（动物学专业论文）中华绒螯蟹metallothionein1基因全长克隆和cu2诱导表达分析.pdf

2 0 1 0m a s t e rd i s s e r t a t i o n s c h o o lc o d e ：1 0 2 6 9 s t u d e n ti d ：5 1 0 7 1 3 0 0 0 3 3 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y c l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，e x p r e s s i o n ，a n dc o p p e r s e n s i t i v i t yo ft h em e t a l l o t h i o n e i n - 1g e n e i nt h ec h i n e s e m i t t e nc r a b ，e r i o c h e i rs i n e n s i s d e p a r t m e n t ：s c h o o lo fl i f es c i e n c e m a jo r ：z o o l o a y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：r e p r o d u c t i o no f a q u a t i ca n i m a l s t u t o r ：p r o f q u nw a n g m a s t e rc a n d i d a t e ：r e nf e i m a y , 2 0 1 0 华东师范大学学位论文原创性声明 焉翌一喜壤一竺毒主 作者签名： 日期：矽o 年多月g 日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 彬蝴泐黝棚 学位期间在导师指导下完成 范大学所有。本人同意华东 范大学攻读 果归华东师 并向主管部 门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷版和电子版；允许 学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入全 国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版， 采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密 学位论文幸，于 年 月同解密，解密后适用上述授权。 ( z 不保密，适用上述授权。 讫本人签名t 盈 二么 【一 矽p 年6 月8 日 学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权) 。 铺耐 嫠一 桫粼默 雾一 堡飞硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 套和1 勘缴援助师嬲0 厉 叔袁疋教援馋泵嬲久馋 | 闰点凄勘1 缎握 i 一 、j ， 中文摘要 金属硫蛋白( m t s ) 具有多种多样的生理调节功能，包括会属动态平衡、重 金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基以及机体生长发育、生殖衰老、肿瘤发 生、免疫应激反应等各个方面，其研究涉及农业、医药保健、生物工程、环境 保护等各个领域。此外，在一些物种中，m t 和其蜕皮周期波动以及生殖周期 具有某些相关性，在其性腺发育的不同时期体现出不同的表达量，估计可能和 这些物种生物基本金属离子的代谢有关。对于金属硫蛋白的研究，国内外主要 集中在提取、检测以及应用上。但是随着分子生物学技术的快速发展，m t 基 因克隆技术、r n a 印迹技术、g e n o m ew a l k i n g 技术、实时定量p c r 技术应用 于m t 的定量检测和序列测定成为现实。甲壳动物关于金属硫蛋白的研究多集 中在蛋白的提取和纯化上，关于其分子生物学方面的研究相对薄弱，在这之中 大部分研究集中在c d n a 的获得和表达上，而关于其基因结构和功能区分析等 则很少。 中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 是十足目( d e c a p o d a ) 方蟹科( g r a p s i d a e ) 绒螯蟹属( e r i o c h e i r ) 甲壳动物，其自然分布区主要在亚洲北部、朝鲜西部和中 国。早在1 0 0 0 多年前我国就已对中华绒螯蟹的生活习性，特别是生殖洄游规律 有一定的了解。近年来随蟹苗的人工培育和放流增殖，此蟹已遍布全国，是我 国一种重要的经济蟹类。而近年来许多潜在的技术层面的问题也逐步暴露出来， 于是，水生动物分子、遗传等层面的研究日益受到重视，中华绒螯蟹一些免疫 或代谢相关的功能基因纷纷克隆出来，本研究中m t - 1 基因的克隆及研究将为 中华绒螯蟹同后的研究提供一定的理论基础，对于在基因和分子层面研究其免 疫防御机制、转基因技术等方面提供了基础研究理论。 