（作物遗传育种专业论文）水稻淀粉生物合成途径中关键酶基因分子标记的开发及应用.pdf

附件一 论文独创性声明 本人郑熏声鞠 所星交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成柴 也4 i 包含为获得四川农业大学 或其它教育橇梅的学位或证书所使耀过静榜辩 与我一同工作的同志对本磷究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 研究生箍名 可口嚏智 关于论文使用授权的声明 年月日 本人完全了解四川农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 牛和电子版 允许论文被煮阅和借 耀 可以采孺影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同意隧川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 研究生签名 导师签名 年月r 摘要 稻米品质主要是指稻米的淀粉品质 因此淀粉品质改良是水稻优质育种的 个重要目标 淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉两种类型组成 直链淀粉和支链淀 粉含量的比例及支链淀粉的精细结构共同决定了稻米的淀粉品质 直链淀粉主要 由w x 基因编码的颗粒结合型淀粉合成酶负责合成 目前人们对直链淀粉的遗传 研究比较透彻 但就阡 复等位基因与水稻糊化温度 g t 胶稠度 g c 之间的关 系如何 w x 各复等位基因在对品质主要指标影响方面的相互关系如何 以及如 何有效地开展水稻分子标记辅助品质育种等一系列问题还有待进行深入研究 支 链淀粉合成过程比较复杂 主要由可溶性淀粉合成酶 s s 淀粉分支酶 s b e 及淀 粉脱分支酶 s d b e 协同催化合成 且每一种酶又有许多的同工型 由于支链淀粉 合成的复杂性 以往人们对其研究较少 随着水稻基因组测序完成 籼稻9 3 1 l 及粳稻n i p p o n b a r e 的全基因组序列已经公布 通过比较籼 粳亚种相应基因序列 可获得这些基因的多态性区域 并据此开发序列标签标记 对饱和遗传图谱 图 位克隆 基因功能分析 遗传多样性揭示等具有重要的作用 为此 本研究一方 面分析了水稻w x 基因的遗传多态性与米质主要指标a c g c 和g t 之间的相关 性 另一方面开发了支链淀粉合成相关基因的序列标签标记 并分析了分支酶及 脱分支酶基因遗传多态性与稻米淀粉理化性质问的关系 其主要结果如下 1 基于水稻籼 粳亚种序列数据库比对 成功开发了9 个标记 其中a d p g 焦磷酸化酶基因研印 标记1 个a p l 2 8 0 一e c o r v 淀粉分支酶i 基因 r b e l 标记4 个 分别为r b 2 5 0 4 b r b 3 1 7 4 r b 3 8 2 8 和r b l 0 4 2 0 a c c i i 分支酶i i i 基因 r b e 3 标 记2 个 分别为r b l 0 6 2 和r b l 0 6 3 7 异淀粉酶基因 d 标记1 个i s 0 5 9 8 0 b 及r 酶基因 p f 标记1 个r 1 1 4 1 1 3 2 利用分支酶基因标记对供试材料进行检测 并分析r b e l r b e 3 基因遗传多态 性与稻米淀粉理化特性间的关系 结果表明 非糯材料中糊化温度变异主要与r b 3 8 2 8 和r b l 0 6 2 揭示两个多态性位点的加性效应或非等位基因互作效应的控制 且可能受 r b 3 1 7 4 标记的遗传多态性位点相关 而非糯材料中胶稠度的变异可能受r b e 3 基因 超显性效应或加性效应控制 另外水稻糯性突变对淀粉理化特性的变异会产生显著性 影响 即控制水稻糯性突变的基因可能是水稻淀粉理化性质变异的主效基因 3 利用分支酶基因标记对供试材料进行检测 并分析1 s o p u l 基因遗传多态 性与稻米淀粉理化特性间的关系 结果表明 在非糯材料中 糊化温度的高低受 p u l 基因的显性效应及异淀粉酶基因的上位性效应共同控制 热浆粘度的变异与标 记i s 0 5 9 8 0 b 揭示的多态性位点有显著的相关性 与标记r l1 4 11 3 揭示的多态性位 点无关 即热浆粘度主要受异淀粉酶基因调控 与r 酶基因的遗传多样性无显著的 相关性 4 利用r m l 9 0 和4 8 4 w 2 r a c ci 标记分析了5 0 个非糯水稻品种的w x 基因 的等位性变异 其中 r m l 9 0 揭示出7 种 c d 纯合变异类型和1 种杂合类型 分 别为 c t 2 0 c 1 3 1 9 c t l s c t t 7 c t t 4 c t l l c t i o 和 c d l t c t l s 并 以 c t l l 和 c t 1 8 两种类型为主 4 8 4 w 2 r a c ci 共揭示出2 种纯合类型和1 种杂 合类型 分别为g g 型 1 1 厂r 型及g t 型 c t j i 大多为g g 