（化学工艺专业论文）茶树菇降血压活性肽的提取分离研究.pdf

茶树菇降血压活性肽的提取分离研究 摘要 高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症， 它常伴有心脏、血管、脑和肾脏等器管疾病。食品蛋白质中含有具有 降血压作用的活性肽( 降血压肽) ，它可以通过抑制血管紧张素转换 酶( a c e ) 的活性来达到降血压的作用，因此也称为血管紧张素转换 酶抑制肽( a c e i ) 。 以茶树菇为原料，采用溶剂提取法提取茶树菇中的降血压活性 肽，以蛋白质提取率和提取液对a c e 活性抑制率( 伊) 为指标， 考察了以水和5 0 乙醇为提取溶剂的提取效果。实验结果显示茶树菇 水提液的提取率为8 5 7 8 ，抑制率为4 8 4 3 ，5 0 乙醇提取液的提 取率为4 1 4 8 ，抑制率为4 9 1 6 ，综合考虑选择水作为提取溶剂， 并优化了水提法的提取工艺，确定了提取的适宜工艺条件为：提取温 度3 0 ，最适p h 为8 ，提取时间9 h ，此时蛋白质提取率( 助可达到 8 8 3 ，对a c e 的抑制率( 胆) 为4 9 3 。 使用活性炭对提取液脱色，采用单因素实验法，考察了活性炭用 量、脱色温度、溶液p h 值、脱色时间对脱色率( d c ) 和活性损失率 ( 岛) 的影响，实验结果表明，在加入o 5 活性碳、脱色温度4 0 、 溶液p m 5 的条件下脱色4 0 m i n ，脱色效果较好，脱色率( d c ) 可达 到7 8 8 6 ，活性损失率( b ) 为1 5 6 8 ，对a c e 的抑制率( 伊) 为 4 1 5 7 。 实验使用1 0 l ( d a 超滤膜对脱色液进行超滤富集活性成分，收集 滤液，进行层析分离，考察了s e p h a d e xg 2 5 凝胶、s e p h a d e xg 1 5 凝胶的分离效果。选用s e p h a d e xg 1 5 凝胶为层析材料，以水为洗脱 溶剂，洗脱速度为1 o m l m i n 1 ，上样量为3 m l 时，可收集到3 种组 分，活性肽回收率( 尺p ) 可达9 1 1 ，其中洗脱i i i 峰有较高的a c e 抑制效果，抑制率( 伊) 为4 6 4 ，i i i 峰活性肽回收率( 邱) 为2 5 6 。 选用i i i 洗脱峰为原料，采用i 心肿l c 反相制备色谱分离，可以 得到4 种组分，经活性检测，a c e 抑制活性最强组分位于i d ( 1 ) 组 分，纯度可达9 5 以上，其i c 5 0 为o 0 1 0 9m g m l 。 关键字：茶树菇a c e 抑制肽分离纯化 i i s t u d y0 nt h ee x t r a c t l0 na n dp u riflc a t10 np r o c e s s0 f a n g10 t e n sini c o n v e r te n z y m ein hibit o rf r o m a g r o c y 8 ea e glrlt a b s t a r c t h y p e n e n s i o ni so n e “n do ft h ec l i n i c a ls y n d r o m et a l ( i n gt l l a ta r t 甜a ls y s t o l i cp r e s s u r eo r d i a s t o l i cp s s u r er i s e sa sc t l a r a c t e r i s t i c ，“仔e q u e n t l ya c c o m p a l l i e s h e a r t ，b l o o dv e s s e l s ， k i d n e ya l l db r a j nd i s e a s e s an 啪b e ro fp e p t i d e sw 1 1 i c hc a l ld 印r e s sb l o o dp r e s s u r eh a v eb e e n i s o l a t e da i l dc h a r a c t e r i z e d6 mf o o d s t h ep e p t i d ew k c ha l s 0n a m e da c e - i 1 1 l l i b i t o 巧p e p t i d e ( a c e i ) b yi 1 1 l l i b i t i n g 吐1 ea c t i v i 够o fa n g i o t e l l s i l l - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) t od 印r e s st h eb l o o dp r e s s u r e 儆i n g 彳即啪p 口砂订a l st h er a wm a t e r a l s ，t l l ee 仃e c to fs o l v e n to ne x t r a c t i o no fa c e i a i l di t si 1 1 l l i b i t i o nf o