（发酵工程专业论文）淀粉液化芽孢杆菌产β葡聚糖酶的研究.pdf

摘要 d 一葡聚糖酶在糖化过程中能专一性降解p 一葡聚糖，降低麦汁粘度和浊度，加 快过滤速度，提高麦汁得率和品质，在啤酒生产中具有重要作用。本论文主要对 本实验室保藏的淀粉液化芽孢杆菌( 肋c f 盯埘册咖，国w 咖c 把瑚) 5 5 8 2 产p 一葡聚糖酶 的发酵培养基和发酵条件进行了优化，并对固体、液体酶的制备以及p 一葡聚糖酶 的应用进行了初步研究，主要结果如下： 对菌株5 5 8 2 产b 葡聚糖酶的摇瓶发酵培养基进行了优化：玉米粉3 0g ，l ， 大麦粉4 0g l ，豆饼粉3 0g l ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 06g l ，( n h 4 ) 2 s 0 44g l ，c a c l 2o 8 g ，l ，m g s 0 4 7 h 2 01g l ，3 7 发酵6 0h ，p 一葡聚糖酶酶活达到1 2 8 5 5 咖l ，比 未优化时提高了2 6 0 8 。 5l 发酵罐发酵条件优化为：装料系数o 6 ，接种量6 6 7 ，种龄1 8h ，起 始发酵温度3 7 ，2 7h 后降温至3 2 ，通气量1 oi “l m i n ) ，搅拌转速5 0 0 r m i n ，b 一葡聚糖酶活力在5 1 7 5h 达到1 8 2 5 2u m i ，比恒温发酵提高了2 8 ； 发酵高峰期p h 值在7 2 左右。 8 0 0 0l 发酵罐中o 2 4h ，菌体数量增加较快，b 葡聚糖酶活力增加较慢， p h 下降；2 4 4 0 l l ，p h 回升，p 一葡聚糖酶活力上升；4 0 4 7 h ，菌体出现自溶现 象，b 一葡聚糖酶在4 6h 达到2 4 9 6 妇l 。 发酵液中添加硅藻土1 ：c a c l 22 ；n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 后搅拌均匀，过 滤；向澄清酶液中添加4 辅料和6 0 饱和( n h 4 ) 2 s 0 4 盐析，压滤；5 5 干燥得 成品固体酶。甘油1 2 0g l 、黄原胶5g l 的复合稳定剂和1g l 防腐剂对p 一葡聚 糖酶的保护作用最好，室温下保存4 个月，酶活保留率达8 9 5 ，比对照高1 9 5 。稳定剂不会影响该酶液的使用效果，同时对酶有很强的保护作用。 在糖化过程中添加lu 幢麦芽的b 葡聚糖酶，麦汁中的p 一葡聚糖含量和粘度 明显降低。应用效果与国外同类产品相当。 关键词：b 葡聚糖酶；培养基优化；发酵条件优化：提取 a 瓤红键e l i tw a sv e r yi m p o r t a n tf o r 协eb e e rb r e 诵n gb yu s i n g 柏ep 嘈i u c a n 端ei nt h e m a s m n g t h op 崞l u c a i lc 伽j db ed e 融d e db yp 一8 l u c a n a s es p e c i a l l y ，m ev i s c o s i t ya i l d u r b i d i t yo fw o r tc o 越db ed e c a s e d ，啦ev e 重o c i t yo fw o n 矗i 娥嫩o nc o u l db ei n c r e a s e d 鞠蠢疆辖珏越至| ya 珏dy i e l d 醑w o 臻c o 癌dk 弧辩v 礤b y 潞i n g 垃掉多* g l 精e 徽a ，豫。 m e d i t 埘lo fs h a l ( 诗g 窍a s k 角勰蹦t 鞋t i o na l l d 托哟e n 辆t i c 嗽e o n d i t i o 蠡o f 您愀n t o ro f p r o d u c i n gp w g l u c 柚a s ew a so p t 蛔i z e db yt 1 1 e 占臼c 溺孵甜勘的甜啪。如础s 5 8 2w l l i c h w a ss t o r e d 地t h el a bi nt h i s 如e s i s 。t h ep r e p a r a t i o 糠p c e s s i l 蟮o fs o l i d 张dl i q 试d e 壬l 拶m ea 辩di 重s 蹲p l i 哪i o nw a ss t u d i e d 簿m a 蛀呈y tt 甄。搬a n 糟s u l t sw e f ea 8f o l l o w s ： 豫黼嚣d i 毛鼍难s 妇妊薮g 曩黼妇齄燕拯拯涵匦醴瓿淞球镩妇国够蓐溺阮 5 5 8 2 w 醛e o 髓d t 艟钯d + h ee p 自髓蔽m e m 啪霉锄p 。s 楚。