（遗传学专业论文）基于线粒体dna+nad5序列研究天然红松的分子系统地理学.pdf

。 j - 1 ： q l t 0 。她 ： q ， r ； l 3 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注 和致谢的地方外。不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本 人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 签名日期：? 巾i f 年月日 娘哌 乙 含 1r二 一，与 葺i q r 铲 0 节 r q - ! l 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 红松属于松科松属植物，是名贵而又稀有的树种，是国家二级重点保护野生植物， 主要分布在我国东北长白山到小兴安岭一带，它是裸子植物中的一个古老的树种，大约 出现在2 5 0 0 - 2 3 0 0 万年前的第三纪中新世，在其演化过程中，红松经历了整个第四纪 的气候变迁。 本文以分布在我国东北三省的2 5 个天然红松种群的1 2 5 个个体为材料，利用线粒 体d n a 引物n a d 5 对其进行p c r 扩增，通过p c r 产物直接测序的方法测定出线粒体d n a ( m t d n a ) n a d 5 非编码区序列，利用分子生物学软件对各序列进行比对、记录突变情况、 总结单倍型并根据单倍型构建系统进化树。在分析我国东北地区天然红松系统发育地理 模式时需将单倍型系统进化树与各种群的地理位置结合起来。 利用软件p r i m e r 5 0 设计出一对扩增引物n a d 5 ，用此引物对1 2 5 个天然红松个体进 行扩增，并对p c r 产物进行直接测序。测序后得到1 2 2 条d n a 序列并将这些序列按照 f a s t 格式排列，使用c l u s t a lxv e r l 8 1 软件对其进行比对，删除其不可信片段后确 定了由引物n a d 5 扩增出并可用于比对的片段长度在4 3 6 b p - 4 3 7 b p ，并未表现出明显的 长度多态性。t 、c 、a 、g 四种核苷酸的平均比率为2 4 8 、2 5 9 、2 6 4 、2 2 9 ，g 、 c 含量和为4 8 8 ，a 、t 含量和为5 1 2 ，g 、c 含量和略低于a 、t 含量和，许多非编码 区序列具有这种特点。 经分析比对测序得到的1 2 2 条序列，共鉴定出变异位点1 0 个，定义出1 2 种m t d n a 单倍型，将其命名为h a h l 。因为单倍型h a 存在于所有种群中，它可能是最原始的单倍 型，所以称卧为祖先单倍型。部分单倍型存在于多个种群中被称为共享单倍型，这种 共享现象证明了各种群存在基因交流。其余单倍型只为部分种群所特有，称之为特有单 倍型。用d n a s p 4 1 0 9 软件分析了各种群及各省单倍型多样性，这样有助于确定天然红 松种群的冰期避难所。最后用分子进化遗传分析软件m e g a 4 0 中的n j 法和m p 法构建天 然红松单倍型的系统进化树。结合上述分析过程确定了在第四纪冰期来临时，我国天然 红松林的避难所为吉林地区的d s t - q l ( 敦化青林林场) 和黑龙江地区的l s h - x x ( 海林 柴河林业局新兴林场) 两个种群，并推测出冰期退却后天然红松林的扩散路径。 气候变化对红松的分布也有所影响，本文对目前气候变化将导致的植被分布改变做 了统计研究，并制定了合理的应对策略，同时还对天然红松林的恢复及更新提出了一些 可行的建议。 关键词：红松；分子系统地理学；m t d n a ；单倍型 l q k i，崎 。 ， _ 、一 r q 7 ， 0 辽宁师范大学硕士学位论文 a n a l y s i so fm o l e l e c u l a rn a t u r a l p i n u sk o r a i e n s i sb a s e do nn a d 5 m i t o c h o n d r i a ld n a s e q u e n c e a b s t r a c t p i n u sk o r a i e n s i sb e l o n g st os o n k ol o o s eg e n u s ，i ti se x p e n s i v ea n dr a r e ，o n eo ft h e s e c o n d - c l a s sn a t i o n a lk e yp r o t e c t i o np l a n t s i t sm a i n l yd i s t r i b u t e di nt h en o r t h e a s t ，c h a n g b a i m o u n t a i na r e aa n dx