ou v c i v4 w h e ns y n c h r o n i z e dk 5 6 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e db y6 0 j m zu v c ，t h ec e l l so fg 2 mp h a s es h o w e dt h a ti tw a sm o r es e n s i t i v et h a no t h e r s 5 k 5 6 2a n dt h em o u s eh e p a t o c y t ec e l l sw e r ei r r a d i a t e db yl o wd o s eu v c ，t h ed n ad a m a g ew a sd e t e c t e db yc o m e ta s s a ya f t e ri n c u b a t e d2 hb u tn o ti m m e d i a t e l y i r r a d i a t e dw i t hl o wd o s eu v bo ru v c ，t h ei n t r a c e l l u l a rr o sc o n t e n ti n c r e a s e d ，a n dd e c r e a s e da f t e rt h ec e l l sw e r ei n c u b a t e d t h ed n ad a m a g eo fe x p e r i m e n t a lg r o u pc e i lc a i lb er e d u c e db ya d d i n gn a c 6 a f t e ri r r a d i a t e db yi n t e r m e d i a t ed o s e ( 6 0j m z ) u v c ，t h ed n ad a m a g eo fk 5 6 2c e l l sr e p r e s e n t e dd e l a y e de f f e c t ，a n di tc a nb er e p a i r e dd u r i n g2 0 h c e l lc o u n ta n dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o ns h o w e dt h a tt h en u m b e ro fk 5 6 2c e l l sd e c l i n e dl e a s t a f t e ri n c u b a t e d1 2 h ，a n ds o m ec e l l sd a m a g e ds e v e r e l y t h er e s u l t so fc o m e ta s s a ys h o w e dt h a tt h eh i g h e s td a m a g ew a sa p p e a r e da f t e ri n c u b a t e d2 - 4 h t h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nw a sa l s oc h a n g e da f t e ri r r a d i a t e d c e l l sw e r ea r r e s t e di ng 1 so rg 2 m 7 a f t e ri r r a d i a t e db yh i g hd o s eu v co ru v b ，t h ed n ad a m a g em o d e lo fd n ab r e a k a g ea n dd n ac r o s s - l i n k i n gw a sh i g h l ya p p e a r e di nk 5 6 2c e l l s c o n c l u s i o n s ：t h ec o m e ta s s a yr e s u l t ss h o w e dt h a tu v ac o u l d n ti n d u c ed n ad a m a g ei m m e d i a t e l y , w h i l eu v ba n du v cc o u l di n d u c ec e l l u l a rd n ad a m a g ei nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r , a n du v cc o u l di n d u c ed n ad a m a g em o s ts e r i o u s l y t h el i n e a re q u a t i o no fd n ad a m a g ea n du v b ：y - 0 1 1 9 6 x - 0 0 5 3 4 ，r z = 0 9 3 4 4o ry = 0 0 8 1 4 x - 0 0 6 2 7 ，r z = o 9 5 6 t h el i n e a re q u a t i o no fd n ad a m a g ea n du v c ：y = 0 2 0 1 8 x + 0 9 0 5 3 ，r 2 = 0 9 8 4 1 或y = 0 1 2 5 1 x + 0 6 9 1 4 ，r 2 = 0 9 9 4 t h es e n s i t i v i t i e st ou vw e r ed i f f e r e n ti nd i f f e r e n tc e l l s t h ec a n c e rc e l l sw e r em o r es e n s i t i v et ou va n dt h es e n s i t i v i t yo fc e l l st ou vw a sr e l a t e dt oi t sp r o l i f e r a t i o ns p e e d w h e ni r r a d i a t e db yl o w e rd o s eu v c ，d n ad a m a g eo fk 5 6 2c e l lj u s ta p p e a r e di nad e l a y e dm a n n e r ,b u tn o ti m m e d i a t e l y t h ed e l a yw a sr e l a t e dt or o s w h e ni r r a d i a t e di n t e r m e d i a t e l yb yu v c( 6 0j m z ) ，d a m a g eo ft h ec e l lr e p r e s e n t e dd e l a y e de f f e c t ，a n di tc a l lb er e p a i r e dd u r i n g2 0 h t h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nw a sa l s oc h a n g e da f t e ri r r a d i a t i n g ；c e l l sw e r ea r r e s t e di ng 1 so rg 2 m a f t e ri r r a d i a t e db yh i g hd o s eu v co ru v b ，t h ed n ad a m a g em o d eo fd n ab r e a k a g ea n dd n ac r o s s - l i n k i n gw a sh i g h l ya p p e a r e di nk 5 6 2c e l l s 。k e y w o r d s ：u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ( u v ) ，c o m e ta s s a y ，a f m ，d n ad a m a g ev西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：丝型指导教师签名：乞丝丝堕曼lv - o 芦年月于日b 书6 月仃日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：扬砷3o - o7 年4 月厅日西北人学博十学位论文第一章引言d n a 作为传递遗传信息的一类重要的生物大分子，由鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、戊糖和磷酸组成，它独具的双螺旋结构具有良好的稳定性，能够保证遗传物质通过碱基互补配对精确地传递遗传信息。因此保证d n a 分子的完整性对生物体生命活动至关重要。但是生物体和自然界各种物理、化学因子如射线或化学药物均可以引起细胞内d n a的损伤，并且不同因素引起的d n a 损伤类型不同。