甄s 毯纯) w e 瓣d e t c 翻蠢魏礴鑫s ：b 畦e y f l o 灌4 筑c o m 霸o u f3 0 ，酶a nn o 璐3 0 ，n a 2 璎0 4 1 2 璃o 毽( n 王 4 ) 2 s e l 44 ，m g s 0 4 * 7 2 0 l ，c a c i 2 0 葚hw a s 稻m l e n t e do n3 7 f o r 6 0h ，t l 碲p g l u c a i l a s ea c t i v i t yw 黼1 2 8 5 5 u 斑正，w l l i c hw a s 洫c r e a s e db y2 6 0 8 c o m p a r e d 稍mm eo r i g i n a lm e d i u m h 15la m o m a t e d j a r 诧n n e n t o 玫协eo p t i m a lf e r m e n t a l i o nc o n d 湎o nw 黼：也es e e d 鞭$ 窭重c 量l 嬲溅攮6 6 7 a f 融喇姐 n g sh 。码ef e 搭致e n 镳t i 。n 糟m 辨f 妇聪w 辎3 7 | l l 懿w 鑫sc o o l e d 协3 2 熊e f2 7h a 蟊v o l 埘l ew 鑫slu n l l n ) a 矗dw 8 s a g i 协t i o n8 p e 融w a s5 0 0r m i n ，t 辟一g l u c a l l a s e 神t i v i t yw a s1 8 2 2u _ l l ir hw a s i n c r e a s e db y2 8 c o m p a r e dw i t hm ec o l l s t a l l tt e m p e 艄乱l r ef e m l e n t a t i o n 协ep h 嘲 a b o u t7 2i n 船娌n e n t a t i o np e a k 曩皓p i i o ts e a 王e 娌蚴l 揪塔扭v e s 姆窿矧纽壕e8 o 王l e n 建。n 毒。芄o 矗i 船磁l 睫rw 豁i 猷黯a s e d 碡蟠e 瓣yi n2 氏w 魅k 氇o - 瘿u c a 魏a s ea c t i 旗等w 然i n 材e 鑫s 。程 s l o w 玲a 趟p 醚娜d e e 黼s c d 1 ，持p 一西u c 矗髓s ea 姐i v i t yw a s i 矗c 诧纛s 矗。融2 审4 0h ， 勰d t h e n w a s 黼a c h 巷d 2 4 9 。6 黼箍f b f 4 6 h 嗣1 e c e l l w a s a u 毫o l 删破德a t t i 瑚e 1 礴a 协r n i t e ，2 c 嬲i 2a n d2 n 勉 擀i 。1 4 - 1 2 h 2 0w a sa d d e dt 。m e 酝嗤把n t a c i o nl i q l l i d 4 a d j u n e ta n d0 硅 4 ) 2 s 0 4w i t i l6 0 s8 _ t u r a 醢o nw a s 嬲d e dt o 也e 甄翡l 张z y 搬el i 辨i d 礁懿a 瘿键i o 琏黼d 蠡l 妇差i 姐。f i 搬移镪es 痰疆龆z y m e 糊sg e 载懿 a 最e rd r y i 羲go n5 5 豫e 一g l u e a n 鑫s e 鑫c t i 移溆魄es o l 糠i 麟1w a sp 埯t e c t 艇w 1 w i 也m oc o 瑚【p l e x8 t a b i l i z e r n t a i 试n g1 2 0g ，i 。g l y c e m la 1 1 d5 酊x a l l t h a ng u ma l l dl g ，ls o d i l l mb e n z o a t e n l er e l a t i v e l yp g i u c a n a s ea c t i v i t y 、v a s8 9 5 s t o r e do nr o o m t e m p e r a t u 嫦谂r1 2 0d a y s i tw a si 糟8 s e db y1 9 ，5 c o m p a m g 谢t ht h ec o n 舡舒i 。 ! 艇+ 掰“e 勰挫誊e 嫩越d s e 。s 妇醴鞘斌黼s 妇删。泌i o 淞骖b y 嬲d 遗g 争菇n e a n a s e 溉专量蛤强a s 融g 晒ml 醢篷擞a l l ，飘瞎彝露l l e 融妇l 鞲s u 廷麟s 娃n i l 鞭旗热 乙醇 甲醇。丙 酮的沉淀能力最好，但挥发损失多，价格相对较高，所以工业上采用乙醇为沉淀剂的居多。 作者选用乙醇来沉淀酶液，结果见图4 3 。 由图4 3 可知：无水乙醇加量越大，析出的酶量越多，但是浓度达到4 5 时，b 一葡 聚糖酶的理论提取率也只有6 8 ，导致生产成本过高而不适合工业化生产。所以本文对 其酶活得率不做进一步讨论。 4 3 2 7 干燥 酶溶液或含水量高的酶制剂，即使置于低温下也是极不稳定的，只能作短期的保存。 