i a o x i n g a n l i n ga r e a i t so n eo ft h eo l d e s tg y m n o s p e r m st r e e ，e m c e e d a b o u t2 5 2 3m i l l i o ny e a r sa g o d u r i n gi t se v o l u t i o np r o c e s s ，p i n u sk o r a i e n s i se x p e r i e n c e dt h e w h o l eq u a t e m a r yc l i m a t ev a r i a t i o n t h i sp a p e ri sb a s e do nt h ed i s t r i b u t i o no ft h et h r e en o r t h e a s tp r o v i n c e si n0 1 1 1 c o u n t r y ， 2 5n a t u r a lp i n u sk o r a i e n s i sp o p u l a t i o n s ，a n d1 2 5i n d i v i d u a l sa r e f o rm a t e r i a l u s i n gt h e m i t o c h o n d r i a ld n a p r i m e ro nt h ep c r n a d 5b yp c r p r o d u c t s ，t h em e t h o df o rd e t e r m i n i n g d i r e c ts e q u e n c i n gt h em i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) n a d 5t h ec o d i n gr e g i o ns e r i e s ，a n dt h e m o l e c u l a rb i o l o g ys o f t w a r eo ne a c hs e q u e n c et oc o m p a r e ，r e c o r dm u t a t i o u s ，s u m m a r ys h e e t t i m e si no r d e rt oc o n s t r u c tp h y l o g e n e t i ct r e ea c c o r d i n gt oh a p l o t y p e o nt h ea n a l y s i so f n a t u r a lp i n u sk o r a i e n s i ss y s t e md e v e l o p m e n ti nn o r t h e a s tn a t u r a lg e o g r a p h i c a lm o d ew i l lb ea h a p l o t y p et ot y p es y s t e mw i t ha l lk i n d so ft h ee v o l u t i o n a r yt r e eo fg e o g r a p h i c a lp o s i t i o n c o m b i n e d u s i n gt h es o f t w a r ep r i m e r 5 0t od e s i g nap a i ro fa m p l i f i c a t i o np r i m e rn a d 5 ，1 2 5n a t u r a l k o r e a np i n ei n d i v i d u a l st oe n l a r g ea n dd i r e c ts e q u e n c i n go fp c r p r o d u c t s s e q u e n c i n gd n a s e q u e n c ea n dg e t12 2b a ri na c c o r d a n c ew i t ht h e s es e q u e n c e sf a s t af o r m a ti sa r r a n g e d ， c l u s t a lxv e r l 8 1s o f t w a r et ou s ei t sd i f f e r e n c e s ，d e l e t ei t sc r e d i b i l i t ya f t e rt h ef o o t a g eh a d 5 d e t e r m i n e db yp r i m e ra m p l i f i c a t i o nt h a naa n dc a l lb eu s e di nt h ef r a g m e n tl e n