例如过量的紫外线辐射可引起高等动植物细胞内碱基发生c 至r j t 的突变以及c c 到t t 的突变、引起细胞d n a 断裂和d n a 蛋白交联以及染色体畸变；影响并抑制皮肤免疫功能，使突变细胞容易逃脱机体的免疫监视，从而易于导致皮肤鳞癌和基底细胞癌的发生【1 3 】。生物体应对不同类型d n a 损伤的方法是d n a 修复( d n a r e p a i r i n g ) 能力。d n a 修复是细胞对d n a 受损伤后的一种反应，这种反应能使损伤的d n a 分子得到修复，从而避免遗传信息改变【4 】，细胞发生癌变或者细胞死亡、凋亡等异常现象的发生。因此，细胞是否具有d n a 损伤的修复能力，以及细胞修复能力是否有缺陷，是保持生物体基因组的稳定性以及生物进化过程中遗传稳定性的关键因素。1 1d n a 的损伤造成d n a 损伤的原因多种多样，其中主要包括自发性损伤和诱发发性损伤两个方面。1 1 1 诱发性的损伤使细胞d n a 发生诱发性损伤的主要因素包括生物、化学、物理三个方面。生物因素：d n a 与r n a 病毒可以插入宿主细胞的基因组d n a 中而引起细胞突变甚至癌变。化学因素：许多化学物质对d n a 都有损伤，比如环磷酸胺、苯丁酸氮、芥子气、氮芥等烷化剂，这类亲电子的化合物分子上的许多活性基团( 甲基、乙基、氯乙基等) 能和d n a 形成多种加合物，造成d n a 烷化损伤，引起碱基错配、链交联和链断裂等多种类型的损伤；而亚硝酸盐类物质( 如，亚硝胺) 也可使胞嘧啶、腺嘌呤改变或鸟嘌呤脱氨等变化，造成碱基错配，引起d n a 的损伤。第一章引言物理因素：主要有电离辐射、紫外线与其他辐射因子。a 、b 射线和x 射线可引起磷酸二酯键的断裂或脱氧核糖与碱基的共价键断裂，造成碱基脱落或d n a 链的断裂等损伤。紫外辐射是电磁波谱中介于电离辐射和可见光辐射之间的部分，其波长介乎1 0 0 4 0 0 n m 之间。物理学上一般将紫外线分为真空紫外区( 1 3 ，在此条件下，d n a 双链之间的氢键能被打开而解螺旋且变性为单链，d n a 链上的碱性不稳定点( 邺) 能够迅速断裂【4 】。因此，p h 1 3 的碱性彗星电泳除了能够像中性电泳一样检测到双链d n a 断裂，还可以检测到d n a 单链断裂、碱性不稳定点、与切除修复相关的d n a 断裂、d n a d n a交联和d n a 蛋白质交联等。细胞d n a 受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多。在一定范围内，“彗星”尾部的长度( 即d n a 断片的迁移距离) 和“彗星”尾部的荧光强度( 代表d n a 的含量) 与d n a 的损伤程度相关。因此，通过测定彗星尾部的荧光强度以及d n a 的迁移距离即可定量测定单个细胞d n a 的损伤程度。单细胞凝胶电泳方法适用于各类细胞，无需放射性标记，样品用量少，检测时间短，能够灵敏快速高效安全地检测d n a 损伤【5 1 。该方法的最大优点是可进行单细胞的原位检测，研究细胞群体内不同细胞的反应多相性( h e t e r o g e n e i t y ) 。目前这一方法己被广泛应用于放射生物学、遗传毒理学【6 1 、分子流行病掣7 ，8 1 、环境生物监测【9 1 等多种领域的研究，并成为药物筛选的技术手段之一【1 0 , 1 1 j ，应用于细胞衰老、凋亡机制的研究等诸多领域【1 2 1 。1 8两北人学博士学位论文经本实验室改良后的单细胞凝胶电泳的实验流程由如下步骤构成【1 3 j ：将载片放入0 2 常熔点琼脂糖( 6 0 ) 溶液中镀膜。j收集细胞，计数，用p b s 调密度至4 x1 0 5 c e l l s m ll将细胞悬液和低熔点琼脂糖( 3 7 。c ) 溶液按1 ：1 混匀，立即取8 陬l 灌胶。4 c ，2 0m i n 。l裂解液裂解，4 ，1hl水洗，4 ，三次，5m i n 次1解旋，4 ，2 0m i n ( 溶液为电泳液)l电泳，4 ，2 0m i n ( 电场强度为0 8v c m )i中和液中和，4 ，三次，5m i n 次i梯度酒精脱水( 8 0 、9 0 、1 0 0 ，5m i n 梯度酒精)；每张载片上加1 5 弘l 溴化乙啶于室温下染色1 5m i n ，荧光显微镜下观察( 采用g 激发模块：激发波长5 1 0 - 5 6 0n m ，发射波长5 9 0n m ) )l数码相机采集荧光图像l彗星电泳分析软件( c a s p 软件) 分析，并对数据进行统计学处理和t 检验。c a s p ( c o m e ta s s a ys o f t w a r ep r o g r a m ) 【1 4 l 为单细胞凝胶电泳图像的分析软件，该软件可以自动计算彗星图像的相关参数【1 5 j 。