为了便于酶制剂的较长时间的运输，保藏，防止酶的变性，变质，往往需要对酶进行干燥， 制成含水量较低的制品。不同的干燥温度对酶活的影响见图4 4 所示，干燥得率见表4 9 。 干燥温度( ) 图4 4 干燥温度与酶活关系 f 追4 4t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ne n 巧m ea c t i v i t ya n dd r i e dt e m p e r a t u r e 表4 9 干燥得率分析 t a b l e4 - 91 1 1 ea i 】a l y s i so f t l l ee n 驴ea c t i v 崎a f i e rd r i e d 盐析后湿滤饼酶活( 幢)相同滤饼干燥后酶活( p 幢)干燥后得垩型 b 一葡聚糖酶 4 5 8 8 54 4 1 39 6 1 7 由图4 4 可知：在6 0 以下时，b 一葡聚糖酶的活力变化不大，超过6 0 时，p 一葡聚 糖酶的活力才有下降的趋势。因此最终选择5 5 进行干燥。 加 0 第四章d 一葡聚糖酶制各及其应用的初步研究 4 3 2 8b 一葡聚糖酶固体酶制备过程各阶段得率汇总 表4 1 0b 葡聚糖酶提取过程中各阶段得率 t 曲i e4 1 0t h ep 一百u c 柚a s ep e r c e n to f s e v e m lp h a s s eo f p i c k - u pp r o c e s s 注：过滤酶液为1 5 0 n i l 综上所述，p - 葡聚糖酶固体酶制备工艺为：发酵液中添加硅藻土1 ；c a c l 22 ； n 8 2 0 4 1 2 h 2 02 后搅拌均匀，过滤；向澄清酶液中添加4 的辅料和6 0 饱和 ( n h 4 ) 2 s 0 4 盐析，压滤；所得滤饼在5 5 下干燥，即得成品固体酶。 4 3 3 液体酶的制备 4 3 3 1 超滤膜孔径的选择 为了选择合适孔径的滤膜进行超滤操作，分别选择了5 ，o o o 、l o ，0 0 0 ，3 0 ，0 0 0d a 孔 径的滤膜进行实验，结果见表4 1 1 。 由表4 - 1 1 可见，浓缩倍数为3 时，选择孔径为3 0 ，0 0 0d a 的滤膜进行过滤时，其b 葡聚糖酶的损失率远高于孔径为1 0 ，0 0 0d a 的滤膜。在选用5 ，o o od a 孔径的滤膜时，滤速 慢，操作时问长，并且压力不断上升，因而选择孔径为1 0 ，0 0 0d a 的滤膜。 表4 1 1 超滤膜孔径的选择 t a b l e4 一l lt h ec h o i c eo f t l l ea p e r c u r eo f u l t r a n l n 钲i o nm 锄b r 锄e 4 3 3 _ 2 浓缩倍数的选择 由图4 5 可见，浓缩倍数在大于3 时，b 一葡聚糖酶酶活都随着浓缩倍数的增大而失活 图4 5 浓缩倍数与b 一葡聚糖酶酶活的关系 f i g 4 - 5t h e 陀l a t i o l l s h i pb e “v c e nc o n d e i l s e d m u l t i p i ea i l dp - g l u c a l l a s ea c t i v i t y 罾 蝗 诺 莨 翼 磊 一抽滤液卜浓缩液 图4 - 6 不同酶液的稳定性跟踪试验 f i g 4 _ 6s t a b i l i t yi i ls t o r a g eo f s e v e r a ll i q u i d e m 可m e 江南大学硕士学位论文 严重。因而，选择浓缩倍数为3 倍。 碡3 3 3 一蘩聚糠酶豹稳定燃放萎试验 为了考察捕滤液的稳定情况，分剐锻丽一批次豹獭滤液和浓缩液在冰箱中放嚣一段薅 间，而后分别测定其b 一葡聚糖酶酶活。结果见图4 6 所示。 由图4 6 可知，放置2 2 天后，抽滤液辟一葡聚糖酶酶活降低了1 5 ，而浓缩液p 葡聚 赣酶酶活降低了7 8 2 ；敖嚣毒l 天螽，臻滤滚争羲装糖酶酶活辫低了2 2 。5 ，浓臻渡一 葡聚糖酶酶活降低了3 0 1 7 。由此可见，在液体酶的放置实验中，如果不添加任何酶稳 定剂，要长期而有效的保持液体酶的稳定性是不可能的。 4 + 3 3 。48 一蘩聚糠酶稳定裁的选择 酶结构串影确酶稳定秣静因素：珑水籀互俸雳、氯键秘离子键、二硫键数爨等因素； 环境因素：滤度、p h 、酶的浓度、在一定溶液条件下，酶的一些化学基团会发生化学反 威、肽键的自身断裂等都会影响酶的稳定性。提高酶的稳定性主要肖三种途径：基因水平， 涮用基嚣技零，对溅a 袋默a 逶嚣改造或骖馋，潋麓获 ! 霉馥学缀摇更为合餮鹃酶。该 法的成本较为昂贵；酶分子水平：酶分子的化学修饰怒在分子水平上对酶分子避行改造， 将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别魁县有生物相容性的大分子进行共价 浚接，从丽改变酶学性质的技术；添加粼对酶鲍稳定佟用，比前藤的方法来褥蠢接，更易 掇律。 ( 1 ) 明胶对p 。