g t hi n4 3 6 b p 一 4 3 7 b p ，d i dn o ts h o wo b v i o u sl e n g t hp o l y m o r p h i s m t ，c ，a ，gf o u rn u c l e o t i d ef o rt h ea v e r a g e r a t i oo f2 4 8 ，2 5 9 ，2 6 4 ，2 2 9 ，1 3 icc o n t e n tw a s4 8 8 a n da ，tc o n t e n tw a s51 2 ，g cc o n t e n tw a ss l i g h t l yl o w e rt h a na ，tc o n t e n t ，m u c ho fn o n - c o d i n ga r e a sh a v et h i sf e a t u r e b ya n a l y z i n ga n dc o m p a r i n g1 2 2s e q u e n c i n g sa r eg o t ，v a r i a t i o ns i t e sw e r ei d e n t i f i e d1 0 ， d e f i n e d1 2m t d n ah a p l o t y p e ，i t sn a m e dh a h l h ai sc a l l e da n c e s t o r so fh a p l o t y p e b e c a u s eh a p l o t y p eh ae x i s t s i na l lp o p u l a t i o n s ，i tm a yb et h em o s tp r i m i t i v el i m e st h e h a p l o i dt y p e p a r to fh a p l o t y p ee x i s t si nm u l t i p l ep o p u l a t i o n s ，s oh a p l o t y p ei sc a l l e ds h a r i n g m o d e l ，t h i sp h e n o m e n o np r o v e sd i f f e r e n tp o p u l a t i o n ss h a r e dg e n e t i ce x c h a n g e r h er e s to f h a p l o t y p ef o rp a r to fp e c u l i a re n d e m i cs p e c i e s ，c a l l e dh a p l o t y p e u s i n gd n a s p 4 1 0 9 s o f t w a r ea n a l y z e sv a r i o u sp r o v i n c e si ng r o u pa n dh a p l o t y p e ，i th e l p sd e t e r m i n et y p ed i v e r s i t y o fp i n u sk o r a i e n s i sp o p u l a t i o nt of o r mn a t u r a lg l a c i a ls h e l t e r s f i n a l l yu s i n gm o l e c u l a r e v o l u t i o nm e g a 4 0g e n e t i ca n a l y s i ss o f t w a r ew i t ht h ef l o a t a t i o nm e t h o da n dm pm e t h o d ， - i i i - 舶、-j，0 节k厂、爷 基于线粒体d n an a d 5 序列研究天然红松的分子系统地理学 c o n s t r u c tt h en a t u r a lp i n u sk o r a i e n s i st r e e ac o m b i n a t i o no ft h e s ea n a l y s i si nt h ep r o c e s so f t h eq u a t e r n a r yg l a c i a lp e r i o dd e t e r m i n e dt ot e m p o r a r y , c h i n a sn a t u r a ls h e l t e rf o rp i n u s k o r a i e n s i sf o r e s ti nj il i na r e ao fd s t - t h ef o r e s tf r o mq l ( d u nh u af o r e s to fh e il o n g j i a n g