型 c t 1 8 大多为1 仃 型 这两个标记可将供试材料划分为1 0 种等位基因变异类型 进一步分析表明 r m l 9 0 揭示的w x 基因多态性可以解释直链淀粉含量变异的5 9 3 4 8 4 w 2 r a c ci 揭示的w x 基因多态性可以分别解释直链淀粉含量及胶稠度变异的 5 6 1 和2 4 6 而两标记共同可解释直链淀粉含量变异的7 2 4 关键词 a d p g 焦磷酸化酶基因 爿印 可溶性淀粉合成酶基因 s s s l 蜡质基 因 w x 分支酶基因 r b e l r b e 3 脱分支酶基因 p u l i s o 序列标签位点 s t s a b s t r a c t r i c eq u a l i t yr e f e r st os t a r c hp r o p e r t i e st oal a r g ed e g r e e t h e r e f o r ei m p r o v e m e n to f s t a r c hp r o p e r t i e si so n eo f t h em o s ti m p o r t a n tg o a l si nr i c eb r e e d i n g s t a r c hi sc o m p o s e do f a m y l o s ea n da m y l o p e c t i n t h ep r o p o r t i o no fa m y l o s ea g a i n s ta m y l o p e c t i na n dt h ef i n e s t r u c t u r eo fa m y l o p e c t i nd e t e r m i n er i c eq u a l i t yj o i n t l y s y n t h e s i so fa m y l o s ei sd i r e c t e db y g r a n u l eb o u n ds t a r c hs y n t h a s ew h i c hi sm a i n l ye n c o d e db yw xg e n e a l t h o u g ht h eg e n e t i c r e s e a r c hi st h o r o u g h l yu n d e r s t o o da tp r e s e n t t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nw xm u l t i a l l e l eg e n e a n dg ca n dg to fr i c es t i l ln e e d sm o r ee f f o r t s b e s i d e st h ei n f l u e n c eo fv m i o u sw xg e n e s o nr i c eq u a l i t ya l o n gw i t l lt h es e r i o u sp r o b l e m ss u c ha sh o wt oa p p l ym o l e c u l a rm a r k e r a s s i s t e db r e e d i n gi n t or i c ei sd o n ea n dn e e d sf u r t h e rs t u d y a m y l o p e c t i ni ss y n t h e s e dm o r e c o m p l i c a t e d l yb ys o l u b l es t a r c he n z y m e s o l u b l es t a r c hs y n t h a s ea n ds t a r c hd e b r a n c h i n g e n z y m e t h e s ee n z y m e sc o m p o s eo fs e v e r a li s o z y m e s l i t t l eh a sb e e nu n d e r s t o o ds of a r d u et ot h ec o m p l e xs y n t h e s i so fa m y l o p e c t i n h o w e v e rw i t l lt h es e q u e n c eo fr i c eg e n o m e i nh a n da n dt h er e l e a s eo ft h ew h o l eg e n o m i cs e q u e n c eo fi n d i c ar i c e9 3 11a n d j a p o n i c a r i c en i p p o n b a r e p o l y m o r p h i s mr e g i o ni so b t a i n e dt h r o u g hs e q u e n c ec o m p