本研究主要结果如下： 1根据es i n e n s i s 肝胰腺c d n a 文库中的e s t 序列分析，应用通用引物 在文库中扩增获得金属硫蛋白基因( m e t a l l o t h i o n e i n 1 ，m t - 1 ) 全长5 7 9 b p 的 c d n a 序列，其o r f1 8 0 b p ，编码5 9 个氨基酸。5 和3 非编码区( u n t r a n s l a t e d r e g i o n s ，u t r ) 分别为8 1 b p 和3 1 8 b p 。该氨基酸序列的半胱氨酸( c y s ) 含量高 达3 0 5 ，并呈“c y s - x - - - c y s ，“c y 铲x i - x c y s ”，“c y 卜x - - x x c y s ”方式排 列。 2 运用半定量和实时定量p c r 分析该基因在各个组织中的表达，发现肝 胰腺中该基因的表达远远高于其他组织，大约为精巢的5 0 0 倍左右；除此之外 在其他组织中，精巢、胸腹神经团、肠中表达量较高，在卵巢、鳃、胃、脑、 血淋巴、心脏和肌肉中表达量很低。另外，运用实时定量p c r ( r e a l t i m e p c r ) 对发育期各月的精巢进行定量检测，发现8 月份m t - 1 基因表达量最高，随后 递减，9 月份急速下降，1 1 月份时达到最低值，随后的两个月中，该基因表达 量显著上升，说明m t - 1 基因可能在中华绒螯蟹精巢发育中起一定的作用。 3运用g e n o m ew a l k i n g 技术得到该基因全长结构。该基因由三个外显子 和两个内含子构成，两个内含子长度分别为9 8 4 b p 和3 8 0 b p ，三个外显子长度 分别为2 5b p ，7 8b p 和7 7b p 。克隆到的该基因全长为3 8 1 6b p ，其中包括1 7 3 5 b p 的5 端侧翼序列、三个外显子、两个内含子和3 端侧翼序列。分析结果显示， 5 端功能区含有m r e 、h n f 1 、a p 1 、s p l 、g a t a 、u s f 及h s f 等反应元件。 4 金属硫蛋白可能对重金属离子具有储运、代谢和解毒作用，因此用不 同浓度c u 2 + ( 0 0 5m g l ，0 1 m g l ，0 5m g l ，1m g l ) 对驯养1 0 天的中华绒螫 蟹进行7 天诱导处理，实时定量p c r 结果显示在0 1 m g l 浓度下，该基因表达 量最高；0 1 m g lc u 2 + 对驯养1 0 天的中华绒螯蟹进行不同时间处理结果显示， 随着处理时间的增加基因表达呈上升趋势，在5 天时达到最高，随后递减。说 明该基因可能参与了中华绒螯蟹体内c u 2 + 的储运和解毒代谢。 本研究借助分子生物学和生物信息学的手段，首次分析es i n e n s i s 肝胰腺 c d n a 文库中的e s t 序列，克隆到其m e t a l l o t h i o n e i n 1 基因的c d n a 全长并验 证其序列准确性。在此基础上，通过g e n o m ew a l k i n g 和实时定量p c r 技术进 一步对该基因的基因结构和表达模式进行分析，这些研究结果为了解中华绒螯 蟹m e t a l l o t h i o n e i n 1 基因的功能提供了基础资料，并为其他亚型和物种m t 基 因的进一步研究提供了新的思路。 关键词：中华绒螯蟹，m e t a l l o t h i o n e i n 1 基因，基因结构，5 ，端侧翼区，精巢 表达量，c u 2 + 诱导表达 a b s t r a c t m e t a l l o t h i o n e i n s ( m t s ) h a v em u l t i p l ep h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n sa n dd i v e r s e r e g u l a t o r ya c t i v i t i e s ，w h i c hi n c l u d em e t a lh o m e o s t a s i s ，h e a v ym e t a ld e t o x i f i c a t i o n ， a n da n t i o x i d a n tp r o t e c t i o nf r o mf r e er a d i c a l s i ns o m es p e c i e s ，m tl e v e l sa r eh i g h e s t a f t e rt h er e p r o d u c t i v ep e r i o d ，p e r h a p sd u et ot h em e t a b o l i cn e e da n db i o l o g i c a l a v a i l a b i l i t yo fe s s e n t i a lm e t a l s ，s u c ha sz i n ca n dc o p p e r t h es t u d yo fm e t a l l o t h i o n e i n s b o t hd o m e s t i ca n da b r o a dw a sm a i n l yi nt h ee x t r a c t i o n ，d e t e c t i o na n da p p l i c a t i