p r o v i n c e ) a n dl s h x x ( h a il i nc a t e g o r yo ff o r e s t r ya d m i n i s t r a t i o ne m e r g i n gf o r e s t , a n d p r e s u m a b l y ) o ft w op o p u l a t i o n s a n dp r e s u m a b l yar e f u n dp e r i o da f t e rt h eg l a c i a lb u tt h e s p r e a do fn a t u r a lp i n u sk o r a i e n s i sf o r e s tp r o l i f e r a t i o np a t h t h ed i s t r i b u t i o no fp i n u sk o r a i e n s i si si n f l u e n c e db yc l i m a t e ，t h i sp a p e rd i s c u s s e st h e s t a t i s t i c a ls t u d i e so nv e g e t a t i o nd i s t r i b u t i o nc h a n g ew h i c hl e a db yp r e s e n tc l i m a t e ，m a k i n g r e a s o n a b l es t r a t e g i e s ，b u ta l s os u g g e s t i n gt h er e s t o r a t i o na n du p d a t ef o rn a t u r a lp i n u s k o r a i e n s i sf e a s i b l y k e yw o r d s ：p i n e sk o r a i e n s 西；m o l e c u l a rp h y l o g e o g r a p h y ；m t d n a ；h a p l o t y p e i v 一 ，t 、 - _ 1 r l ， 弋 r 4 一 k r f i 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 绪论1 1 1 松属植物的一般特征1 1 2 红松的一般特征2 1 2 1 红松的形态特征2 1 2 1 红松的生长特点2 1 2 3 红松的天然更新途径2 1 3 红松的研究现状3 1 3 1 红松的地理分布3 1 3 。2 红松的价值5 1 3 3 红松在造林中的应用6 1 4 线粒体d n a ( m t d n a ) 概述7 1 4 1 线粒体d n a 与核d n a 关系7 1 4 2 植物线粒体d n a 的遗传方式7 1 4 3 线粒体d n a 在植物分子系统地理学方面的研究进展7 1 4 4 红松线粒体d n a 特点8 1 5d n a 狈i j 序技术8 1 5 1 经典的d n a 测序技术8 1 5 2 现代d n a 测序技术8 1 6 系统进化树介绍j 1 0 1 6 1 系统进化树概念1 0 1 6 2 系统进化树的构建方法l o 1 6 3 进化树反映物种亲缘关系1 l 1 7 植物分子系统地理学1 l 1 7 1 分子系统地理学1 1 1 7 2 植物分子系统地理学的应用1 2 1 8 本文的研究内容及意义1 3 2 基于线粒体n a d 5 序列研究天然红松的分子地理学1 4 2 1 实验材料与方法1 4 2 1 1 实验材料1 4 一v 一 ，。 k ，j 气曾 八 基于线粒体d n an a d 5 序列研究天然红松的分子系统地理学 2 1 2 实验方法1 5 2 1 3 p c r 反应体系的建立1 8 2 1 4 p c r 扩增产物测序2 0 2 1 5 序列的比对分析2 0 2 1 6 构建系统进化树2 1 2 2 实验结果及分析2 1 2 2 1 红松基因组d n a 提取、纯化结果2 1 2 2 2 p c r 扩增结果2 3 2 2 3 测序结果及分析2 4 2 2 4 构建系统进化树3 0 3 讨论3 3 3 1 第四纪冰期3 3 3 2 结果讨论3 3 3 3 目前气候变化将导致的植被分布改变及应对策略3 6 3 4 对目前天然红松林的恢复及更新的建议3 6 参考文献3 8 攻读硕士学位期间发表学术论文情况4 l 致谢4 2 l ， t 0 产 0 r q - ： 0 辽宁师范大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 松属植物的一般特征 松属( p i n u sl i n n ) 植物多为乔木，稀为灌木。各种松树的染色体基数均为x = 1 2 。 