ra c ew 骶t a s t e d 1 1 1 ew a t e re x t r a c t ss h o w e dt h ee x t r a c t i o nr a t e ( d ) 锄d 也ei n l l i b i t o 巧a c t i v i t ) ，( a t8 5 7 8 锄d4 8 4 3 ；m ee t h a n 0 1 ( 5 0 ) e x 仃a c t ss h o 、v e dt h ed a i l di pa t41 4 8 缸d4 9 16 t h e r e f o r e d i s t i l lw a t e rw a u ss e l e c t e da se x t r a c t i o ns o l v e n t m e a n w 柚e ，t l l eo p t i i i l a le x t m c t i o nc o n d i t i o n so fa c e i 矗的m 么g 加啪p 口p 驴订傩i i l v e s t - t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt l l a t 1 eo p t i i i l a le x 位l c t i o nc o n d i t i o l l sa u sf o l l o 晰n g ：e x 傲忙t i o nt i m e w a s9h o ue x 觚t i o nt e m p e r a t u r e3 0 ，a n dt l l e nt h eda i l di pw e r e8 8 3 a 1 1 d4 9 3 a c t i v a t e dc a r b o nw a sa d o p t e di nd e c o l o u rw a t e re x t r a c t ss o l u t i o nb ys i n 9 1 ef a c t o re x p e r h e n t t h ef a c t o r si r i c l u d i n gq u 乏m t i t ) ro fa c t i va _ t e dc a r b o n ，t e t r 巾e r a t u r e ，p h ，a n da d s o 印t i o n t i i l l ew e r ei n v e s t i g a t e dmt e 肌so fd e c o l o u 血ge 伍c i e n c y 慨) a i l d b i o a c t i v 时l o s s p ) t h e r e s u l t ss h o 、e dm a to p t i i i l u md e c o l o r a t i o ne a b c tw 嬲o b t a i n e df b mm ef o l l o w i n gc o n d i t i o i l s ： q u a n t 时o fa c t i v a t e dc 讪o no 5 ，t e m p e 胁胎4 0 ，p hv a l u e3 5 ，姐da d s o r p t i o nt i m e4 0 m i n m e s t h e nd e c o l o 嘶n ge 伍c i e n c ya i l db i o a c t i v 时l o s sw e r e7 8 8 6 a i l d15 6 8 ，a i l di i l l l i b i t o r ) ，a c t i v i 够( ，尸) w a s4 1 5 7 w 乱e re x t r 乏t c t ss o l u t i o n 砌c hw a sd e c 0 1 0 u r e d 晰t ht l l ea c t i v a t e dc a r b o nw a ss e p 剃t e d i i i 晰t l lu l t r a f l l t r a t em e m b m ew m c hm 0 1 e c u l a rw e i g h ti s10k d a f u n h e rp u r i f i c a t i o no ft h e a c t i v ef a c t i o nw a sc a 而e do u tb yg e l f i l t r a t i o n 、 ，i t l ls e p h a d e xg e l 一2 5a 1 1 ds e p h a d e xg e l 一15 t h ef i l t e rs 0 1 u t i o nw a si s o l a t e dt h r e ep e a k s 研t ht h eg e l l5w h e ne l u t e dw i t hw a t e ra tan o w r a l eo f1 0m l m i n 1a 1 1 di i l i t i a lv o l u m ea t3m l ，t 1 1 ep 印t i d et o t a ly i e l d ( 尺p ) w a s9 1 