o n so f t h ep r o t e i n w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g y , m tg e n ec l o n i n g ，r n a b l o t ，g e n o m ew a l k i n g ，r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c rt e c h n o l o g yf o rq u a n t i t a t i v e d e t e c t i o na n ds e q u e n c i n go fm tw e r ec o m et u r e r e s e a r c h e so nm e t a l l o t h i o n e i n so f c r u s t a c e a nw e r em o r ec o n c e n t r a t e di nt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h ep r o t e i n t h em o l e c u l a rr e s e a r c hw a sr e l a t i v e l yw e a k ，a n da m o n gt h em a j o r i t yi n t h i ss t u d y f o c u s e do nt h ec d n a a c q u i s i t i o na n de x p r e s s i o n ，w h i l ea n a l y s e so ni t sg e n es t r u c t u r e a n df u n c t i o n a la r e a sa r es c a r c e c h i n e s em i t t e nc r a b s ( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) l i v em a i n l yi nn o r t h e r na s i a , w e s t e r n k o r e aa n dc h i n a a se a r l ya s1 0 0 0y e a r sa g o ，c h i n e s ep e o p l eh a v eg o tt h el i v i n g h a b i t so fc h i n e s em i t t e nc r a b s ，e s p e c i a l l yr e p r o d u c t i v em i g r a t o r yh a b i t s i nr e c e n t y e a r s ，t h ec h i n e s em i t t e nc r a bi sac o m m e r c i a l l yi m p o r t a n ts p e c i e si ns o u t h e a s ta s i a ， a n di sw i d e l yf a r m e di nc h i n a i nr e c e n ty e a r san u m b e ro fp o t e n t i a lt e c h n i c a li s s u e s a r eg r a d u a l l ye x p o s e di nc r a ba q u a c u l t u r e ，t h e r e f o r e ，m o l e c u l a r , g e n e t i cr e s e a r c h e si n a q u a t i ch a v eg a i n e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n s ，s o m ei m m u n eo rm e t a b o l i c r e l a t e d g e n e so fe s i n e n s i sh a v eb e e nc l o n e d i no u rs t u d y , m t 一1g e n eo fc h i n e s em i t t e n c r a bw i l lp r o v i d es o m et h e o r e t i c a lb a s i sf o rr e s e a r c hi ng e n e t i ca n dm o l e c u l a ra s p e c t s o ft h ei m m u n ed e f e n s em e c h a n i s m s ，t r a n s g e n i ct e c h n o l o g y t h em a j o rf i n d i n g si no u rr e s e a r c ha r ea sf o l l o w s ： 1af u l ll e n g t hm e t a l l o t h i o n e i n 1 ( m t - 1 ) e d n aw a sc l o n e df r o mt h ec h i n e s e m i