枝轮生，每年生一节或两节或多节；冬芽显著，芽鳞多数，覆瓦状排列。叶有两型：一 种为原生叶( 鳞叶) ，呈褐色鳞片状，单生于长枝上，除在幼苗期外，退化成苞片；另 一种为次生叶，针状，常2 、3 或5 针一束，生于短枝顶端；每束针叶基部由8 1 2 枚 芽鳞组成的叶鞘所包围，叶鞘宿存或早落。针叶具有1 至2 个维管束以及2 个至1 0 多 个中生、边生或内生的树脂道。球花单性，雌雄同株。雄球花多数，集生于新梢下部， 呈橙色；雌球花单生或2 4 个集生于新梢的近顶端处。球果2 年成熟，卵形，熟时开 裂，种鳞木质，宿存；鳞脐有刺或无刺；种子多有翅，子叶3 , - - , 1 8 枚，发芽时出土。 松属植物为世界上主要的用材树种，且是产生松脂的主要树种。其木材有松脂，纹 理直或斜，结构中至粗，其木材的软硬程度因树种的不同而有所差异，但均较易施工。 松属植物具有很大的经济价值，其木材不仅可以供建筑、电杆、枕木、矿柱、桥梁、舟 车、板料、农具、器具及家具等用，还可以作为木纤维工业原料。树皮、针叶、树根等 可制成化工产品，种子可榨油，还可以采收和提取药用的松花粉、松节、松针及松节油 等。多数松属种类可为森林更新、造林、绿化之用。 松属近百种，其分布范围为南至中美、北非、中南半岛至苏门答腊赤道以南地区， 北至北极地区，主要分布于北半球。在中国松属植物几乎遍及全国，中国产2 2 种1 0 变 种，部分树种已成为我国森林中的主要树种，如：红松、马尾松、华山松、樟子松、油 松、云南松等；引入栽培的松树1 6 种2 变种，由于其中一些树种生长较快，如：长叶 松、湿地松、加勒比松、刚松、火炬松、黑松等均已成为具有发展前途的造林树种。松 属的现代的分布中心位于北美洲，在分布中心的松属植物约5 4 种。植物的起源地应该 具有以下四种特点：该属植物最早化石应该出自此地，该属植物各演化阶段的类群在此 地均有代表，此地区的原始类群最集中，并且自该属植物发生以来此地区未曾受过巨大 灾害。北美洲不符合以上条件，因此北美洲并不是松属的起源中心。迄今为止最早的松 树化石记录是在中国四川的威远地区晚三叠纪地层发现的，在中国西南及中南半岛东部 的越南集中了松属的多个原始组和原始亚属，此地区还具有松属植物各演化阶段的类 群，同时自松属植物在该地区出现后该地区也没有发生过重大灾害，以此可以推断出此 地区为松属植物的起源地的可能性较大i l j 。 基于线粒体d n ah a d 5 序列研究天然红松的分子系统地理学 1 2 红松的一般特征 红松( p i n u sk o r a i e n s i s ) 又名果松，海松，属于松科松属植物，国家二级重点保 护野生植物。红松是名贵而又稀有的树种，主要分布在我国东北长白山到小兴安岭一带， 红松是演替的项极群落中的优势树种，红松针阔混交林是我国东北地区的地带性顶极植 被类型。 1 2 1 红松的形态特征 红松为常绿针叶乔木。幼树树皮灰红褐色，心材边材区分明显，边材浅驼色带黄白， 常见青皮；心材黄褐色微带肉红，红松因此而得名。天然红松林内树多高3 0 米左右， 胸径为半米至一米之间，大树树干上部常分权，寿命长达3 0 0 一- 4 0 0 年。针叶5 针一束， 长6 - - , 1 2 厘米，枝近平展，树冠圆锥形，冬芽淡红褐色，圆柱状卵形。球果两年成熟， 成熟球果圆锥状卵形，长约6 5 2 0 厘米，红松花期在每年5 - - 6 月，球果成熟期为翌 年9 - - - 1 0 月，种子大且三角状卵形【2 】。 1 2 1 红松的生长特点 红松喜好温和湿润的气候条件，是典型的温带湿润气候条件下的树种，该树种在湿 度适宜的情况下，对温度的适应能力较强，最低温度可达- 5 0 。喜光性强，随树龄增 长需光量逐渐增大。喜湿润、土层肥沃、深厚、通气和排水良好的微酸性土壤，不耐干 旱、盐碱，在土壤p h 值5 5 - 6 5 的山坡地带生长好。 红松是一个长伐期速生的造林树种，与落叶松相比，红松在造林后的前1 0 年生长 速度较为缓慢，之后生长速度较快，其生长可分为五个阶段：初生期、缓慢期、速生期、 下降期和终止期【3 1 。天然红松生长和形态特征的形成是与其林隙更新途径密切相关的， 其种间、种内对资源的长期竞争和适应及林隙所形成的垂直生境特征，均对红松的树高、 直径和树干形态有着重要的影响。红松在树龄1 6 0 年以前主要为高生长时期，受林隙形 成的垂直层次上的生境控制；树龄在1 6 0 年以后为径生长时期，林木达到上层林冠，从 营养生长转变为生殖生长，顶端开始结实，主干开始分叉，叶面积增大，形态呈平顶状， 此阶段林木生长主要依赖于立地条件【4 1 。 1 2 3 红松的天然更新途径 红松种子是许多动物的重要食物资源，红松球果大和种子具有深休眠性的特点使得 红松的天然更新需要动物来完成。其球果大且成熟后种鳞不张开，这使得种子无法脱落 只能随球果一同下落，因而也无法靠风力自行传播；其种子具有深休眠性是指自然条件 下成熟的种子需要到第三年春天才能大量发芽，这是因为它们需要经历一个后熟过程， ， ，_ 、 0 p f p _ 。 