目前，用来分析d n a 损伤的彗星图像参数主要有：彗星长度、彗星头部面积、彗星头部平均荧光亮度、彗星头部d n a 含量( ) 、彗星尾部长度、彗星尾部重心、彗星尾部d n a 含量( ) 、彗星尾部面积、彗星尾部距离、彗星尾矩、o l i v e 尾矩、彗星尾部惯量等。这些彗星电泳常用的参数中，彗星长度( c l ：1 9第- 二章实验方法、实硷材料与实验装置c o m e tl e n g t h ，即整个彗星图像在彗尾方向上的最大长度) 和尾长( t l ：t a i ll e n g t h ，即彗星尾部在彗尾方向投影的长度) 的灵敏度比较高，但是c l 和t l 的计算中没有涉及到d n a 含量的变化，因此，c l 和t l 不能充分反应d n a 在高剂量损伤时的状态。而尾矩( t m ，t a i lm o m e n t 即彗星尾长与彗星尾部d n a 含量( ) 的乘积) 和o l i v 尾矩( o t m ：o l i v et a i lm o m e n t ，即彗星尾部d n a 含量( ) 与尾部距离的乘积) 这两个参数不但反映彗星尾长的变化还反映了d n a 含量( ) 的变化，更能够更准确地反映高剂量损伤时细胞d n a 的状态。2 2 原子力显微镜观察d n a 损伤1 9 8 6 年b i n n i g 通过改进扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e ，s t m )研制出第一台原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 。1 9 8 8 年，激光检测的原子力显微镜( l a s e r - a f m ) 研制出【1 6 l ，并很快达到了原子级的分辨能力f 1 7 1 ，成为目前使用最为广泛的原子力显微镜。该类原子力显微镜利用激光发生器将激光照射在微悬臂的末端，当悬臂发生形变时，反射光的位置就会随着悬臂的改变而形成偏移量，激光检测器会记录这一偏移量，同时将信号传输给反馈系统，使系统做适当的调整，最后将样品的表面特性以影像的方式呈现出来。根据a f m 观察时针尖与样品的接触情况，a f m 有三种扫描模式：接触模式( c o n t a c tm o d e ) 、非接触模式( u nc o n t a c tm o d e ) 和轻敲模式( t a p p i n gm o d e ) i s l 。a f m 自问世以来，在生物大分子表面结构和功能的研究中得到了很大的应用，特别是在d n a 的结构和功能研究中【1 9 2 4 1 。应用原子力显微镜在室温和干燥空气条件下可得到质粒d n a 的图像，所获得的d n a 图像重复性好并且分辨率可达纳米水平，能够清晰地观测到三维环状d n a 分子结构，并可估算分子的宽度和高度【2 5 1 。目前，使用a f m可在多种条件下获得单链、双链、三链的d n a 分子图像 2 6 - 2 9 1 ，例如p e t e r i 3 0 1 等人就利用a f m 清晰地观察到了体外生理状态下d n a 分子的三维结构。与透射电子显微镜相比，a f m 要求的样品制备非常简单，且有良好的( 纳米级)分辨能力，因此在d n a 结构与功能的研究应用日益广泛。2 3 流式细胞仪检测细胞周期流式细胞分选仪是一种快速测定和分析流体中细胞或颗粒物各种参数的实验仪器，尤其在细胞周期的研究中应用广泛【3 1 。3 1 ，它可以通过对d n a 含量的测定，测定细胞所西北大学博七学位论文处于的周期时相。流式细胞仪检测样品的制备程序如下：收集细胞，p b s 洗两次( 离心条件1 0 0 0 r p m ，3 r a i n )l加入预冷后的p b s + 无水乙醇的混合液( 两者比例为2 ：1 ) 固定细胞，4 。c 保存l测试前离心弃上清，p b s 洗两次( 离心条件1 0 0 0 r p m ，5 m i n ) ，调整细胞密度为5 x 1 0 5 1 x 1 0 6 m lld n a 荧光染料( c o u l t e r 公司d n a 染色试剂盒) 染色，室温避光染色1 5 m i nl用流式细胞仪检测。2 4 细胞周期同步化细胞同步化是指自然或经人为选择诱导造成的细胞增殖周期的同步化。前者称为自然同步化，后者称为人工同步化。人工同步化是利用药物或其他方法使细胞停止在细胞周期的某一时相，包括选择同步化和诱导同步化。细胞同步化是研究特定细胞周期转变、细胞动力学、细胞周期调控以及细胞在不同时相对刺激因子敏感性等方面的常用方法 3 4 - 3 7 1 。