t t e nc r a b ，e r i o c h e i rs i n e n s i s ，b a s e du p o ne s ta n a l y s i so fah e p a t o p a n c r e a se d n a l i b r a r y t h ef u l ll e n g t hm t - 1e d n a i s o l a t e df r o mes i n e n s i sh e p a t o p a n c r e a sw a s5 7 9 b p ，w i t ha1 8 0b po r e a n d5 a n d3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ( o ar ) o f8 1b pa n d3 1 8b p ， r e s p e c t i v e l y t h eo r fe n c o d e da5 9a m i n oa c i dp r o t e i na n dt h ec y s t e i n e ( c y s ) m p r o p o r t i o no f3 0 5 ( 18 5 9 ) w a so b s e r v e di na r r a yp a t t e r n st y p i c a lo fo t h e rr e p o r t e d m te d n as e q u e n c e s ，w i t hf i v ei n s t a n c e so fc y s - - x - c y s ，t w oi n s t a n c e so f c y 卜x - - x c y s ，a n dt h r e ei n s t a n c e so fc y “x _ - x x c y s 2 a n a l y s i sb y r e a l - t i m e q u a n t i t a t i v e r t - p c rs u p p o r t e d s e m i - q u a n t i t a t i v e f i n d i n g s ，t h eh i g h e s te x p r e s s i o nw a si nh e p a t o p a n c r e a s ，a p p r o x i m a t e l y5 0 0t i m e st h a t o ft e s t i s ，i na d d i t i o nt ot h i s ，w i t he x p r e s s i o nl e v e l sh i g hi nt e s t i sa n dt h o r a c i cg a n g l i a ， m o d e r a t ei ni n t e s t i n e ，a n dl o wb u td e t e c t a b l ee x p r e s s i o no v a r y , g i l l ，s t o m a c h ，b r a i n ， h e m o l y m p h ，h e a r ta n dm u s c l e m t - 1t e s t i c u l a re x p r e s s i o nw a sa s s e s s e df r o ma u g u s t t oj a n u a r y r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i sr e v e a l e dp e a km t - 1e x p r e s s i o ni n a u g u s t e x p r e s s i o nt h e ns h a r p l yd e c r e a s e di ns e p t e m b e r , w i t ht h es e a s o n a ll o w o b s e r v e di nn o v e m b e r 3t h ec l o n e dm t - 1g e n o m i cs e q u e n c ew a s3 8 1 6b p ，a n di n c l u d e da1 7 3 5b p5 f l a n k i n gr e g i o n ，t h r e ec o d i n ge x o n s ( 2 5b p ，7 8b p ，7 7b p ) ，a n dt w oi n t r o n s ( 9 8 4b p ， 3 8 0b p ) t h a to c c u r r e di na “3 + 2 ”p a t t e n b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so ft h e5 u p s t r e a m r e g i o no f t h em t - 1g e n ep r e d i c t e ds e v e r a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e s ，i n c l u d i n g m r e s ，h n f 一1 ，a p 一1 ，s p l ，g a