1 t h e m i r dp e a kh a st h es t r o n g e s ti n h i b i t o 巧t 0a c e ，t h ei n h i b i t o 巧a c t i v i 够( ，尸) w a s41 5 7 ，a n d t l l ep e p t i d ey i e l d 僻p ) 粥2 5 6 n l et h i r dp e 出ss 锄p l e 嗍p u r i f i e db yr p - h p l c ，i tc a nb es e p a r a t e di n t of o u r c o m p o n e n t s t h el l i 曲e s ta u c t i v ec o m p o n e n t 砌c hn 锄e di 一d ( 1 ) w a si d e n t i f i e d b yr p - h p l c ， i t sp 面t ) ，c a i lr e a c h9 5 ，a i l di c 5 0 、v a so 0 1 0 9m g m l k e yw o r d s ： 么g m 吵施口曙咖豇；a c ei n l l i b i t o 巧p e p t i d e ；s e p a r a t i o na i l dp 面f i c a t i o n i v 符号 彳 彳 彳4 5 0 c c o d d c r h 风 鼠 n r p y 符号说明 意义 空白对照组中马尿酸的峰面积 加入抑制剂后马尿酸的峰面积 色素在4 5 0 m n 处的吸光度 回收样品的浓度 进样降血压肽的浓度 蛋白质提取率 提取液的脱色率 马尿酸回收率 标准样中马尿酸的量 混合样中马尿酸的量 样品中马尿酸的量 蛋白质含量 活性肽回收率 回收样品的体积 进样降血压活性肽的体积 v i i i 单位或量纲 m g 仰l 。l m g m l 。l p g p g 腭 m l m l 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。 论文作者签名： 学位论文使用授权说明 切g 年r 月；日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 彳即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名： 导师签彩阳蘩跏萨j 月 茶树菇降血压活性肽的提取分离研究 第一章绪论 高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，它常伴有心脏、血 管、脑和肾脏等器管和结构等全身性疾病。高血压患病主体越来越年轻化，并逐渐由城 市波及到农村，患病率呈逐年增加的趋势，且常用的降血压药物存在诸多的不良反应， 随着人们对保健营养康衰老等方面的要求不断的提高，迫使人们寻找更为安全的降血压 药物。a c e 抑制肽( a n g i o t e l l s i ni c o n v e n i n ge n z y m ei n h i b i t o d rp e p t i d e s ，a c e i ) 即降血 压肽，是一类小分子肽的总称，一般由蛋白水解酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食 用安全性高。a c e 抑制肽的优点是对高血压患者可以起到降压作用，而对血压正常的人 无降压作用，并且它们除具有降压功能外，往往同时具有免疫促进、减肥及易消化吸收 等生理功能，因此，a c e 抑制肽的研究已成为目前生物活性肽研究领域最热门的方向之 一6 1 1 高血压概述 1 1 1 高血压 高血压是最常见的心血管病，是全球范围内的重大公共卫生问题，我国的高血压状 况更是不容乐观，根据2 0 0 2 年的调查结果显示，我国1 8 岁以上人高血压的患病率是 1 8 8 ，依据我国的总人数，大概高血压患者已经达到1 6 个亿，我国已经成为了世界上 高血压患病人数最多的国家【1 1 。 高血压病严重地危害着人体健康，威胁人的生命安全，常常伴有严重的并发症。研 究发现，高血压可以引起心肌肥厚、心力衰竭、心纹痛及心肌梗死，长期的高血压还会 使心室扩张，形成高血压心脏病，同时可以引起脑动脉硬化，导致引起中风、脑梗塞和 脑溢血，可引起肾动脉硬化，肾单位萎缩或消失，常致多尿，进而尿量减少，影响肾功 能，甚至会导致尿毒症。 1 1 2 常用降压药物及不良反应 资料显示口。5 】，现在常用的降血压药物主要分为以下几类： ( 1 ) 血管紧张素转换酶抑制剂( 化学合成) ：通过抑制血管紧张素转换酶达到降血 压的作用，目前常用药物有巯甲丙脯酸、依那普利、贝那普利、卡托普利、培垛普利及 茶树菇降血压活性肽的提取分离研究 福辛普利。该类药不良反应较少，常见的有刺激性干咳，较严重的为血管神经性水肿。 ( 2 ) 钙拮抗剂：一组化学结构不同、作用机制也不尽相同的药物，由于抑制钙离子 通过细胞膜上钙通道的内流达到降血压的效果，因而称为钙通道拮抗剂。常用药物有异 搏定、硫氮卓酮、硝苯吡啶、非洛地平及尼莫地平。