葡聚糖酶的保护作用 明胶对酶的保护作用，可能是由于蛋白质表面相氨作用区域排除了水，因而降低了自 囊缝，增鸯瑟了蟹鑫屡豹稳定性群l 。为了遴一步磅究弱蔽对酶夔保护l 睾弱，分别淘薅渡中 添加不同浓魔的明胶，用襄验方法4 2 6 3 ( 4 ) 对酶液避彳亍处理，测p ，葡聚糖酶剩余酶活， 结果见图4 7 。 由匿4 7 可知，随着明胶浓度的增加8 ，葡聚糖酶的残留酶活逐渐舞高。当骥胶浓度增 歪o 8g 毽对转，麓聚糖酶残黧酶活最高运1 9 4 6 韵吐，院空鑫残整酶活提毫2 9 ? 3 。 ( 2 ) 黄原胶对p ，葡聚糖酶的保护作用 黄原胶大分子具有网状结构可产生筛孔效应，对较小的酶蛋白分子进行空间限位口”， 减少了酶分子之闯豹楣互磁攘，在一定獠疫上提高了瓣分子豹热稳定经：亲农瞧焚骧胶大 分子的加入使褥水豹自由魔褒小，加强了酶蛋白分子的疏水相互作用。黄原胶大分子上的 一些疏水基团与酶分子表面的疏水区域域孔发生疏水相互作用，馒酶吸附于大分子介质 上，增加了酶分予表面的豢水性，也就掇瘫了酶的稳定性。为了进一步研究黄原胶对酶的 僚轳律蕊，分裂怒酶滚串添热不翼浓度煞蓑骧菠，灞实验方法4 2 。6 3 ( 4 ) 对酶滚送行蹩理， 测d - 葡聚糖酶剩余酶活，结果见图4 8 。 由图4 8 可知，黄原胶对b 葡聚糖酶的稳定性有一定的影响。程试验所选的黄原胶浓 度菠藿内，黄疑胶浓疫对饕聚羲酶稳定瞧的影响袭瑷出最逶浓度效应。在黄驻胶浓凄 为6g ，l 对p 葡聚耱酶残留酶活最高达1 8 9 9 5u 翩l ，比空自残馨酶活高2 6 6 3 。 第四章b 葡聚糖酶制备及其应用的初步研究 蘸h m 蘸h m 00 20 40 60 8 明胶添加量( g 几) 图4 7 明胶对b 一葡聚糖酶热稳定性的影响 f i g 4 - 7e 饪b c to f 9 1 u t i no nt 1 1 em e m o s t a b i l i t y o 邛一9 1 u c a n e ( 3 ) 甘油对p 一葡聚糖酶的保护作用 02468 黄原胶添加盘( g 几) 图4 - 8 黄原胶对b - 葡聚糖酶热稳定性的影响 f i g 4 8e 仃e c to f x a n t h a i lg 啪o nt h et h e n l l o s t a b i l 时 。邛- g l u c a l l a s e 糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇口e g ) 等一般 被称为蛋白质的共溶剂。过去，共溶剂对酶的稳定机理一直被认为是在酶分子表面形成一 个保护壳。近几年的研究表明，共溶剂对酶的保护作用机制实际上是共溶剂的加入改变了 溶液的热力学性质，使得酶的稳定性得到增强，理论上称优先排阻作用【3 “。共溶剂从酶 表面的优先排阻并不是说共溶剂分子绝对不能渗透到酶表面并与之结合，而是在酶表面完 全水化和共溶剂完全结合之间建立起一种平衡。在这些共溶剂的应用中，可根据共溶剂与 酶的相互作用的不同来加以选择。糖类是酶蛋白在溶液中的和在干燥状态下的较好的稳定 剂。甘油和多元醇除了对酶的非极性表面有很好的稳定作用外，还能诱导蛋白亚基的自我 聚合并具有减轻器壁吸附和防冻的作用。为了进一步研究甘油对酶的保护作用，分别向酶 液中添加不同浓度的甘油，用实验方法4 2 6 3 ( 4 ) 对酶液进行处理，测p 一葡聚糖酶剩余酶 活，结果见图4 9 。 2 4 0 罩1 8 0 0 嚣1 2 0 锚 蒸6 0 器 o3 06 09 01 2 0 甘油添加量( g 几) j u 蜒 硅 髓 嚣 醮 耀 1 7 0 1 6 5 1 6 0 1 5 5 1 5 0 1 4 5 1 4 0 o1 1 7 2 3 43 5 l46 8 氯化钠添加量( g l ) 图4 9 甘油对b 葡聚糖酶热稳定性的影响图4 1 0 氯化钠对p 一葡聚糖酶热稳定性的影响 f i g 4 - 9e 髓c to f 寸y c e r o io nt 1 1 et h e m o s t a b i l i t yf i g 4 一l oe 仃e c to f s o d i 岫c h o l r i d eo n t h em e 丌n o s t a _ o f p g l u c a i l a s eb i l n y o f p 9 1 u c a i l a s e 由图4 9 可知，随着甘油浓度的增加b 一葡聚糖酶的残留酶活逐渐升高。当甘油浓度增 疆鬻大学硕士学位论文 歪1 2 0g ，l 时p 一葡聚糖酶残留酶活最高达2 0 3 8u m l ，比空白残留酶活高2 9 8 9 。甘油 都对彝一篱聚糖薅豹稳定程蠢一定鳇帮秘，默或本弱效鬃方覆考露，选捶营潼1 2 0g 毽。 ( 4 ) 氯纯铺对毋葡聚糖酶的保护作用 金属离子对酶的影响怒多方面的。有些金属离子作为酶分予的一部分，影响酶的活性 殿酶的专一性，有些金属离予起活化剂的作用。金属离子不仅可以影响酶的活性，还可以 影确酶蓖稳定整阑。