a r i s o n so f c o r r e s p o n d i n gg e n e si ns u b s p e c i e si n d i c aa n d j a p o n i c ar i c e t a g so f t h e s ep o l y m o r p h i s m s i t e sp l a yac r u c i a lr o l ei ns a t u r a t i o ng e n e t i cm a p m a p b a s e dc l o n i n g g e n e f u n c t i o n a n a l y s i sa n du n v e i l i n gg e n e t i cp o l y m o r p h i s m u n d e rs u c hab a c k g r o u n d t h ec o r r e l a t i o n b e t w e e ng e n e t i cp o l y m o r p h i s mo fr i c ew xg e n ea n dm a j o rq u a l i t yi n d e x e sa c g ca n dg t o fr i c ew a sc o n d u c t e do no n eh a n di n t h i ss t u d y o nt h eo t h e rh a n d t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e n g e n e t i cp o l y m o r p h i s mo fb r a n c h i n ge n z y m ea n dd e b r a n c h i n ge n z y m ea n d p h 7 s i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s o fr i c es t a r c hw a sa n a l y z e d r e s u l t si n t h i ss t u d ya r e c o v e r e di nf o u rp o i n t s 1 b a s e du p o nd a t ac o m p a r i s o nb e t w e e ni n d i c aa n d j a p o n i c ar i c e 9s e q u e n c e t a g m o l e c u l a rm a r k e r sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d a m o n gt h e m a p l 2 8 0 一e c o r vw a s t h et a go f a g pg e n e r b 2 5 0 4 b r b 3 1 7 4 r b 3 8 2 8a n dr b l 0 4 2 0 4 c c l lw e r et a g so f r b e lg e n e r b l 0 6 2a n dr b l 0 6 3 7w e r et a g so fr b e 3g e n e a n di s 0 5 9 8 0 ba n d r i1 4 11 3w e r et a g so f l s oa n d p u lg e n e sr e s p e c t i v e l y 2 t h em a t e r i a l sw e r et e s t e db yt h et a g so fb r a n c h i n ge n z y m eg e n et oa n a l y z et h e r e l a t i o nb e t w e e ng e n e t i cp o l y m o r p h i s mo fr b e la n dr b e 3g e n e sa n dt h er i c es t a r c h c h a r a c t e r i s t i c t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ei n h e r i t a n c eo fg tw a sp r o b a b l yr e l a t e dt o g e n e t i cp o l y m o r p h i s ml o c u so ft h e t a g so fr b 3 8 2 8a n dr b l 0 6 2 m a i n l ya f f e c t e db y n o n a l l e l ea d d i t i v eo ri n t e r a c t i o ne f f e c t f u r t h e r m o r et h ec o n t r o l l i n gg e n e so fg tw e r e p r o b