服用钙拮抗剂，如硝苯地平会有面 部潮红、头痛、心率加快、足部水肿等不良反应。拉帕米和地尔硫卓对心脏传导及窦房 结功能有抑制，因此对于心动过缓和房室传导阻滞者不宜使用。 ( 3 ) 血管扩张剂：它主要包括两种类型的药物，一是直接舒张血管药，即通过松弛 血管平滑肌，扩张血管来降低血压，常用药物有硝普钠、肼屈嗪及肼苯达嗪，服用后可 反射性引起交感兴奋，可使心率加快，心收缩力加强，增强心肌耗氧量。二是钾通道开 放剂，它可使细胞内c a 2 + 浓度下降，促使血管平滑肌松弛，外周阻力下降，达到降血压 作用。常用药物有吡那地尔、米诺地尔，有多毛症不良反应。 ( 4 ) 作用于交感神经系统的降压药：它主要包括四种不同类型的药物，一种是中枢 性交感神经抑制药，它可激动外周交感神经突触前膜的0 【2 r 及其相邻的咪唑啉受体，负 反馈性减少去甲肾上腺素的释放，达到降血压的作用。常用药物有可乐宁、甲基多巴， 长期服用有口干、嗜睡、鼻塞、阳痿等不良反应。第二种为交感神经节阻滞剂，可用于 高血压脑病的治疗，常用药物有阿方那特。第三种属于交感神经节后阻滞剂，可使交感 神经末稍去甲肾上腺素贮存耗竭，而达降压的目的。常用药物有胍乙啶、利血平，因不 良反应多，现已少用。最后一种属于肾上腺素能受体阻滞剂，其中包括：b 受体阻滞 剂，可抑制肾素分泌、减少去甲肾上腺素分泌而降低外周交感神经活性、阻断中枢b r ， 使外周交感神经功能降低来达到降血压的作用。常用药物有美托洛尔、比索洛尔、艾司 洛尔、倍他洛尔、卡替洛尔、拉贝洛尔。服用p 受体阻滞剂主要会有心动过缓、诱发支 气管哮喘、高血糖、高血脂等不良反应，大剂量使用可发生急性心力衰竭。a 受体阻 滞剂，其主要通过舒张小动脉及小静脉，降低外周阻力而达到降血压作用，常用药物有 哌唑嗪、多沙唑嗪。服用伍受体阻滞剂时会出现体位性低血压症状。 ( 5 ) 利尿降压药：长期服用可使体内轻度缺n a + ，促进n r c a 2 + 交换降低，则血管壁 细胞内c a 2 + 含量也随之降低，致使血管平滑肌舒张达到降血压的作用。常用药物有噻嗪 类、氯噻酮、速尿。服用利尿剂会有低血钾、高尿酸血症、高钙血症、高血糖和高血脂 的不良影响，另外，对肾功能减退的患者也会有不利影响。 1 2 降血压肽概述 2 茶树菇降柚“e 活性肽的提取分离研究 1 2 1a c e 与高血压的关系 高血压是一种临床常见的以体循环动脉血压升高为主的综合征，医学上根据高血压 的发病原因，将其分为继发性高血压和原发性高血压两大类。继发性高血压是因全身性 疾病引起的高血压，病因明确，最多见的是由肾脏疾病、内分泌疾病引起。原发性高血 压是由某些先天性遗传基因与多种致病性增压因素和生理性减压因素相互作用而引起 的一种多因素疾病，在诸多因素影响下，使肌体对血压的调节功能失调所造成，约占高 血压病人的9 5 以上，因此，了解其发病原因可帮助我们理解预防措施与治疗机制。在 对高血压致病机理的研究中人们发现，在控制人体血压的多种因素中，肾素一血管紧张 素调节系统( r e n i 2 l 1 a n g i o t e n s 洫s y s t e m ，r a s ) 和激肽释放酶一激肽系统( k a l l i k r e i n 虹i l i i l s y s t e m ，k k s ) 是人体内两种重要的调节系统，r a s 与k k s 的平衡失调是高血压发病的 重要原因之一，其中血管紧张素转换酶( a c e ) 是系统调节过程中起关键作用的酶，是 使血压升高的主要因素。 血管紧张素转换酶( a c e ) 是一种含锌二肽一羧肽酶( d i p p e p t i d y lc a r b o 巧0 1 1 ) 【y p e p e t i d a s e ) ，相对分子质量为1 2 1 5k d a 。a c e 在人体组织及血浆中广泛存在，主要存在 于血管内皮细胞内，在肺毛细血管中含量最为丰富。在r a s 中，a c e 通过催化血管紧张 素i ( a n gi ) ，使其脱去c 未端两个氨基酸残基形成血管紧张素i i ( a n gi i ) 。血管紧张素 i i 的活性很强，是r a s 中所知道的活性最强的血管收缩剂，其作用于小动脉，使血管平 滑肌收缩，从而引起升压效应；同时它还能刺激醛固酮分泌和直接对肠胃作用( 减少肾 血流量及促进n 矿、k + 的重吸收) ，引起钠贮量和血容量的增加，也能使血压升高。在 k k s 降血压系统中，缓激肽是一种降血压物质，而a c e 也能作用于缓激肽，从其c 未端 脱去2 个氨基酸残基而使其失活，从而引起血压升高。因此，如果抑制了a c e 的活性， 就能有效的防治和治疗高血压的发生，这也为生产降血压药物提供了一种新的方法。 a c e 对血压的调节作用见图1 1 。 茶树菇降血压活性肽的提取分离研究 肾素一血管紧张素系统( r a s ) 血管紧张素原 o 肾素 血管紧张素( 无活性) 激肽释放酶一激肽系统( k k s ) 激肽原 n激肽释放酶 一张0 嚣剂， = 肽尹一n o 释勺前= 僦 蜡燃素严删二肽譬e o 广西大掌硕士掌位论文茶树菇降血压活性氐的提取分离研究 发现，双酶法的作用效果与单酶法相比，并没有明显的优势，大部分组合产物的活性都 不如单酶法产物的活性高，这与吴建平等得出的结论相似。