尧了逡一多磅究氯能镳对酶秘僳护箨矮，势刚惫酶滚串添热不霹浓度 的氯化钠，用实验方法4 2 6 3 ( 4 ) 对酶液进行处理，测p 葡聚糖酶剩余酶活，结柴见图4 1 0 。 由图4 1 0 可知，随着氯化钠浓度的增加b 一葡聚糖酶的残留酶活逐渐升高。当氯化钠浓 度煺至4 6 s 始辩一莓聚糖酶残整酶活最薅这1 6 9 。8 珏触毛，魄空皂残磐薅活毒1 6 5 。氯亿 钠在一定程壤土可提高8 麓聚糖酶的稳定性。 ( 5 ) 复合稳定剂对d 一葡聚糖酶的影响 鉴于上述几种稳定剂对6 葡聚糖酶旃不f 司程度的保护作用，因此选用黄原胶、甘油、 赘菠、n l 这4 释秘震，设计西霾素三窳平b ( 3 冬委交试验，霞豢及泰平竣诗戴褒4 1 2 ， 藏交试验结鬃见表4 1 3 。 表4 1 2 正交实验因素水平表 强b l e 耷1 2 码e l e v e l f a c 瓣o f 卿e n d 量c u l a r e x p e 疽m e n 宅 表4 一1 3 复合稳定裁对争羲聚糖酶热稳定性的影嗡 t a b l e4 1 3 e 行e c to f c o m p l e xs t a b l i z e r o n t l l e m e 盯n o s t a b i l i i y o f p 鸣l u c 鲫a s e 实验号别甘浊黄原胶明腔n l 争葡聚耱酶酶活州m l ) l 2 3 4 5 6 7 s 9 8 - 葡聚糖酶酶活k 1 务羲聚糖酶酶滔k 2 b 一蔼聚糖酶酶活黼 极差 llll 8 8 3 l 12 2 2 1 9 4 0 4 l333 1 9 2 ，8 5 2l23 9 1 7 3 223l 2 3 l 23l 2 2 0 1 1 8 3l32 2 l s 4 5 32|3 2 2 9 。7 3321 2 1 7 4 4 5 7 5 25 9 5 4 96 1 9 1 96 0 6 0 6 5 粥2 2 6 2 4 泌 6 ，2 l 6 1 0 6 7 6 6 2 ，5 96 i l 4 76 0 8 6 6 1 42 8 6 9 3 72 8 5 61 59 882 2 第四章d 一葡聚糖酶制各及其应用的初步研究 注：处理前浓缩披酶活为4 2 0 u l l l 。 由表4 1 3 可知，加入复合稳定剂后，残存酶活大部分高于各种稳定剂单独使用时的 残存酶活。其中甘油对b 一葡聚糖酶稳定性的影响最明显。稳定剂的最佳配比组合是甘油 1 2 0 班，n a c l5 8 5 9 l ，明胶o 6 9 l ，黄原胶5 9 ，l 。 f 6 1 验证实验 为了进一步确定保护剂的最佳配比组合，进行了以下验证实验，结果见表4 1 4 。 经试验发现，配比一组合的稳定剂，b 葡聚糖酶经6 0 、1h 处理后，酶活保留率比 对照( 以不加稳定剂的原始酶液作为对照) 高出2 7 9 6 ，而选用甘油1 2 0g ，l ，黄原胶5 g i ，的组合的稳定剂，酶活保留率比对照高出2 4 3 。从降低成本考虑，选用组合甘油1 2 0 g ，l ，黄原胶5g l 作为液体酶的稳定剂。 f 7 ) 添加有稳定剂的液体酶稳定性放置试验 d 一葡聚糖酶的保存试验在室温下进行，不加防腐剂的酶液很容易发生霉变，因此考虑 在酶液中加防腐剂。将一定量的浓缩酶液分为三等份，第一份为酶的磷酸缓冲液，第二份 为添加甘油1 2 0g l ，黄原胶5g l 的酶液，第三份在第二份的基础上再添加1 9 l 苯甲酸 钠的酶液，分别于洗净灭过菌的试剂瓶中，室温放置四个月( 1 2 月初至次年4 月初) ，测 定各自的酶活保留率，结果见表4 1 5 。 表4 一1 5 葡聚糖酶的储存稳定性 t 曲1 e4 - 1 5s 讪i l 时o f g l u c 锄a s ed u r j n gs t o 孵 由表4 - 1 5 可知，复合稳定剂加防腐剂对b 葡聚糖酶的保护作用最好，在室温下保存 四个月，酶活保留率达8 9 5 ，比对照高出1 9 5 。 ( 8 ) 添加有复合稳定剂的p 一葡聚糖酶的应用试验 将加有稳定剂的酶液和原酶液分别以lu 垃麦芽添加量同时加入到糖化醪液中，进行 协定糖化，所得麦汁检测结果如表4 1 6 所示。 由表4 1 6 可知，添加有稳定剂的酶液在使用过程中，并没有影响该酶液的使用效果， 并且还对酶有很强的保护作用，以便使酶发挥效果更显著。在制备液体酶的时候还需要添 扛南大学硕士学饭论文 加lg l 的苯甲酸钠防腐剂。 表4 一1 6 堵i 聚糖酶鲢崖魈试验绩票 t 硅b l e4 一1 6t h e 印p l i c 8 i i o no f p * g l u c 黼a s ei nm a s h i 雌 4 3 0 萤撩s 5 黢声争篱聚糠薅稳寂弱试籍 4 3 + 4 1 糖化过程中口一葡聚糖的溶解情况 资定糖德邋稷孛麓聚糖溶疆穗撬凳窝4 一l l 。凑鍪4 一l l 可躲，势窳蕤鬣过程孛 麓聚耱豹大量滚滚是在4 5 、3 0m i 珏除敷。 s 。 警 一温度 一一葡鞋糖 霭4 _ ll 耨定耱戳过程孛秘麓蒙耱鹣溶簇魏簸 f 谵4 - 】l 翔ed i s s 。