a b l yr e l a t e dt ot h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s mi o c ao f r b 3 1 7 4 a n dt h a tt h ei n h e r i t a n c eo f g cw a sp o s s i b l yc o r r e l a t e dw i t ht h ea d d i t i v eo ro v e r d o m i n a n c ee f f e c to fr b e 3g e n ei n n o n g l u t i n o u sr i c e t h er i c eg l u t i n o u sm u t a t i o nw o u l ds i g n i f i c a n t l yh a v ee f f e c to nt h e v a r i a n c eo ft h er i c es t a r c hp h y s i o c h e m i c a lp r o p e r t y f u r t h e r m o r e t h ec o n t r o l l i n gg e n e o f f i c eg l u t i n o u sm u t a t i o nw a sp r i m a r yg e n eo f t h er i c es t a r c hp h y s o c h e m i c a lp r o p e r t y 3 t h em a t e r i a l sw e r et e s t e db yt h et a g so fd e b r a n c h i n ge n z y m eg e n et oa n a l y z et h e c o n n e c t i o nb e t w e e ng e n e t i cp o l y m o r p h i s mo f s oa n dp u lg e n e sa n dt h er i c es t a r c h c h a r a c t e r i s t i c t h er e s u l ti m p l i e dt h a tt h ei n h e r i t a n c eo fg tw a sp o s s i b l yc o r r e l a t e dw i t h t h ed o m i n a n te f f e c to fp u lg e n ea n dt h ee p i s t a s i se f f e c to fi s og e n ei nn o n g l u t i n o u sr i c e t h ec o n t r o l l i n gs i t eo fh p vw a sp r o b a b l yt h e1 s og e n es i t ed e t e c t e db yi s 0 5 9 8 0 b w h e r e a si tw a si r r e l e v a n tt ot h et a g so f r l l 4 1 1 3i nu n v e i l i n gg e n e t i cp o l y m o r p h i s m i n a n o t h e rw o r d h p vw a sm a i n l yr e g u l a t e da n dc o n t r o l e db yd i f f e r e n tr b eg e n e s w h e r e a s i tw a si r r e l e v a n tt ot h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s mp u l g e n e 4 t h ea l l e l i cv a r i a n c eo ft h ew xg e n ei n5 0n o n g l u t i n o u sr i c ev a r i e t i e s 1 i n e s w a s a n a l y z e du s i n gm o l e c u l a rm a r k e r sr m l 9 0 f o r c d ns i n g l es e q u e n c er e p e a t a n d 4 8 4 w 2 r a c ci f o rg ts n p i nt h es t u d y 7h o m o z y g o u s c t 一t y p ev a r i a t i o n s n a m e l y c t 2 0 c t 1 9 c t 1 8 c t 1 7 c t 1 6 c t 1 4 c t i1a n d c t t 0 a n da h e t e r o z y g o u sg e n o t y p e c t c t 1 8w e r ed e