r a ，u s fa n dh s e 4 e x p o s u r eo fc r a b st oc u 2 + t r e a t m e n tv i aw a t e r ( 0 1r a g l ) f o r1 0d a y s r e s u l t e di nad o s ed e p e n d e n tb e l lc u r v er e s p o n s ei nm t - 1m r n ae x p r e s s i o n ，w i t h e x p r e s s i o np e a k i n g a t0 1m g lc u “at i m ec o u r s ee x p e d m e n t ( o 1 m g lc u 2 + o v e r7 d ) r e v e a l e dm t - 1m r n ae x p r e s s i o ns h a r p l yp e a k e do nd a y5 ，d e c r e a s i n gg r a d u a l l y w i t hp r o l o n g e d e x p o s u r e m o l e c u l a rb i o l o g ya n db i o i n f o r m a t i c sm e t h o d sw e r eu s e di nt h i ss t u d yt o a n a l y s i st h ee s t si ne s i n e n s i sh e p a t o p a n c r e a se d n al i b r a r y w eo b t a i n e dt h ef u l l l e n g t hc d n as e q u e n c eo fm e t a l l o t h i o n e i n - 1g e n e o nt h i sb a s i s ，w eu s eg e n o m e w a l k i n gt e c h n o l o g ya n dr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r t oa n a l y s i st h eg e n es t r u c t u r e a n di t se x p r e s s i o np a t t e r n k e yw o r d ：e r i o c h e i rs i n e n s i s ，m e t a l l o t h i o n e i n 1 g e n e ，g e n es t r u c t u r e ， 5 f l a n k i n gr e g i o n ，e x p r e s s i o nl e v e li nt e s t i s ，c u 2 + m d u c e de x p r e s s i o n i v 目录 中文摘要i 英文摘要i i i 第一章金属硫蛋白及m t 基因研究概述。1 第一节金属硫蛋白研究进展2 第二节m t 分子生物学研究进展9 第三节本研究的目的、意义和技术路线1 3 第二章中华绒螯蟹m t - 1 基因全长c d n a 克隆及表达分析1 5 第一节中华绒螫蟹m t - 1 基因全长c d n a 克隆及序列分析1 5 第二节中华绒螯蟹m t - 1 基因各组织表达情况2 9 第三节中华绒螯蟹不同发育时期精巢中m t - 1 基因表达情况3 3 第三章中华绒螯蟹m t - 1 基因全长克隆及5 ，功能区分析3 7 第一节中华绒螯蟹m t - 1 基因结构克隆及分析3 7 第二节中华绒螯蟹m t - 1 基因5 和3 端侧翼序列克隆及分析4 0 第四章c u 2 + 处理下中华绒螯蟹m t - i 基因表达差异一4 7 第一节不同浓度c u 2 + 处理下中华绒螯蟹m t - 1 基因表达差异4 7 第二节不同时间c u 2 + 处理下中华绒螯蟹m t - 1 基因表达差异5 0 总结5 3 附录5 5 参考文献5 6 致谢6 8 v 2 0 1 0 届硕： ：研究生学位论文中华绒螯蟹m e t a l l o t h i o n e i n 1 皋闪伞长克降和c u 2 + 诱导表达分析 第一章金属硫蛋白及m t 基因研究概述 对于金属硫蛋白的研究已经有5 0 多年的历史，金属硫蛋白( m t s ) 第一次是 1 9 5 7 年美国科学家m a r g o s h o e s 在研究会属生物学作用时，从马的肾脏中以镉结 合蛋白的方式被分离出来，而且该蛋白在几乎所有物种中都有发现，其中有无脊 椎动物( 主要是软体动物和甲壳类动物) ( l a n g s t o ne ta 1 ，1 9 9 8 ；i s a n ie la 1 ，2 0 0 0 ； r o e s i j a d i ，1 9 9 2 ，e n g e la n db r o u w e r , 1 9 9 3 ) ，脊椎动物( 主要是哺乳动物和鱼类等) ( o l s s o ne ta 1 ，1 9 9 8 ；r o e v ae ta 1 ，1 9 9 9 ) ，植物和细菌( h a m e r , 1 9 8 6 ；k 各g ia n d k o j i m a ，1 9 8 7 ) 。