l 喇c 瑚e 争垂u c a nd 蜮n gc o n v e n t o 娃s 韪c c b 硪f l c 8 畦o n 4 。3 4 2 协定糖纯巾b 葡聚糖鹬应掰条件的研究 ( 1 ) 葡聚糖酶添拥量的研究 蘑产麦芽 ，缀缨耪箨嚣较菰雄费定方法逶嚣糖耗，璺争麓聚耱瓣熬瓣热量分剩为蛰， 1 ，2 。5 ，5i 垤麦芽时，麦汁质量结果见袭4 1 7 。 由表4 ，1 7 掰翔，当p 葡蒙耱酶的添麓薰为l 堍麦芽时，争麓聚耱显藩降低，麦汁旗 艘瞧降低；并纛警转一羲聚糖瓣燕羹灌长至5u 穗麦芽瓣，努* 饕聚耱禽鬃舞8 0 4m b ，蘧发 逛下簿了诲多。 表4 - 1 7b - 葡聚糖酶添加量对囊汁指标的影响 粉l e4 一1 7 嚣彘c to f 氇嚣c o n c e n to f 势g l u c 鞠a 辩锄w o 难i n d 溉 注：表中掰毒参数坶聪辑按为8 ，6 弩麦汁 ( 2 ) p - 葡聚糠酶添加时问的确定 酶加入位点分别为糖化越始，4 5 结粜和7 0 开始，s - 葡聚糙懿添加凝为lu 趣麦芽， 么n 厂一 第四章b 葡聚糖酶制各及其应用的初步研究 酶作用效果如表4 1 8 。 表4 1 8b 葡聚糖酶添加时间对麦汁指标的影响 t a b l e 4 - 1 8e 能c t o f a c c e s s i o n t i m e o 邛一g l u c a l l a s eo n w o r t i n d e x 注：表中所有参数均已折换为8 6 。p 麦汁 由表4 1 8 可知，在4 5 结束时加入酶制剂，作用效果最好，b 一葡聚糖降低最多，粘 度也降低了。该实验结果同时也说明了使用的酶制剂温度适合范围为较广。 ( 3 ) p 葡聚糖酶作用p h 值的确定 糖化开始前用稀磷酸调节醪液p h 值，考察不同p h 值对酶作用效果的影响，结果如 表4 1 9 。 表4 - 1 9 麦汁p h 对争葡聚糖酶应用效果的影响 t a b l e4 1 9e f f h to f 、v o r tp h0 n 争g l u c 柚a s ea b i l 时 注：表中所有参数均已折换为86 。p 麦汁，酶的添加量均为1u ，g 麦芽 麦芽糖化过程中，要求p h 值在5 2 - 5 8 之间，以利于麦芽自身的水解酶的作用。由 表4 - 1 9 可知，p h 值在5 1 - 5 9 范围内p h 对自制p 一葡聚糖酶作用效果均无大的影响。 4 3 4 3b 一葡聚糖酶在国产麦芽协定糖化中的应用 表4 - 2 0b 一葡聚糖酶对麦汁指标的影响 t a b l e4 2 0e 舵c to f m ec o n c e n to 邛- 百u c a t l a s eo nw o r ti n d e x 注：表中所有参数均已折换为8 6 。p 麦汁 由表4 1 7 和表4 2 0 可知，不同的麦芽样品尽管b 一葡聚糖含量有较大差异，但在糖化 过程中添加适量p 葡聚糖酶后，均能将麦汁中的p 葡聚糖含量及麦汁的粘度降低到合格 范围内。 4 3 4 4 不同酶在协定糖化中应用效果的比较 江南大学硕士举位论文 分别在协定糖化时添加自制p 一葡聚糖酶与商品p - 葡聚糖酶，测定麦汁的p 葡聚糖和粘 度，结粟见表4 t l 囊示。 由袭4 2 1 可以看出，自制b ，葡聚糖酶在糖化中的添加效果与国外同类产品相当。 袭4 - 2 】不同酶的应用效果比较 t a b l e4 - 2 1t h ec o m p a r a t i o no f s “e r a le n 巧m e su s e d nm a s h i n g 注：袋中所有参数均已折抉为8 6 叩蠹汁r 酶的添加量均为1 吨麦芽 4 4 本牵小结 l + 韵滤麓窥絮凝裁懿最经添热爨为：硅藻主1 ；c a c l 22 ；n a 2 狂，。4 1 2 遵o2 。6 0 饱和度( n h 4 k s 0 4 进行盐析，5 5 干燥得固体酶。p * 葡聚糖酶的盐桥得率和干燥得率 分别为9 2 。1 7 和9 6 。1 7 ； 2 使用孔径l o ，o o od a 的超滤膜，浓缩3 倍后，p 一葡聚糖酶损失为1 8 。 3 经正交试验，甘油1 2 0 9 甩，n a c l3 5 lg ，l ，明胶lg ，l ，黄原胶5 9 现缀合为最佳盼稳 定剂，考虑成本，选用甘油1 2 0 9 ，l ，黄原胶5g 几的稳定剂，在室潞下保存4 个月， 酶活保留率达8 9 。5 ，比对照高1 9 5 。添由b 有稳定刹的酶液在使用过程中，并没裰 影响该酶液的便用效莱，并鼠还对酶有很强的保护作用。 4 糖化过程中添加自制p 一葡聚糖酶lu 幢麦芽时，p 葡聚糖含缀和麦汁粘度明鼠降低， 添翻效果与嚣矫同类产品籀警。 