目前应用较为广泛的诱导同步化的方法主要有d n a 合成阻断法、分裂中期阻断法等【3 8 1 。本实验采用t d r 三标阻断d n a 合成的方法【3 9 】，将k 5 6 2 细胞阻滞于g 1 s 期，再结合n o c o d a z o l e 中期阻断的方法，分时段取样，即可以得到各时相的细胞。方法如下：取对数生长的k 5 6 2 细胞，加入过量的t d r 标记，培养4hl离心洗脱t d r ，培养8h1加入t d r 阻断，培养4h 后离心洗脱，培养8hl加入t d r ，培养4hl2 1第_ 二章实验方法、实硷材料上j 实验装置离心洗脱t d r 后用新鲜培养液重悬并加入n o c o d a z o l e 继续培养1分别在不同时段取样，即可获得处于g l 、s 、g 2 、m 等不同周期时相的k 5 6 2 细胞。2 5 细胞计数本实验采用台盼蓝拒染法进行细胞计数，其原理是：台盼蓝不能进入细胞膜完整的活细胞细，而死细胞或膜破损的细胞由于膜透性改变，台盼蓝可进入细胞，将细胞染为蓝色。在显微镜下计数未染色的细胞，可计算出细胞数量。2 6r o s 检测d c f h d a 荧光探针标记法检测胞内r o s 含量。d c f h 2 d a ( 2 ，7 ，二氯荧光素二乙酰盐，d i c h l o r o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ) 可被细胞内的r o s 氧化为发光的d c f ( 二氯荧光素) ，激发波长为4 8 8 n m ，发射波长为5 3 0 - 5 6 0a m ，因此d c f 的强度可代表细胞内r o s 的产量。d c f h 2 d a 与d c f h d a ( 二氢二氯荧光素二酯) 可透过细胞膜进入细胞，被胞内的酯酶水解为不发荧光的二氢二氯氢化荧光素( d c f h ) ，在r o s 存在时，二氢二氯氢化荧光素可以被氧化为强荧光物质二氯荧光素( d c f ) ，荧光强度与r o s 产量成正比。2 7m t t 检测m t i ( 噻唑蓝，化学名3 ( 4 ，5 二甲基噻唑2 ) 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐) 法即四唑盐比色法，于1 9 8 3 年由m o s m a n nt 创立【删。其基本原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性黄绿色的m t t 还原为难溶性的蓝紫色甲媵结晶( m t i f o r m a z a n ) ，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜( d m s o ) 能溶解细胞中的f o r m a z a n ，并且f o r m a z a n 的量在一定范围内与活细胞数呈正比，通过酶联免疫检测仪检测5 7 0n l n 处其吸光度值( o d 值) ，间接反映活细胞数量。m t i 法具有灵敏度高，重复性好，经济快速，易自动化等特点，并且与台盼蓝计数法、生长曲线法和集落形成法、3 h t d r 掺入试验等检测细胞活力的方法有较好的一致性。已广泛应用于抗肿瘤药物的初步筛选、细胞毒性检测以及肿瘤化学药物放射敏感性测定等。实验流程如下【4 1 】：处理后的细胞悬液按接种于9 6 孔板上( 0 1m l ；f l ) ，每组处理设4 - - 8 复孔西北大学博士学位论文加入1m m l 的m i t 溶液，1 0 u 孔l孵育4 6 h1离心，吸弃上清，每孔加0 2m l d m s o ，避光振荡溶解2 0m i nl用酶联免疫标记分析仪测定其吸光度值( o d )2 8 细胞形态观察( h e 染色光学显微镜)细胞经处理后，将细胞固定并作h e 染色，以观察细胞形态变化。细胞经甲醇固定1 0 m i n ，蒸馏水浸润，按照下列流程进行染色：苏木精染色1 5m i nl流水冲洗，酸酒精分色，自来水蓝化；梯度酒精脱水( 3 0 、5 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 ) ，5m i n 梯度酒精l伊红染色1 0sl1 0 0 酒精2 次，5m i n 次i1 2 无水乙醇+ 1 2 二甲苯，5m i nl二甲苯2 次，5m i n 次l中性树脂封片，显微镜观察，数码相机采集图像。2 9 细胞培养k 5 6 2 细胞是l o z z i o 从一位患有晚期慢性骨髓性白血病的5 3 岁妇女的胸膜渗出物中提取并建立的永生化人体肿瘤细胞系【4 2 】。