t e c t e df o rr m l 9 0 a m o n gw h i c h c t l l a n d c t h 8w e r ep r e d o m i n a n t t w oh o m o z y g o u s o oa n dt tg e n o t y p e s a n do n e h e t e r o z y g o u sg t 阮g e n o t y p ew e r ed e t e c t e du s i n g4 8 4 w 2 r a c ci m o s to ft h e m a t e r i a l sw i t har m l 9 0o f c t h lw e r eg gf o rs n po f 4 8 4 w 2 r 卅a c i w h i l et ts n p w a sp r e d o m i n a n t l ya p p e a r e da m o n gm a t e r i a l sw i t h c t 1 8 t h em a t e r i a l st e s t e di n t h i s s t u d yw e r eg r o u p e di n t o1 0c a t e g o r i e su s i n gt h et w om a k e r st o g e t h e r r e s u l t si n d i c a t e d t h a t5 9 3 v a r i a n c eo fa m y l o s ec o n t e n tw a sa t t r i b u t e dt ot h ep o l y m o r p h i s mo fw xg e n e r e s u l t e df r o mr m l 9 0m a r k e r w h e r e a s5 6 1 a n d2 4 6 o ft h ev a r i a n c ei na m y l o s e c o n t e n ta n dg e lc o n s i s t e n c yw e r er e s p e c t i v e l ya t t r i b u t e dt ot h ep o l y m o r p h i s mo fw xg e n e r e s u l t e df r o m4 8 4 w 2 r a c cim a r k e r f u r t h e r m o r e i nt h ep r e s e n c eo fs s ra n dc a p s m a k e r st o g e t h e r 7 2 4 o ft h ev a r i a n c ei na m y l o s ec o n t e n tc o u l db ei n t e r p r e t e d t h e a p p l i c a t i o np r o s p e c t so ft h et w om a r k e r sa b o v ei nb r e e d i n gw e r ea l s od i s c u s s e di nt h i s p a d e r k e yw o r d a g p a s eg e n e 口印 w a x yg e n e w x s t r a c hb r a n c h i n gg e n e r b e l r b e 3 s t r a c hd e b r a n c h i n gg e n e p u l l s o s e q u e n c e t a g g e ds i t e 4 简写符号 a m a p b p k b p a c g c g t i n 强 g l c 1 p u d p g u g p a s e a d p g a g p a s e a g p g b s s w x s b e s b e l s b e 3 r b e l r b e 3 s s s s s s l s d b e i s a p u i l n d e l s s n p c a p s s t s 缩略符号 英文全称 a m y l o s e a m y l o p e c t i n b a s ep a i r k i l o b a s ep a i r a m y l o s ec o n t e n t g e lc o n s i s t e n c y g e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r e r a p i dv i s c o s i t ya n a l y z e r g l u c o s e 1 p u d pg l u c o s e u d pg l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l o s e a d pg l u c o s e a