第五章主要结论与展望 第五章主要结论与展望 5 1 主要结论 1 对一株产d 一葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌发酵摇瓶培养基进行了优化：玉米粉3 0g l ， 大麦粉4 0g l ，豆饼粉3 0g l ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 06g l ，( n h 4 ) 2 s 0 44g i 。，c a c l 2o 8 虮， m g s 0 4 7 h 2 01g l ，3 7 恒温培养6 0h ，p 一葡聚糖酶酶活达到1 2 8 5 5u m l ，比优化前 提高了2 6 0 8 。 2 5l 发酵罐优化后的发酵条件为：装料系数o 6 ，接种量6 6 7 ，种龄1 8h ，起始发酵 温度3 7 ，2 7 h 后降温至3 2 ，通气量1 ol “l m i n ) ，搅拌转速5 0 0 r m i n ，b 一葡聚 糖酶活力在5 1 7 5h 达到1 8 2 5 2 妇l ，比恒温发酵提高了2 8 ：发酵高峰期p h 值在 7 2 左右。 3 8 0 0 0l 发酵罐的发酵初期( o 2 4h ) ，p 一葡聚糖酶活力增加速度较慢，p h 呈下降趋势； 发酵中期( 2 4 4 0h ) ，p h 回升，p - 葡聚糖酶活力依然上升；发酵后期( 4 0 4 7h ) ，菌体 出现自溶现象，b 葡聚糖酶在4 6h 达到2 4 9 6u m l 。 4 发酵液中添加硅藻土1 ；氯化钙2 ；磷酸氢二钠2 后搅拌均匀，过滤；向澄清 酶液中添加4 辅料和6 0 饱和硫酸铵盐析，压滤；在5 5 下干燥得成品固体酶。 5 甘油1 2 0 班、黄原胶5 l 的复合稳定剂和lg l 防腐剂对p 一葡聚糖酶的保护作用最 好，室温下保存4 个月，酶活保留率达8 9 5 ，比对照高1 9 5 。稳定剂不会影响该 酶液的使用效果，同时对酶有很强的保护作用。 6 当p 葡聚糖酶的添加量为lu 幢麦芽时，p 葡聚糖显著降低，麦汁粘度降低。添加效果 与国外同类产品相当。 5 2 课题展望 1 由于时间关系，没有对菌株5 5 8 2 产d 葡聚糖酶的中试条件及过程进行详细研究，在今 后的工作中可以考虑在发酵过程中进行流加碳源或氮源，控制适宜的p h 值和通风量， 建立发酵动力学模型等研究，进一步优化d 葡聚糖酶发酵的工艺，为实现p 一葡聚糖酶 的工业化生产提供条件。 2 由于实验室条件和大生产条件相差甚远，没有对菌株5 5 8 2 产b 一葡聚糖酶的成品制备进 行成本核算，在今后的工作中可以考虑在大生产条件下对成品制备进行成本核算，进 一步降低成本，提高该酶的市场竞争力。 江南大学硕士学位论文 致谢 本论文是在攀崎副教授的精心指导和关怀下究成的，李崎老师在实骏过程中的耐心指 鼯、嚣簿瓣知识耧严谨煞治学态发镬作者受益篷浅，在魏特自我鹃导繇李靖副教授致戳最 诚挚的谢意和敬意，感谢导师三年来在日常生活和学习巾对我的关心和照顾! 曩辩非豢感瀣实验鏊蹶謦赞教授、臻键裂教授、李永锤老群、郑飞云老帮、魏克弱老 师、孙军弱老师、以及生物制药实验室许正宏老师等。他们在作者论文研究过程给予了许 多撵导秘龌嬖。感滤老耀褒为我翻造了一令莛簿豹学习骡壤。 特别感谢研究生林小杰、刘燎、严敏、向阳、林先举、王晓丽、方华、林小荣、朱俊 勤、赵海蜂、刘霉等在实验过程中给予瓣帮助以及提出憋宝贵意觅羁建议。 另外，在本论文研究过程中还得到了本实验赛郝荣华、龚庆芳、刘群涛、朱林江、鞯 凯、王璐、孙珙璐、转佳、蔡国林、李莲e 军、孑l 维宝等磷究生的帮助与支持；以及中心突 骏室卢晨老师等的指导与帮助，在此一并表示感谢。 还有我的同学刘俊、葛向阳、陈羲、袁红玲、张义萍、何俊蜂、刘体伟、瓤众玲、刘 惑钰、汤蕾、艾黼静等，他们对作者实骏论文写作、日常生活等方面都给予了缀多帮助， 特别表示感谢! 你们的帮助使我的课题褥以顺利的开展，我将永远珍惜与你们建立的深厚 友谊。 感谢其他所肖生工硕研2 0 0 3 级的同学给予的勉励和帮助。 感谢所有关心我静黼学和瑟友! 最后，作者对时刻牵挂着我为我无私奉献的爱人和父母表示最真挚的感谢和思念! 郝秋娟 2 0 0 6 年5 旁 参考文献 参考文献 1 w o o d w a r d 瓜，f i n c h e rg ba i l ds t o n eb a ，w a i e 卜s o l u b l e ( 1 3 ) ，( 1 4 ) p d - g l u c a n sf r o mb a r l e y ( h o r d e u m “d g a r e ) e n d o s p e 肌i i 矗n es l r u c t t i r e 川o 帕d 慨托陀印哆研p 慨1 9 8 3 ，3 ：2 0 7 - 2 2 5 【2 】何国庆等争葡聚糖对啤酒易滤性影响的研究 j 】浙江农业大学学报，1 9 9 2 ，( 2 ) ：1 0 5 一1 0 9 【3 】1 酞私h ia l ( i y 锄a ， h a n a ek a k u ，n a o t o s h i b u y a p 矾f i c a t i o na i l dp a n i a lc h a f a c t e r i 勰6 0 