一 h r f | 、 二 0 辽宁师范大学硕士学位论文 也就是说红松从开花到种子成熟需要三年时间。如此长的休眠期加大了其被取食者消耗 的几率，多数种子在球果落地后由于微生物和昆虫的共同作用而丧失萌发能力。由于红 松种子的上述特点使得红松种子无法自行传播，而只能依赖鸟兽将其种子从球果中取出 并埋藏在地下，进而实现种子的萌发 5 1 。 研究表明具有较大种子且种子可食的树木，其传播方式均需借助动物来实现。红松 种子的传播就是通过动物的贮藏行为来实现的，这种传播方式也是红松完成天然更新的 唯一方式。鸟类、啮齿类及一些大型兽类均能取食红松的种子，但能将取食后的红松种 子进行分散贮藏的主要是松鼠和星鸦。它们从球果中取出种子，先吃掉一部分，再将剩 下的种子搬运至贮藏地并埋藏起来，待到春、冬季节食物缺乏时，再来重新取食。搬运 的距离可达数百米至几公里。分散贮藏的贮点数量很多，每个贮点有至数粒种子，贮 点小生境很适合红松种子的萌发，因此大量的未被重新取食的贮点的种子在2 0 个月后 可能会萌发。虽然动物贮藏的生境适合幼苗的萌发，但不一定适合幼苗的继续生长。同 样幼苗在生长过程也会受到动物的捕食和破坏 6 】。 1 3 红松的研究现状 1 3 1 红松的地理分布 研究证明红松的分布区包括中国东北部、朝鲜半岛和俄罗斯远东南部的连续分布区 以及日本本州和四国的间断分布。连续分布区又包括集中分布区和外围的岛状分布。红 松在世界的分布区见表1 1 ，红松在我国的分布区见表1 2 。对于红松的地理分布情况， 马建路掣刀对此有过详细的考证。 表1 1 红松在世界的分布区 t a b 1 1t h ef l o r ao f p i n u sk o r a i e n s i si nt h ew o r l d 基于线粒体d n an a d s 序列研究天然红松的分子系统地理学 表2 1 红松在中国的分布区 t a b 2 1t h ef l o r ao f p i n u sk o r a i e n s i si nt h ec h i n a 我国红松大致分布在我国东北的山地地区，主要在小兴安岭及长白山山脉一带( 见 图1 1 ) 。在我国的红松分布区内，红松表现出了明显的垂直分布规律，在纬度为北纬 4 1 。- 4 3 。3 0 之间的长白山林区，红松分布的海拔高度在6 0 0 至1 7 0 0 米之间：在纬度 为北纬4 4 。4 07 的完达山和张广才岭林区，红松分布的海拔高度在5 0 0 至1 3 0 0 米之间； 而在纬度为北纬4 6 。4 87 的小兴安岭林区，红松分布的海拔高度则在3 0 0 至1 0 0 0 米之 间，从以上数据可以看出，红松垂直分布的海拔高度随纬度的增加而逐渐下降。 红松是典型的温带湿润型山地乔木树种，这种典型特征决定了红松的地理分布会受 气候条件的制约，它对温湿状况适应的生态幅较窄，因此红松自然分布区的气候一般为 气候温和、空气湿润、蒸发较弱的典型的温带湿润型季风气候【8 】。 、：o ， i ， 1 7 ， 二 图1 - 1 我国当前红松林的地理分布 f i g 1 1 g e o g r a p h i c a ld i s t r i b u t i o no f p i n u sk o r a i e n s i si nc i f i n ac u r r e n t l y 一4 一 l 譬 ， 节 _ ， f ， ， v f t _ 、 ： 0 辽宁师范大学硕士学位论文 1 3 2 红松的价值 ( 1 ) 红松的经济价值 红松是著名的珍贵经济树木，树干粗壮，树高入云，挺拔顺直，是天然的栋 梁之材。红松材质轻软，结构细腻，纹理密直通达，形色美观又不容易变形，并 且耐腐朽力强，所以是建筑、桥梁、枕木、家具制作的上等木料，在国际木材市场 上有“王座的美誉【9 】。 红松全身是宝，除其树干外其他部位也极具经济价值。红松的树脂能够制成 樟脑，它是医药制造业和化学工业的重要原料。红松的树根的作用也不可小觑， 它不仅可以提炼出十余种工业用油如松节油、选矿油、焦油等，还可以提炼出制 造肥皂和橡胶不可缺少的材料一松香，其中松节油和松香在我国出口贸易上占有 非常重要的地位。红松的针叶可提炼芳香油、松针油，是高级化妆品和机械润滑 油的原料，同时它还是民间良好的药剂。红松的花是雌雄同株，异花授粉，其花粉 黄色有益气、祛风止血的功效，可入药。红松的果鳞片也可提炼粗质芳香油。红松 种子被视为延年益寿的补品，有滋润清肺、强精健体的作用，对贫血疲劳、皮肤干 燥、干咳、便秘有很好的疗效【l 们。 ( 2 ) 红松的生态价值 红松原始森林是小兴安岭生态系统的顶级群落，具有极其珍贵的生态价值， 它在维护小兴安岭的生态平衡问题上起着至关重要的作用，同时它也为保护以小 兴安岭为生态屏障的中国东北地区的生态安全做出了极其巨大的贡献。天然红松 林在涵养水源、防护效益方面发挥着巨大的作用。