d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l o s e g e n ee n c o d i n ga g p a s e g r a n u l eb o u n ds t a r c hs y n t h a s e g e n ee n c o d i n gg b s s s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e g e n ee n c o d i n gs b e l g e n ee n c o d i n gs b e 3 r i c es t a r c hb r a n c h i n ge n z y m eig e n e r i c es t a r c hb r a n c h i n ge n z y m ei i lg e n e s o l u b l es t a r c hs y n t h a s e g e n ee n c o d i n gs s s l s t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m e g e n ee n c o d i n gi s o a m y l a s e g e n ee n c o d i n gp u l l u l a n a s e i n s e r t sa n dd e l e t i o n s s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m c l e a v e d a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s ms e q u e n c e s e q u e n c e t a g g e ds i t e 中文全称 直链淀粉 支链淀粉 碱基对 千碱基对 直链淀粉含量 胶稠度 糊化温度 粘滞性分析器 1 磷酸葡萄糖 u d p 葡萄糖 u d p 葡萄糖焦磷酸化酶 a d p 葡萄糖 a d p 葡萄糖焦磷酸化酶 a d p 葡萄糖焦磷酸化酶基因 颗粒性结合淀粉合成酶 蜡质基因 淀粉分支酶 淀粉分支酶1 基因 淀粉分支酶3 基因 水稻淀粉分支酶1 基因 水稻淀粉分支酶3 基因 可溶性淀粉合成酶 可溶性淀粉合成酶基因 淀粉脱分支酶 异淀粉酶基因 极限糊精酶基因 插入与缺失 单核苷酸多态性 扩增片段限制性酶切的多态性 序列标签标记 第一章文献综述 水稻是世界上主要的粮食作物 在全世界范围内有三分之二人1 2 1 以稻米为主食 近些年来 随着一系列水稻新品种的选育成功和配套栽培技术的出台 使水稻的产量 普遍得到提高 基本上满足了人们的温饱需要 世界各国在实现稻米生产略有剩余的 情况下 对稻米质量的要求有了较大的提高 单纯追求产量并不能带来相应的经济效 益 于是世界各国对优质稻米格外青睐 再加上国际市场激烈的竞争 劣质稻米与优 质稻米的差价越来越大 因此水稻生产国竞相开展了优质水稻品种的选育和开发工 作 优质 高产 多抗以成为国内外水稻生产国和科技工作者共同追求的目标 我国作为水稻生产和消费的大国 种植面积和总产量居于世界前列 加之我国进 入世界贸易组织后 农业和农产品面临前所未有的挑战和机遇 水稻生产也不例外 随着对农业进1 2 1 限制条件的降低直至逐步取消 势必会导致大量的外国优质稻米涌入 中国市场 因此加速水稻品质育种和优质米生产的步伐以势在必行 1 1 淀粉的生物合成途径 淀粉是在叶绿体或淀粉体中通过一系列酶促反应合成的 叶绿体和淀粉体同是质 体 但存在于不同的器官中 前者在光合器官如叶片中 后者是在非光合器官中 在高等植物中 淀粉的生物合成被许多因素所调节 在光合器官叶绿体中 通过 卡尔文循环固定c 0 2 形成3 磷酸甘油酸 3 p g a 然后转变为三碳糖磷酸 t r i o s e p t r i o s e p 通过其载体进入细胞质 在那里形成蔗糖 或者留在叶绿体内形成果糖6 磷 酸 f 一6 p 和葡萄糖l 一磷酸 g l c l p 而在造粉体中 合成淀粉的原料来自叶片合 成或淀粉降解产生的蔗糖 在胞液中在蔗糖合成酶作用下将蔗糖分解为果糖和u d p 葡萄糖 继而u d p g 一焦磷酸化酶的催化下形成g l c 一1 一p 然后g l c 1 p 在腺苷磷酸葡 萄糖焦磷酸化酶 又叫1 磷酸葡萄糖腺苷转移酶 的作用下形成a d p 葡萄糖 a d p g 1 l a d p g 作为合成淀粉的底物 在淀粉合成酶s s 淀粉分支酶s b e 和淀粉脱分支 酶s d b e 的作用下形成直链淀粉和支链淀粉 6 图1 淀粉生物合成的主要途径 1 2 淀粉合成代谢途径中关键酶的生化及分子生物学研究 淀粉合成和积累发生在水稻种子发育的特定阶段 稻米淀粉合成是由几个重要的 酶所催化的 蔗糖是合成淀粉的主要原料 淀粉的合成最后阶段涉及到3 个关键性的 酶是 a d p g 焦磷酸化酶 a d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e