辛志宏等【18 】用8 种蛋白酶 分别进行单一酶和复合酶水解麦胚蛋白水产降血压肽，在单一酶水解的基础上选择水解 效果较好的酶两两组合，进行复合水解，通过比较发现复合酶水解物对a c e 的抑制率并 没有明显提高。 ( 2 ) 发酵法制备 奶酪、豆奶、酱油、酒等【1 9 也】彳艮多发酵物中都含有降血压肽。o k 锄o t o 等【冽综合比 较了多种不同发酵食品的降血压活性，发现大豆、奶酪等食品经发酵后含有较高活性的 降血压肽，特别是以大豆为原料的发酵食品中含有较强的活性。m a s u d a 等【2 4 】从酸奶中提 取出一种具有较高活性的三肽，它能够不被降解，从而可以直接通过口服降低s h r 的血 压，其分子质量在4 0 0 5 0 0d a 之间。 ( 3 ) 溶剂提取法制备 一些动物原料在适宜温度、p h 等条件下，一定时间后可激活细胞内自溶酶系统，水 解自身蛋白质产生具有降血压活性的多肽。m a t s u m 啪等从鲣鱼内脏的自溶产物中分离 出了6 种具有降血压活性的三肽和四肽，其中4 种有很强的降血压活性。 有研究表明，可以从植物原料如大蒜、蘑菇、无花果以及中药植物口5 2 6 1 中直接使用 溶剂提取法提取降血压多肽，其中1 9 9 8 年，s u e t s u n a 等口7 】从大蒜中分离出了七种二肽， 并确定了氨基酸序列。 1 2 3a c e 抑制肽抑制率的检测 a c e 抑制肽的降压活性的测定方法，主要包括体外活性检测( a c e 抑制活性检测) 和体内活性检测( s h r 动物实验检测) 两种。体内活性检测，即采用分离平滑肌或活体 动物加压反应的生物试验法和免疫放射试验法测定，虽然该方法在体内研究中取得很好 的结果，但是该方法技术要求较高，操作繁琐，很难作为一种快速筛选方法推广。因此， 建立一套简便的体外测定降血压肽活性的实验方案就显得尤为重要。 早期分析a c e 活性是以a c e 的天然底物a n gi 或缓激肽为底物，应用放射色谱法、 比色法或放射免疫法进行分析，过程操作复杂、干扰多且底物昂爿2 8 1 。目前，a c e 活性 检测主要是以人工合成的酶底物进行分析，报道中最常用的方法是以马尿酰组氨酰亮氨 酸( h h l ) 为底物的分光光度计法和f a - p h e g l y g l y ( f a p g g ) 为底物的酶活力动力学法 分析。文献显示，也有人利用a c e 与马尿酸一双甘肽( h i p g l y - g l y ，h g g ) 反应生成马尿 5 茶树菇降血压活憎强太的提取分离研究 酸和甘氨酞甘氨酸( 也叫双甘肽，g l y g l y ) 的方法来测定【2 9 1 。 1 9 7 1 年，c u s l 衄a i l 和c h e u l l g 【3 0 】建立了紫外分光光度法测定a c e 抑制剂的活性。利用 a c e 在3 7 ，p h 为8 1 3 条件下催化分解a n gi 的模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) ，产 生马尿酸( h i p p 耐ca c i d ) 和二肽( h i s l e u ，h l ) ，从而通过测定加入抑制剂前后所生 成的马尿酸量的紫外吸收差值得到其抑制活性。y 锄锄o t o 等【3 1 1 在该方法的基础上加以 修改后，添加了空白参比试样，即为现在常用的a c e 活性抑制率的测定方法。传统的检 测方法采用乙酸乙酯萃取，使马尿酸与未反应的h h l 分离，后来许多学者对其进行了改 进，其中e i b i 和w a 驴e r 【3 2 】的高效液相色谱法直接将反应液用于马尿酸的定性定量分析， 不需经过乙酸乙酯抽提马尿酸的繁琐过程，操作简便，准确性高。d 籼y 等【3 3 1 人将液相 色谱和电子质谱耦联实现了降血压肽的在线检测；徐小华等【3 4 】人建立了用毛细管胶束电 动色谱( m e c c ) 测定血管紧张素转换酶( a c e ) 活性的方法，通过对电压、上样时间、电 极缓冲液体系等影响因素的优化，探讨了该方法的可行性；辛志宏等【3 5 1 采用高效毛细管 电泳法测定了a c e 抑制剂的活性。 v e m e i r s s e n 等【3 6 1 改进h 0 1 m q u i s t 【3 7 1 建立的以f a p g g 为a n gi 模拟物的分光光度法。 f a p g g 在a c e 的作用下生成f a - p h e 和二肽，f a p g g 的降解使反应体系在3 4 0 n m 下的吸 光值线性下降，以单位时间内吸光值的改变表示酶活力或反应速率，测定加入抑制剂与 未加入抑制剂时酶活力的差别来表示抑制活性的大小。该方法是一种连续测定的方法， 需要时间少，参与反应的物质少，干扰因素少。 1 2 4a c e 抑制肽的分离 各种多肽的氨基酸组成和结构差别均较大，没有一个固定或较特殊的氨基酸组成， 并且食物蛋白质酶解产物成分相当复杂，这就增加了它的分离提取难度，常用的多肽分 离方法有超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳、高效液相色谱、高效毛细管 电泳等。 