no fa n e n d o - l ，3 1 ，4 一9 1 u c 柚嬲e 劬mr i c e ，o r y z a s a t i v a l 【j 】b 泐c fb f d 肋厅曰咖 绷，1 9 9 6 ，6 0 ( 1 2 ) ：2 0 7 8 2 0 8 0 f 4 】邹东恢，江洁肛葡聚糖酶的开发与应用研究【j 】农产品加工学刊，2 0 0 5 ，8 ：7 - 9 【5 】o 街c e rdi e 位c to f m u 睢e n z y m es u p p l e m e n t so nm eg r o w t l lp e r f b 珊柚c eo f p i g l e t sd 埘n g t 1 1 ep r e - 柚d p o s m e 锄i n gp e r i o d s 四一n 砌口，凡p d & t 死c 开d ，1 9 9 5 ，5 ：5 5 - 6 5 【6 】杨辉，廖威，梁海秋等葡聚糖酶高产菌株的分离鉴定及其培养基优化的研究 j 】广西大学学报， 2 0 0 3 ，2 8 ( 6 ) ：8 9 - 9 2 【7 】郑元平，袁康培等啤酒用p 一葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化【j 】农业生物技术学报， 2 0 0 4 ，1 2 ( 3 ) ：3 1 6 - 3 2 l 【8 】 p c 锄p b e l l j b r 姗p l a n tj c r y s t a i s 仃i l c t i l i s醐d p m p e r t i e s o fd e n o v o c i r c u l 缸l y p c m u t e 邮- l ，3 - 1 ，4 - d u c 锄硒e n 乃枷甜d ，肪p s c 阴c p q ，弦耐肼d q 矿耙“胁删，1 9 9 8 ，1 5 ：5 5 3 - 5 6 1 【9 】p n e w m 锄p h y t a 士ec o n t e n ti sr e d u c e da l l dp g l u c 柚越ea c n v i t ys u p p r e s s e di nm a l t e db a r l e ys t e e p e dw i m l a c t i ca th i g ht e m p e r a n l r e 【j 】j b “m 甜d ，腩p 卵如h c e 咖o d 讲d q 加“f t 胖，2 0 0 4 ，8 4 ( 7 ) ：6 5 3 - 6 5 5 【1 0 】b a r o n e r r r m a r q u a t d lw g u e n t e r ，e ta 1 y e a s tc e l lp e r r n e a b i l i z i n gp - 1 ，3 一g l u c 柚鹤e ：at o o lf o r m ei m e g m t i o no f d o ，i l s 打e 锄p r o c e s s e s 锄dm e t a b o i i ce n g i i l e e r i n ga p p l i c a t i o i l st oy e a s t 【j i ，b d d 爿f c ， 1 9 9 0 ( 5 0 ) ：1 9 - 2 7 【l l 】b o 币s srb u e 仕e rk ，m a e n t s a e l a ep s n u 咖r eo ft l l eb e t a - 1 ，3 - 1 ，4 一g l u c a n 髂eg e n e o fb a c i i l l l s m a c e r a n s ：h 0 m o i 晒e st oo t l l e rb e t a - 舀u c 删6 e s 叨胁正g p g 删吒1 9 9 0 ，2 2 2 ：2 7 8 - 2 8 3 1 2 】h e n gn c ，j e n k m s o n 唧，t a 加o c kg c l o n i n g 卸de 印r e s s i o no f a ne n d o 一1 ，3 1 ，4 一p g l u c 锄鹊eg e n e 肋mb a c i l l u sm a c e r 锄si nl a c t o b a c i i l u sr c u t e r i j 】4 科砌伽伽埘c ，d 6 如，1 9 9 7 ，6 3 ：3 3 3 6 3 3 4 0 1 3 】l l o b e r a sj ，p e r e z p o n sj a ，q u e r o le m o i e c u l a rc 1 0 n i n g ，e x p r e s s i o na n dn e c l e o t i d es e q u e n c eo fm e e n d o - 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