a g p a s e 淀粉合酶 s t a r c h s y n t h a s e s s 及淀粉分支酶 s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e s b e 它们分别催化a d p g 的形 成 葡聚糖链的延伸以及分支链的形成 最近发现淀粉脱分支酶 s t a r c hd e b r a n c h i n g e n z y m e s d b e 在淀粉生物合成中也起重要作用 其中每一种酶又有多种同工酶形式 淀粉合酶 s t a r c hs y n t h a s e s s x 可分为淀粉粒结合的淀粉合成酶 g r a n u l e b o u n ds t a r c h s y n t h a s e g b s s 和可溶性淀粉酶 s o l u b l es t a r c hs v n t i i a s e s s s 淀粉分支酶至少 有四种同工型 i s o f o r m 其中s b e i 和s b e i i i 研究的比较清楚 1 2 1a d p g 焦磷酸化酶 a d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e a g p a s e a g p a s e 主要功能是把葡萄糖转变为合成淀粉的底物a d p g 它是植物代谢活 动向淀粉合成方向发展涉及到的第一个关键酶 它催化g l c 一1 p 和a t p 生成的 a d p g 将作为淀粉合酶的底物参与直链淀粉和支链淀粉的合成 2 j 它是催化淀粉合 成的第一步 直接决定贮藏组织中淀粉的水平从而最终决定了作物的产量 3 在高等植物中天然的a g p a s e 是由2 个大亚基和2 个小亚基构成的异型四聚体 表 1 1 每类亚基都是由不同的基因编码i t 不同植物中a g p a s e 大 小亚基的大小有些 差异 其大亚基一般在5 4 6 0 k d a 小亚基在5 0 5 5 k d a 之间 现在 许多植物a g p a s e 的大 小亚基已经分离纯化并且获得了它们相应的基因的c d n a 序列和基因组序列 f 表2 对比大亚基和小亚基的氨基酸序列 核酸序列 发现它们均有较大的同源性 有人推测两者的编码基因可能有着相同的起源 在不同物种问 小亚基保守性更高 而大亚基相对变幅较大 这可能与大小亚基在a g p a s e 中承担不同功能的原因 小亚 基倾向认为是酶的活性中心 而大亚基则是酶的调节中心1 5 j a g p a s e 是催化淀粉合成途径中第一个限速酶反应 作为一个关键酶 它受到别 构调节并定位于质体中 6 类似于其它代谢过程中的限速酶 a g p 懿e 也是一个受变 构调节的酶 在叶片中a g p a s e 受3 磷酸甘油酸 3 p g a 二价阳离子m 9 2 m n 2 变构激活 而被无机磷酸 p i 所抑制 而在种子中的a g p a s e 则对变构调节不敏感 在已分离到的低淀粉积累突变体伴随有a g p a s e 活力的下降 说明了它在淀粉合成中 的关键作用 在转化突变型的a g p a s e 基因 唧 的同时 s t a r k 等人还转化了野生型 的a g p a s e 基因 唧 转基因植物淀粉含量没有明显的增加 再次印证了a g p a s e 基 因 口印 的变构调节对淀粉合成效率的重要性 在减少淀粉含量方面 m u l l e r r o b e r 等 i 刀 1 9 9 2 利用含有不同启动子和反向连接的a g p a s e 大或小亚基c d n a 的融合基因 构建表达载体 转化马铃薯 在3 5 s 加上反向连接的a g p a s e 大亚基e d n a 的融合基 因转化植株中 叶片的a g p a s e 活性仅为野生型的5 3 0 块茎中a g p a s e 活性转换 植株块茎淀粉含量仅为野生型的5 3 5 这也进一步说明了a g p a s e 在淀粉合成过程 中的重要作用 在不同植物中 编码每个亚基基因的拷贝数和表达情况很不相同 例如在水稻 a g p a s e 基因至少有3 个拷贝 因此a g p a s e 是由一个小的基因家族编码 就限制性 酶切片段而言 家族至少可分为2 类 8 k r i s h n a n 等 1 9 8 6 马铃薯中编码a g p a s e 大亚基的基因有3 个拷贝 小亚基有1 个拷贝 而在大豆中编码a g p a s e 大亚基的基 因仅有1 个拷贝 而小亚基却有2 个 马铃暮a g p a s e 大亚基基因的3 个拷贝在块茎 中均表达 而在叶中只有2 个拷贝表达 9 1 大豆a g p a s e 的1 个大亚基表达没有组织 特异性 但它的2 个小亚基基因却有明显的组织特异性 其中一个仅在豆英和叶片中 表达 另一个只在胚中表达 i o 有些植物 如大麦 的a g p a s e 的小亚基虽然只有一个 拷贝 但它通过不同启动子的表达调控从而合成了两个不同的转录体 一个在叶中表 达 另一个在胚乳中表达 事实上在植物不同组织或器官中表达不同的大 