将不同来源的降血压肽溶液离心取上清液，用活性炭吸附脱色，并除去溶液中较大 分子量的物质，脱色液经超滤以获得合理的短肽分布，由于许多降血压肽结构很接近， 根据具体情况可以再结合离子交换层析，通过电荷的差异，达到更好的分离效果，然后 根据分子的大小用凝胶过滤层析，将混合物通过多孔的凝胶床达到分离目的。初步分离 后的样品再进行i 冲h p l c 分离、s d s p a g e 凝胶电泳、毛细管电泳等，获得高纯度的 a c e 抑制肽。 6 茶树菇降血压活性撤的提取分离研究 s u e t s u n a 阳采用了离子交换和凝胶过滤色谱的方法分离大蒜中具有a c e 抑制活性的 组分，强抑制活性组分在r p h p l c 色谱中经进一步纯化可得到7 种具有抑制活性的二肽； a s t a w a i l 等【3 8 】用s e p h a d e xg 2 5 凝胶层析和s ps e p h a d e xc 2 5 离子交换层析分离纯化金枪 鱼的酶解产物，得到至少4 种降血压肽；j a n 矿卅用嗜热菌蛋白和蛋白酶共同水解牛肉蛋 白，经超滤、凝胶层析和i 冲h p l c 分离后，得到序列为v a l l e u a l a - g l n 1 m l y s 的肽段， 对a c e 活性抑制率为3 0 1 。 目前，国内关于降血压肽的分离方法研究，大部分还是吸取国外的方法m 彤】。倪莉 等m 】采用凝胶色谱过滤s e p h a d e xg 2 5 、离子交换层析和反相高效液相色谱法对动物蛋 白酶解产物进行分离纯化，得到一种a c e 抑制肽，组成为g l y t y r 。潘道东【4 5 】过四步反 相高压液相色谱从三口f 幻6 叩f 刀螂矗p 舭f 纪姗和钟幻6 口c f 刀搬c 傩p fs 甜6 跟c 傩p 埔0 作的酸乳中 分离到对a c e 活性具有较强抑制作用并具有较强降高血压效果的活性肽。戴军等【4 6 】应 用大孔吸附树脂柱层析和高效凝胶过滤色谱以及反相色谱多步提取纯化了绍兴黄酒中 的肽类组分，得到了4 种活性较高的降血压肽。 1 3 茶树菇概述 1 3 1 茶树菇 茶树菇( 彳即啪p 础胁) ，学名茶薪菇，担子菌纲、伞菌目、粪绣伞科。它子实 体单生、双生或丛生，菌盖直径5 1 0 c m ，表面平滑，初期为暗红褐色，有浅皱纹，菌肉 ( 除表皮和菌柄基部之外) 为白色，有纤维状条纹。成熟期菌伞变硬，茵柄附膜质粘状物、 菌环残留在菌柄上或附于茵盖边缘或自动脱落【4 7 1 。 1 3 2 茶树菇的营养价值 有研究显示【4 8 一，茶树菇子实体含有1 7 种氨基酸，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高， 总量为1 7 5 0 2 1 0 0g ( 干重) ，人体必需氨基酸总量为7 8 4 8 l o og ( 干重) ，占氨基酸总 量的4 4 8 4 。茶树菇含有较高的c a 、f e 、z n 等人体易缺少的微量元素，而有害重金属 元素的含量相对较少。茶树菇提取物的多糖含量丰富，多糖是以葡聚糖为主( 6 4 9 4 ) ， 并含有半乳糖( 1 7 5 3 ) 、阿拉伯糖( 1 1 4 5 ) 、甘露糖( 2 8 6 ) 、鼠李糖( 1 8 8 ) 、 木糖( 1 3 4 ) 等单糖的杂多糖。 1 3 3 茶树菇的保健作用 7 广西大学硕士掌位论文茶树菇降血压活性- 氐的提取分离研究 中医认为，茶树菇性平、甘温、无毒，常用作利尿渗湿、健脾止泻之药，具清热、 平肝、气喘有独特疗效，且具有良好的防癌抗癌功能，因此，茶树菇享有“中华神菇 的美称。 茶树菇多糖是人体免疫调节活性物质，它具有抗肿瘤、降血脂，抗衰老作用。菇中 丰富的矿物质和氨基酸是人体不可缺少的营养成分，可利用提取出的天然真菌多糖和 矿物质及氨基酸物质制成理想的功能性保健产品【5 们。 1 3 4 食用真菌类降血压肽的研究现状 自然界约有食用菌2 0 0 0 种，我国食用茵已知9 3 8 种，隶属于1 6 6 属，5 4 科，1 4 目。食 用真菌中菇类的蛋白质含量一般为干菇1 5 3 5 ( 干菇) ，高于一般蔬菜，而且它的氨基酸 组成比较全面，大多菇类含有人体必需的八种氨基酸，且富含核酸、碳水化合物与纤维 素、维生素、矿物质等。有研究表明，食用真菌具有抗肿瘤、增强免疫功能、调节血脂、 保肝解毒作用、降血糖、降血压等保健功能。 从食用真菌中提取纯化降血压活性肽还属于一个崭新的研究，在国内研究较少，国 外对于此的研究也是处于起步阶段。2 0 0 1 年，c h o i 等【5 1 1 研究了一系列食用菌的水、乙醇、 甲醇提取液的降血压活性，其中灰树花的水提液降血压活性最强，其对a c e 的活性抑制 率可达到5 8 7 ，i c 5 0 为0 9 5 m g ；采用离子交换色谱、s 印h a d e xl h - 2 0 凝胶色谱、反相高 效液相色谱等方法对灰树花水提取液进行逐步纯化，得到了一种具有较高a c e 抑制活性 的6 肽，结构为v 甜i l e g 1 u l y s t y r p r 0 ，该6 肽的i c 5 0 为0 1 3 m g 。