东北林区流经天然红松林分布 区内的有鸭绿江、乌苏里江、黑龙江和松花江等河流，红松林的存在不仅能够涵 养水源而且还能够防风固沙。松花江上游长白山林区有着丰富的阔叶红松林从而 使得松花江水位稳定、含沙量少。红松林并不是由单一的红松构成，而是由地面 上的枯枝落叶、苔藓、草本、灌木及红松共同组成，它们就像一层很厚的海绵体 吸收保存着大量的水分，起着巨型水库的作用，可以调节气候，使之大雨不涝， 无雨不早，保证江河水位的稳定，农业的高产稳产一部分也应归因于红松林的保 护。黑龙江省和吉林省是我国主要粮食产地，基本没有大旱大涝，颗粒不收的年 代，主要有超过3 0 以上的森林覆被率，其中有大面积的阔叶红松林。红松是其所 在森林系统中的支撑性的树种，红松籽是许多森林动物的主要粮食，因此，保护 红松也是保护生物的多样性资源，保护生物链的安全。 基于线粒体d n an a d 5 序列研究天然红松的分子系统地理学 1 3 3 红松在造林中的应用 红松是我国东北地区材种兼优的乡土树种，也是人工林造林主要树种之一 【“】。由于红松巨大的经济价值，使其不断地遭到人类的破坏和砍伐，从而导致了 东北地区天然红松林分布的严重萎缩并且片段化，因此营造红松人工林成为我国 东北地区森林植被恢复的重要工作之一。 若要营造好的红松人工林，必须要了解红松的生物习性并对天然红松林的形成过程 做透彻的研究。红松和与它一起群生的植物的关系是紧密相连且互相依存的，它们之间 既有矛盾又有统一。因此，不能只单纯地营造单一树种的纯林，这样会造成早期分叉和 干形差等缺陷。 根据红松不同生长阶段的不同习性，应对其采取不同的培养和抚育方式，具体情况 如下： ( 1 ) 红松幼年生长阶段( 1 - 8 0 a ) - 幼年的红松是与其周围的杂草相互竞争而生长 着，同时又需要侧方的灌木或乔木的庇荫，在庇荫作用下树冠生长呈锥形且径生长缓慢。 因此在此阶段需要除掉杂草并保留灌、乔木，从而使幼年红松有较好的生长环境。 ( 2 ) 红松树高生长阶段( 8 1 1 6 0 a ) ：此阶段需要在组成上占次要地位的阔叶乔木 与之伴生，且阔乔的树头需高于红松树头，使红松树头得不到整日光照或充分光照，由 于林隙上方透光增强了顶端优势，使其树干向上争长，达不到生理转化的开花结实，以 利塑造高大干型的红松【抡】，同时下方也需要有杂草和灌木共同生长，这样有利于维持土 壤肥力。 ( 3 ) 红松地径生长阶段( 1 6 卜2 8 0 a ) ：此阶段红松的树头已超过了阔乔，处于上层 林冠，可获得整日的充分光照，随着树木生长，主干多次分叉，冠幅增加到最大，呈平 顶形状，树木的连年高生长减慢，连年径生长加快，树高达到最大值，此阶段可完成生 理转化，开花结实，而后期林隙对树木生长的作用效应逐渐减弱，而立地条件对径生长 影响较为明显【4 】。 ( 4 ) 红松生长衰退阶段( 大于2 8 0 a ) ：此阶段红松高生长和径生长基本停止，树木 高、径大小趋于平稳，树木生长衰退后容易发生心腐和风倒，再生成新的林隙。 因此，在选择好优良种源和合适的造林地的前提下，还需结合红松各生长阶段的特 征对红松幼林进行合理抚育，对红松成林进行恰当管理。从1 9 世纪3 0 年代我国就开始 营造红松人工林，第一片红松人工林是人们在辽宁本溪草河口人工栽植的3 3 0 亩红松林， 此后我国东北各地区均展开了营造红松人工林工作，至2 0 世纪7 0 年代初，红松已成为 荒山造林和迹地更新的主要树种，至今总蓄积量已达3 4 5 4 7 万m 3 。 一6 一 譬 ， ， t 广 ， | | i r 辽宁师范大学硕士学位论文 1 4 线粒体d n a ( m t d n a ) 概述 线粒体于1 8 5 0 年被发现，1 8 9 8 年被命名，是细胞内氧化磷酸化和形成a t p 的主要 场所，有细胞“动力工厂”之称。自n a s s 等( 1 9 6 3 ) 发现线粒体中含有d n a 以来【1 3 1 ， 线粒体中存在遗传物质的事实已渐渐被人们接受。随着分子生物学技术的发展，线粒体 d n a 分析迅速渗入传统的分类、群体遗传、系统进化及人类学等研究领域，现已成为生 态学研究领域的强有力工具之一。 1 4 1 线粒体d n a 与核d n a 关系 线粒体是半自主性的细胞器，它除了有自己的遗传物质一线粒体d n a 外，还有蛋白 质合成系统( 核糖体、m r n a 、r r n a 、t r n a ) 。但是，它的遗传信息量不足，仍然要受控 于核的遗传信息，也就是说，线粒体的蛋白质只有少数几种是线粒体基因编码的，大多 数线粒体蛋白质还是由核基因编码。所以线粒体的生物合成涉及两个彼此分开的遗传系 统。 1 4 2 植物线粒体d n a 的遗传方式 大多数植物线粒体基因组表现为明显的母性遗传，有可能是以下两种机制的压力造 成的，一是最终授精的精子在其发育过程中经历了线粒体d n a 数目的戏剧性减少或仅带 极少的线粒体d n a 到卵细胞；二是存在引起父系线粒体d n a 降解的机制或是阻止父系细 胞质向受精卵转移的预防机制。