l o z z i o 等的研究表明该细胞系具有高度未分第一二章实验方法、实硷材料与实验装置化的特征【4 3 】；同时具有红系的特征【4 4 1 ，属于恶性多能造血干细胞，能自然分化为红系、粒系、单核系细胞，细胞形态类似淋巴母细胞【4 5 1 。s m m c 7 7 2 1 是第二军医大学基础部病理教研室董春荣于1 9 7 7 年从一中年男性肝癌患者手术切除的标本中建系得来的【矧，该细胞是低分化快速增殖且甲胎蛋白阳性表达的细胞系。h e p g 2 细胞源自一名1 5 岁高加索男性肝癌患者的癌组织，为一种高分化慢增殖的肝癌细胞系；h e p a l 6 细胞株源自c 5 7 l 小鼠中的b w 7 7 5 6 肝癌，为单层贴壁生长的上皮细胞类型4 7 1 。k 5 6 2 与s m m c 7 7 2 1细胞均是低分化快速增殖的人肿瘤细胞，而h e p g 2 是两种高分化慢增殖的细胞。s m m c 7 7 2 1 与k 5 6 2 细胞均培养于r p m l l 6 4 0 + 1 0 ( 体积分数) 新生牛血清+ 双抗( 青、链霉素，1 0 0i u m l ) 的完全培养基中，在3 7 。c 、5 c 0 2 饱和水蒸气条件下培养及传代，使用对数期细胞进行实验。h e p g 2 与h e p a l 6 细胞均培养于d m e m + 1 0 ( 体积分数) 新生牛血清和双抗( 青、链霉素，1 0 0i u m l ) 的完全培养基中，在3 7 、5 c 0 2 饱和水蒸气条件下培养及传代，使用对数期细胞进行实验。肝细胞为小鼠肝细胞原代培养细胞。细胞培养于w i l l i a m se + 2 0 ( 体积分数) 胎牛血清和添加了胰岛素、地塞米松、谷氨酰胺和双抗的肝细胞完全培养基中。在3 7 、5 c 0 2 饱和水蒸气条件下培养及传代，使用对数期细胞进行实验。人外周血淋巴细胞。培养于r p m l l 6 4 0 + 1 0 ( 体积分数) 新生牛血清和双抗( 青、链霉素，1 0 0i u m l ) 添加了p h a ( 5u g m 1 ) 的完全培养基中，在3 7 、5 c 0 2 饱和水蒸气条件下培养。2 1 0u v 照射装置u v 辐射箱由本所自制( 图2 1 ) 。箱体顶部可安装有紫外灯管。辐射箱体有不同的照射台面，该台面为活动台面，可根据需要调整。在灯管与照射台面之间设有手动推拉式快门。三种不同波长的紫外石英灯管( 天津紫晶特种光源有限公司制造) ，功率均为8 w ，灯管长度为3 0 c m ，其发光光谱经反射式光栅光谱仪测量其中心波长分别为：3 6 5 n m( 属u v a 波段) ；2 9 0 3 2 0 n m ( 9 3 2 ) ( 属u v b 波段) ；2 5 4 n m ( 8 7 4 ) ( 属u v c 波段) 4 8 】。紫外光强度用紫外辐照计( 北京师范大学光电仪器厂) 测量，探头对应检测波长分别为2 5 4n m 、2 9 7a m 及3 6 5 姗，测量值的单位为p w c r n z 。西北大学博士学位论文么、夕紫外灯毙源拧榭门裁物台载物螽闻群1 0 c m图2 1 u v 辐射箱示意图2 8 1 测量方法1 把照射台面分别按纵横方向以5 c m 为单位分隔成棋盘状( 如图2 2 所示) ，用x 、y坐标表示；05 1 0 _1 5 m2 5 _为图2 2 照射台面示意图2 、把辐照计探头分别放在不同的十字处，测量并记录该点的光强。3 、更换辐射台面到4 个不同高低位置，按步骤2 测量光强。4 、更换不同波段的紫外灯，使用相应的探头测量相应的光强。一一埔一第二章实验方法、实硷材料与实验装置2 8 2 测量结果紫外a ( 3 6 5n m ) 3 0a m 处单位：i jw c m 251 01 52 02 53 03 555 4 46 3 66 9 16 9 96 4 35 4 64 5 11 06 5 57 8 o8 4 88 5 17 8 96 6 15 3 31 57 4 18 9 o9 8 79 8 68 9 97 4 35 8 22 07 8 09 3 61 0 4 21 0 4 69 4 57 8 66 l2 57 6 39 21 0 1 91 0 2 79 3 37 86 1 63 07 0 88 3 79 2 99 3 58 5 87 2 85 8 2x51 01 52 02 53 03 553 4 43 8 64 0 84 l3 8 93 5 63 11 03 9 74 4 64 7 34 7 64 5 34 1 13 5 41 54 3 44 8 95 1 95 2 34 9 44 4 53