2 0 0 4 年，l e e 等【5 2 】同样使 用了水、乙醇、甲醇做溶剂，从白蘑菇中提取出了具有降血压活性的物质，采用了超滤、 s e p h a d e xg 2 5 凝胶色谱、反相高效液相色谱方法将提取液分离纯化，得到了一个结构为 g l y g l u - p r 0 的3 肽，其i c 5 0 为0 0 4 m g 。2 0 0 5 年，张丽梅等【5 3 】人同样对灰树花进行了研究， 简化了a c e 抑制肽的提取工艺条件。 1 4 本课题的研究意义及主要内容 1 4 1 研究意义及目的 从天然食物中分离到的a c e 抑制肽，其降压效果虽不及合成药物强烈，但其对正常 血压无影响，且来自于纯天然的食物蛋白质中，安全可靠，这些特点吸引了广大的研究 者的积极研究。目前的研究表明，从食物蛋白质中分离到的a c e 抑制肽，不仅在体外试 验中有较强的抑制活性，而且动物实验和人体临床试验的降压效果也比较明显，这为研 r 茶树菇降血压活榴撤的提取分离研究 究开发新型安全高效的a c e 抑制剂提供了一条新的途径。目前，我国对降血压肽的研究 还处于起步阶段，但多肽药物已引起高度重视，我国“十五 期间生物医药研究的重点 方向之一就是多肽药物，相信在未来几年里将会有大量的多肽药物进入临床试验，部分 将作为新药获准生产销售。 1 4 2 本课题研究内容 本课题主要研究内容包括以下几个方面： ( 1 ) 建立简便、快捷而行之有效的血管紧张素转换酶抑制活性的检测方法。 ( 2 ) 分析茶树菇的主要成分组成情况，确定适宜的提取溶剂提取茶树菇降血压肽。 ( 3 ) 以蛋白质提取率和对a ce 活性抑制率为指标，考察各影响因素的影响，确定 适宜的提取工艺条件。 ( 4 ) 对提取液进行脱色，考察各脱色影响因素对脱色率和a c e 抑制活性的影响， 确定适宜的脱色取工艺条件。 ( 5 ) 使用凝胶层析、反相制备色谱对脱色液进行分离提纯，确定最佳分离条件，纯 化产品并鉴定产物纯度，对分离出的多肽纯品进行结构分析，确定其结构。 9 广西大掌硕士掌位论文 茶树菇降血压活性肽的提取分离研究 第二章a c e 活性抑制测定方法的建立 降血压肽是一类血管紧张素转换酶抑制剂( a c e i ) ，通过抑制血管紧张素转换酶 ( a c e ) 的活性而达到降血压的作用。活性检测主要包括体外活性检测( a c e 抑制活性检 测) 和体内活性检测( s h r 动物实验检测) 两种，体内实验相对于体外活性检测来说实 验周期长，实验动物成本高，所以建立一种简便可行的体外检测方法非常重要。 1 9 7 1 年，c u s h m a n 和c h e l u l 矿o 】提出了一种a c e 抑制活性检测实验方法，即通过a c e 酶解马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) 使之生成马尿酸和二肽来定量其活性大小，其中多以 马尿酸的生成量来定量。对马尿酸的分析常采用紫外比色法，此法即将生成的马尿酸用 乙酸乙酯萃取后进行比色，此法操作较为复杂，因此，近年来对马尿酸的分析出现了 h p l c 法和h p c e 法，使用h p l c 法样品无需预处理，操作简单，分析时间较短。 为了建立简便、更加有效的测定方法，本章在c l l s l l i i l a i l 等【3 0 】基础上，采用反相高效 液相色谱( i 心h p l c ) 定量测定马尿酸的生成量，计算抑制率，以此来评价降血压肽的抑 制活性。 2 1 实验药品及仪器 2 1 1 实验药品 血管紧张素转换酶( a c e ) ，马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) ，马尿酸( h i p ) ，卡托 普利( c a p t o p r i l ) 分别购于s i g m a 公司；三氟乙酸( t h f ) 购于上海国药集团化学试剂有限 公司；实验所需其他试剂均为国产分析纯或色谱纯。 2 1 2 主要仪器 高效液相色谱仪型：a g i l e n t l l o o 型，美国安捷伦科技有限公司； 恒温水浴摇床：s w b 2 0 0 0 型，天津奥特恩斯仪器公司； 紫外可见光分光光度计：u v 2 5 0 1 p c 型，日本岛津； 电子天平：b s1 1 0 s 型，北京赛多利斯仪器有限公司。 2 2 实验方法 2 2 1 溶液的配制 l o 茶树菇降血压活档掳太的提取分离研究 马尿酸标准溶液：精确称取1 0 0 m g 马尿酸溶于蒸馏水中，以1 0 0 m l 容量瓶定容， 即为1 0 0 m g m l 。的马尿酸标准液。 0 2 mp h = 8 3 的硼酸盐缓冲溶液：o 0 5 m 硼砂与o 2 m 硼酸以4 ：6 ( 、w ) 混合( 含 0 3 m o l l dn a c l ) ，即得p h = 8 3 的o 2 m 硼酸盐缓冲液。 a c e 溶液：将l u 的源于兔肺的a c e 用一定量的0 2 m 的硼酸盐缓冲溶液溶解，配 成1 u m l 一，然后分装，置于低温冷冻冰箱保存备用。 马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) 溶液：称取一定量的h h l ，溶于o 2 m 的硼酸盐缓冲溶 液中，配制成6 5 m m o l l 。