它是一种低分子量( c u h g 。m t 富含半胱氨酸且毓基( s h ) 能强烈螫 合重金属，如：汞、银、铅、镉、砷j 铬、镍等，对金属离子亲和力大小顺序 为：f e 2 + c 0 2 + z n 2 + p b 2 + c d 2 + c u “、a g + 、b i 3 + h g “。另外，糖皮质激 素、胰高血糖素和。肾上腺素等激素、禁食、体力限制、高温、寒冷以及由于炎 症和细菌内毒素引起的组织损伤等各种应激、以及c a m p 、干扰素和白细胞介 素1 等其它因素均可诱导m t 的合成( 李淑敏，胡大一，1 9 9 6 ；c o u s i n sa n d l e i n a r t ，1 9 8 8 ；s a t oe ta 1 ，1 9 9 4 ；f r i e d m a na n ds t a r k ，1 9 8 5 ；张保林等，1 9 9 4 ； s h i r a i s h ia n dw a a l k e s ，1 9 9 4 ；g o e r i n ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 金属硫蛋白分类系统于1 9 7 8 年首次通过( i o g ia n dk o j i m a ，1 9 7 9 ) 并于 1 9 8 5 年扩展，并根据m t 的结构的差异和来源的不同将其分为三大类( f o w l e re t a 1 ，1 9 8 7 ；k a j i m a ，1 9 9 1 ) 。 第一类是氨基酸序列中的c y s 位置与1 9 5 7 年从马肾脏中分离出的m t 氨 基酸序列中c y s 位置关系较近的m t 。包括所有脊椎动物m t 和基本结构与哺 乳动物m t 相似的金属硫蛋白；第二类是氨基酸序列中的c y s 位置与马肾m t 的关系较远，与哺乳动物m t 没有或很少有相似进化关系的m t 。如酿酒酵母 和一些原核生物、海胆、玉米及某些高等植物的m t ：第三类是非典型m t ，常 称之为类金属硫蛋白，主要来源于真核微生物，是一类由非转译合成的金属硫 醇盐多肽( r o b i n s o na n dj a c k s o n ，1 9 8 6 ) 。 1 2 金属硫蛋白的功能 m t 从发现至今己有5 0 多年历史，是人类从动物体内发现并提取的生理功 能最多的活性物质。但是目前m t 在生物体内具体承担什么生理功能，仍然是 一个有争议的问题。据目前一些研究报道，已知m t 有多种多样的生理调节功 能，包括金属动态平衡、重金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基以及机体生 长发育、生殖衰老、肿瘤发生、免疫应激反应，增强机体的免疫力和抗应激能 力、参与d n a 的复制、转录和能量代谢的调节过程等各个方面，其研究涉及 4 2 0 1 0 届硕i j 研究生学位论文中华绒螯蟹m e t a l l o t h i o n e i n 1 罐| 大l 伞长克隆和c u “诱导表达分析 农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域。 1 2 1m t 与重金属的解毒 金属离子在生物体内起重要作用，机体内金属离子过多或过少都会导致机 体的病变。m t 在稳定机体内金属离子平衡的过程中起着重要作用。对一些水 生生物的研究报道表明，m t 在生物基本金属元素的调节中起着重要作用，并 对生物非基本的重金属元素有抑制和解毒作用( c a m p b e l le ta l ，2 0 0 5 ；e n d oe ta l ， 2 0 0 4 ) ，是目前临床上使用的最理想的生物螯合解毒剂。 m t 与重金属离子以配位的形式结合成无毒或低毒络合物，而消除重金属 离子对生物体的毒害作用。m t 因其富含半胱氨酸而具有此功能，其c y s 中的 巯基( - s h ) 能强烈螯合汞、银、铅、镉、砷、铬、镍等有毒重金属。 m t 对 金属离子亲和力大小顺序为：f e 2 + c 0 2 + z n 2 + p b 2 + c d 2 + c u 2 + 、a g + 、b i 3 + c d m t - 2 c d m t - 1 ，且m t 对o h 造成的膜损伤具有修复作用( 张宝林等， 1 9 9 2 ) 。不同亚型m t 在清除o h 能力上的差异可能与其构象有关。 除金属离子外，m t 还可以被一些其他因素所诱导诸如糖皮质激素、肾上 腺素和胰高血糖素等激素、电击、高温、寒冷、高氧吸入、精神紧张、饥饿或 接触某些化学类物质，这些因素在导致生物体自由基产生并引起过氧化的同时， 也诱导着机体m t 合成的增加。因此，m t 必然与应激及应激性疾病联系密切 ( 蒋与刚，1 9 9 9 ) 。m t 可以针对不同的氧化性应激因素发挥不同作用，不同亚型 的m t 也可能发挥着不同的生理作用( a m i a r d a e ta 1 ，2 0 0 5 ) ，这具有十分广泛重 要的保护意义。 1 2 4m t 的环保作用 关于m t 和类金属硫蛋白作用的文献越来越多，但是仍然存在着不一致和混 乱现象，尤其是关于其生理作用和在环境监测中作为生物标志物这方面。