但植物线粒体d n a 仍存在父系遗传或双亲遗传，如线粒 体基因组表现为父系遗传的有杉木、芭蕉属、甜瓜属；表现为双亲遗传的有北美红杉、 油菜等，它们形成异质线粒体基因组或重纠1 4 1 。 1 4 3 线粒体d n a 在植物分子系统地理学方面的研究进展 目前已应用于植物系统发育分析的线粒体基因序列主要有：1 1 9 s r d n a ：是编码线 粒体r r n a 的小亚基；2 c o x l 、c o x 2 、c o x 3 基因：是编码细胞色素氧化酶i 、i i 、亚 基的；3 n a d l 、n a d 2 、n a d 4 、n a d 5 ：是编码n a d h 脱氢酶的i 、i i 、v 亚基的；4 m a t r 基因：用于编码一种成熟酶相关蛋白的；5 a t p l ( 或a t p a ) 基因：是编码a t p 合成酶亚 基1 的。虽然m t d n a 不如c p d n a ( 叶绿体d n a ) 那样多用于植物的分子系统地理学研究 上，但植物mt d n a 在植物分子系统地理学研究中也具有相当重要的应用价值。 如s i n c l a i r 用r f l p 方法研究了3 8 个欧洲赤松( p i n u ss y lv e s t r y sl ) m t d n a 的变 异，利用松科植物线粒体d n a 为母系遗传的特点分析后推测出，欧洲赤松在第四纪冰期 时的避难所可能是在爱尔兰岛或者在法国的西部，冰期结束后从避难所扩散至爱尔兰的 节 。- 基于线粒体d n an a d 5 序列研究天然红松的分子系统地理学 西部从而形成如今的格局【1 5 】。 朱世华等利用线粒体d n a 多态性对中国普通野生稻的遗传变异和分布进行了分析， 发现中国普通野生稻的线粒体d n a 与地理分布相关，遗传分化随地理梯度由少到多，认 为这有可能是在进化过程中迁移和突变相伴发生的结果【1 6 】。 s t r a u s s 等在利用线粒体d n a 对松属3 个物种共1 9 个居群的多样性研究时指 出，m t d n a 的多态性在居群多样性的研究中是一个很好的分子标记【1 7 】。 李林林等用线粒体基因n a d l 、n a d 4 和7 个限制性内切酶，对猕猴桃属3 4 个分类群 进行了p c r r f l p 分析，充分利用了猕猴桃属植物线粒体d n a 的严格母性遗传的特点， 为猕猴桃属植物的分子生物学提供了一个新的研究途径1 1 8 】。 卢孟柱等通过p c r 和p c r 产物直接序列分析技术，获得了分属于松属( p i n u s ) 两个 亚属p i n u s 和s t r o b u s l 2 个松树种c o x i ，a t p 6 和o r f 2 5 三个线粒体基因d n a 片段的序列。 发现尽管线粒体基因序列变异比叶绿体和核d n a 变异小，但线粒体基因编码序列变异仍 适于研究裸子植物亚属甚至组间的系统进化关系【1 9 1 。 1 4 4 红松线粒体d n a 特点 红松细胞质遗传的主要特点是其线粒体d n a 为母系遗传，而其叶绿体d n a 为父系遗 传，相对于大部分被子植物线粒体d n a 和叶绿体d n a 均为母系遗传来说，红松更具研究 价值。具有母系遗传特征的红松线粒体d n a 上的基因是通过种子的形式来传播和扩散的。 通过直接检测红松不同分布区个体的线粒体d n a 的变异，可以获得通过种子传播的基因 扩散的途径。对线粒体d n a 在不同地理位置上的变化规律的分析，可以为红松第四纪冰 期后的种群恢复过程研究提供直接的分子生物学证据。该结果可为松属物种的生物地理 演化研究提供新的思路和方法。同时将红松的线粒体d n a 、叶绿体d n a 和核d n a 结合起 来从不同水平上研究，会更加全面地揭示红松的种群变异和遗传多样性。 1 5d n a 测序技术 1 5 1 经典的d n a 测序技术 d n a 测序技术是分子生物学研究中最常用的一种技术，它推动了生物学的发展。成 熟的d n a 测序技术始于2 0 世纪7 0 年代中期2 0 1 。1 9 7 7 年s a n g e r 发明了双脱氧链终止法， 同年m a x a m 和g il b e r t 用化学降解法测定了d n a 的序列。这两种方法使得d n a 序列测定 的效率和准确性大大提高了，并且为d n a 测序技术的发展奠定了坚实的基础。 1 5 2 现代d n a 测序技术 ( 1 ) 自动测序技术 1 - ， 量 ， ， ， - v ， 辽宁师范大学硕士学位论文 此方法是基于双脱氧终止法原理的一种测序方法，该方法具有重要的意义，因为它 实现了d n a 测序的全自动化。此法是用非放射性荧光标记代替同位素标记，其中四种双 脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在电泳过程中不同长度的d n a 片段上的4 种 荧光基团被激光激发，