的溶液。 2 2 2 马尿酸标准曲线制作 ( 1 ) 色谱条件 高效液相色谱系统：a g i l e n t1 1 0 0 高效液相色谱仪；色谱柱：h ) ，p e r s i lo d s c 1 8 ( 4 0 m m 2 5 0 m m ，5 “m ) ；检测波长：2 2 8 i 皿；柱温：3 0 ；流动相：m e o h ：h 2 0 = 1 5 ：8 5 ( 含o 1 t h f ，v ) ；流速：1 o m l m i n 1 ；进样量：2 0 此。 ( 2 ) 标准曲线的绘制 取1 o om g m l 1 的马尿酸标准液，加入蒸馏水稀释到所需浓度，进样检测马尿酸峰 面积值，以马尿酸的量对峰面积值作图，得到标准曲线。 2 2 3 活性反应液的制备与检测 ( 1 ) 活性检测方法 实验参考c u s h m a i l 等3 0 1 检测方法，采用h p l c 法分析样品的体外抑制活性，色谱条 件同2 2 2 所示。活性抑制反应即将待测活性物溶于一定量的0 2 mp h = 8 - 3 的硼酸盐缓冲 液中，取适量，加入一定活性的a c e 于3 7 保温l o m i n 后，加入一定量6 5 m m o l l 1 的h h l ， 随后在3 7 恒温水浴中保温3 0 m i i l ，加入一定量1 0 m o l l 。1 的h c l 中止反应，反应液离心 1 5 而n 后，取上清液用高效液相色谱分析马尿酸含量，通过h p l c 图谱定量马尿酸生成量， 以生成的马尿酸的量来判断样品的a c e 的抑制活性。 ( 2 ) a c e 抑制率的计算 a c e 抑制率( 伊) 计算公式如下： 伊( ) ：掣1 o o ( 2 - 1 ) 茶树菇降血压活性肽的提取分离研究 其中：俨样品对a c e 的抑制率( ) ； 彳一对照组中马尿酸的峰面积； 4 ，- 一加入酶解物后马尿酸的峰面积。 2 2 4 加样回收实验 按2 2 3 方法，同时做3 份平行空白样品，从每份中分别取1 0 0 止反应液，置于1 5 m l 的离心管中，加入不同剂量的马尿酸标准溶液，混匀，采用h p l c 法测定马尿酸含量， 根据样品、样品+ 马尿酸标准溶液及马尿酸标准溶液中马尿酸含量的不同来计算平均回 收率，回收率按下式计算： 尺h ( ) = 兰二弓季j 圭生1 o o ( 2 2 ) 其中：r h 一马尿酸回收率( ) ； 混合样中马尿酸的量( 烬) ； 凰样品中马尿酸的量( 鹇) ； 风标准样中马尿酸的量( 昭) 。 2 2 5c a p t o p m 半抑制浓度测定 取一定量的c a p 忉p r i l ，溶于o 2 mp h = 8 3 的硼酸缓冲液，配制成o 2 腭m l 以的c a p t o p r i l 标准溶液。取不同量的c a p t o p r i l 标准溶液按2 2 3 方法进行活性检测反应，按2 2 2 方法检 测马尿酸的含量并计算c a p t o p r i l 对a c e 的活性抑制率，以c 印t o p r i l 浓度为横坐标，以抑 制率为纵坐标制图，求c a m o p r i l 的i c 5 0 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 检测波长选择 取马尿酸标准溶液、马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) 溶液在2 0 0 3 0 0 m n 范围内进行紫 外光谱扫描，选择合适的马尿酸检测波长，扫描图谱见图2 1 。 1 2 广西大学硕士掌位论文 茶树菇降血压活d 掳太的提取分离研究 0 wl ( n m ) 图2 1 马尿酸的紫外吸收光谱 f i g u r e2 - 1u 1 t r a v i 0 1 e ta b s o r b a n c es p e c 仃ao f h i p p 嘶ca c i d ( h i p ) a i l dh i p h i s - l e u ( h h l ) 从图2 1 可以看出，马尿酸样品在2 2 8 m 处有最大特征吸收，而h h l 在2 2 8 i l i i l 处吸收 不明显，对检测结果影响不大，因此，选择2 2 8 m n 作为马尿酸检测波长。 2 3 2 马尿酸量与峰值关系 使用高效液相色谱法分析检测反应液中的马尿酸，即利用反应产物中马尿酸与其他 组分在液相色谱柱上的保留时间不同来实现马尿酸的分离检测。根据马尿酸标样的 h p l c 洗脱图谱可知，马尿酸的保留时间为8 7 l i l i n ( 见图2 2 a ) ，并且与反应产物中其他组 分分离良好( 见图2 2 b ) ，说明此色谱条件适合。 b 图2 2 标准马尿酸溶液( a ) 及反应液( b ) 的h p l c 图谱 f i g u r e2 - 2t h ep r _ h p l cc h r o m a t o 珊o fs 咖d a r dh i p p u r i ca c i d ( a ) a n dr e a c t i o nm i 砒u r e (