早在 7 0 年代末，b a y n e 等人就提出，水生生物的m t 水平可作为一种指示水环境污 染物和毒性效应早期警报的生物标志物，以及作为水生环境金属污染评价和监 测的分子毒理学生态诊断指标( b a y n e ，1 9 7 9 ；f u e n t e se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。例如通过检 测水生生物( 如鱼类、甲壳类) 中m t 含量，可推测水质污染情况等。 m t 有一个显著特点就是能在其转录水平上被环境中的金属所诱导，而且 7 2 0 1 0 届硕 ：研究生学位论文中华绒螯蟹m e t a l l o t h i o n e i n 1 基因伞长克隆和c u “诱导表达分析 这种诱导水平与环境中的金属离子浓度具有直接相关性。当周围环境中以及生 物体内的金属含量达到一定的浓度时，才能诱导合成新的m t 。高度诱导之后， m t 能大量地结合重金属离子，因而具有净化环境重金属污染的功能，而水生 无脊椎动物由于种群密度和生物量都异常丰富，其m t 的金属净化功能是非常 可观的( 叶属峰，陆健健，2 0 0 0 ) 。 另外，可以通过基因工程的方法，将m t 基因导入某些微生物或植物体中 建立m t 的高效表达系统，利用这一方法，就可以清除环境中重金属污染，以 及在冶金上采集贵重金属的尾矿或在海水中富集贵重金属等等。如转酵母m t 基因的烟草能显著提高对重金属污染的土壤中c u 2 + 的吸收，以此对重金属污染 区进行补救。 m t 诱导的毒理学研究重要意义已被在水生生物中做的大量研究所支持。 m t 金属结合的概念就是对细胞功能的保护，虽然具体的细胞内相互作用仍有 待澄清。对m t 的正常和毒理功能的进一步探究将有助于更好地了解这一方面。 从实际的观点来说，m t 用于诱导水生动物用来进行金属例行评估仍然是一个 将要实现的想法。一些实例说明，在金属污染的环境中的个体m t 水平增加或 诱导可以用来证明m t 在作为金属暴露的诊断检测标志物上的功能。但是由于 除金属外的其他内外因素均可以诱导合成m t ，而且我们对环境因子对其的影 响尚不完全清楚，因此在用作生物标志物时仍需谨慎。 除上述功能外，m t 被证实的还有下面几种方面的功能。 m t 具有抗电离辐射损伤，提高机体抗辐射能力的作用。各种电离辐射、 紫外线与x 射线使生物体产生大量自由基和一些高度活性物质，损害生物体大 分子( 蛋白质、d n a 等) 是人体损害及体内受损重要原因( m a t s u b a r ae ta 1 ， 1 9 8 6 ) 。m t 在抗电离辐射作用过程中具有直接清除o h 、减少自由基形成的特 点( 范才，1 9 9 8 ) ，因此m t 在组织、细胞中的存在，使其具有抵抗离辐射或紫 外线引起细胞组织损伤，修复细胞损伤的功能。 m t 可结合重金属，消除自由基、紫外线以及电离辐射等不良因素对生 物体的损伤，从而防止它们对生物体的致癌作用，还可以激发生物体的免疫功能， 增强机体抗癌能力。研究表明，在肺癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺癌、消化道癌、 乳腺癌等多种肿瘤中( c h e nl i n x i ne ta 1 ，2 0 0 4 ；b o a i h u ae ta 1 ，2 0 0 4 ；s c h m i de t a 1 ，1 9 9 3 ) ，m t 在其肿瘤组织及周围淋巴结组织中均呈现高表达状态，且m t 高 8 2 0 1 0 届硕上研究生学位论文中华绒螯蟹m e t a l l o t h i o n e i n 1 基冈全长克隆和c u 2 + 诱导表达分析 表达的肿瘤细胞分化程度较低，恶性程度较高( 易石坚，2 0 0 6 ) 。研究表明，m t 只杀伤恶性肿瘤组织，而对正常组织和细胞则伤害很小。在正常肝脏中，m t 浓 度很高，而且以z n m t 的形式存在；而在恶性肿瘤组织中，m t 的浓度则显著 降低。 m t 还可以增强机体在各种不良状态下的适应能力，当机体处于不良状态 ( 烧伤、炎症、饥饿、疲劳、寒冷等) 时，体内m t 含量增加，从而释放z l l 、 c u 、f e 、m n 、s e 、m o 等微量元素，提高其在体内的浓度以激活体内各种应激 酶的活性，从而使机体适应能力增强( 张艳，杨传平，2 0 0 6 ) 。 第二节m t 分子生物学研究进展 2 1m t 基因的研究进展 随着分子生物学技术的快速发展，m t 基因克隆技术、g e n o m ew a l k i n g 技 术、r n a 印迹技术、实时定量p c r 技术应用于m t 的定量检测和序列测定成 为现实，这在m t 分子的生物学研究中有很重要的意义。对于金属硫蛋白在水 产动物中的广泛分布早已是牢固确立的，到目前为止，至少8 0 种鱼类和无脊椎 动物的m t 基因已被报道。其中只有少数种类m t 基因的主要结构已经一定程 度的确定，包括一些鱼类，棘皮动物、软体动物( 双壳类) 和甲壳动物( 十足目) 。 大部分物种的m t 基因还需要进一步研究。其他群体关于m t 基因的信息，特 别是无脊椎动物，将有助于澄清m t 之间的不同类群的亲缘关系。多种亚型的 m t 基因出现在同一个物种中表明，对水生动物m t 基因的进一步认识，将需 要从个体形式的功能和调节来考虑( r o e s i j a d i ，1 9 9 2 ) 。 到目前构成m t 基因家族已经确定的亚型有四种，m t - i ，m