小亚基是 植物体对a g p a s e 的一个重要的调节方式 用这种方式可以形成不同结构的a g p a s e 它们表现出对变构调节物不同的敏感性 例如 在大麦 大豆的叶片中a g p a s e 对3 一 磷酸甘油和无机磷酸很敏感 而它们相应的胚乳和胚中的a g p a s e 对效应物的存在与 否并没有明显的区别 对水稻叶片的a g p a s e 免疫分析表明它是由两个不同的亚基 4 3 和4 6 k d a 组成 而在水稻胚只有一个亚基 5 0 k d a 组成 表明水稻叶片和胚乳中a g p a s e 的亚基数 量和大小是不同的 水稻胚乳叶片a g p a s e 都是组织特异表达 叶片中a g p a s e 对变构 调节敏感而胚乳中a g p a s e 则表现出钝感 研究表明 淀粉合成效率并不取决于 a g p a s e 的酶活性 而是a g p 觚e 对于变构效应物的敏感程度不同 对衣藻a g p a s e 的一个亚基突变体岱喇j 的分析表明 该突变体9 5 的淀粉合成效率下降的原因就是 因为突变后的a g p a s e 对3 磷酸甘油不敏感 1 2 b a l l 1 9 9 1 另一个来自玉米的a g p a s e 的突变从另一个侧面说明a g p a s e 对效应物反应的重要性 用转座子诱导突变的方法 诱导玉米胚乳中a g p a s e 的大亚基基因 s h r u n k e n 2 产生突变 结果突变后的玉米的每 粒种子的淀粉含量增加了1 5 其原因是 虽然大亚基突变导致a g p a s e 活力下降了 一半 但它表现出对抑制别无机磷酸不敏感 l 3 1 另外a g p a s e 基因 印 的表达具有明显的组织和时空特异性 对水稻种子发育 模式的基因表达的分析表明a g p a s e 的m r n a 转录物在开花后1 5 天达到最高水平 与此时淀粉积累速率最高相一致 1 也证明正是基因表达限制了淀粉积累速率 而且 a g p a s e 是同时通过种子发育过程中转录水平调控和酶水平的变构调控淀粉合成 表1 主要农作物淀粉合成关键酶及基因 t a b l e1 k e ye n z y m e sa n dg e n e si n v o l v e di ns t a r c hb i o s y n t h e s i si nm a j o rc r o p s 9 f 续表1 表2 淀粉合成关键酶的分子生物学研究 t a b l e2 m o l e c u l a rb i o l o g i c a ls t u d i e so nk e ye n z y m e si ns t a r c hb i o s y n t h e s i s 1 0 续表2 1 2 2 淀粉合成酶 s t a r c hs y n t h a s e s s 淀粉合成酶是一个葡萄糖转移酶 它以寡聚糖为前体 a d p g 为底物 通过a 1 4 糖苷键不断增加寡聚糖的葡萄糖单位 最终合成以a 1 4 糖苷键连接的聚糖 聚 糖又将作为淀粉分支酶的底物合成支链淀粉 淀粉合成酶依据它在淀粉体中存在状 态 可分为颗粒结合型淀粉合成酶 g r a n u l e b o u n ds t a r c hs y n t h a s e g b s s 和可溶性 淀粉合成酶 s o l u b l es t a r c hs y n t h a s e s s s 1 1 5 g b s s 存在于质体中 s s s 存在于细 胞可溶相中 动力学分析和突变分析显示a d p g 是两类酶共同的底物l l6 j m a c d o n a l d 和p r e i s s 1 9 8 3 1 2 2 1 颗粒结合型淀粉合成酶 g b s s 颗粒结合型淀粉合成酶是因其在缓冲液提取后仍保留在淀粉粒上而得名 颗粒结 合型淀粉合成酶多数时候是指植物的g b s s i 酶 g b s s i 是最早发现的g b s s 的同工型 也是研究最多的一类淀粉合成酶 我们常提到的w a x y 蛋白就是禾谷类植物中的这类 酶 未加特别说明时的g b s s b p 指g b s s i 其分子量约为6 0 k d 左右 当植物体内缺乏 g b s s i 蛋白时 1 7 t a k e d a 等 1 9 8 7 随后合成的淀粉便缺乏直链淀粉 利用反义r n a 技术特异地抑制植物体i 勾g b s s i 基因的表达 降低g b s s i 酶的活性 结果导致植物体 内淀粉中直链淀粉含量下降 这些事实表明g b s s i 主要负责植物直链淀粉的合成 但 在离体实验中它也能对支链淀粉的合成起作用 l8 m u r a ij 等 1 9 9 9 而在一些不含 w a x y 蛋白的突变体中也含有少量的直链淀粉 自 9 9 0 年w a n g 等从水稻中克隆该基因 后 现已获得了多种植物的g b s s i 基因的克隆 详细结果见表l w a n g 等 19 j 比较水稻 与玉米 大麦的序列 发现它们均含有1 3 个内含子和1 4 个外显子 外显子大小极其相 近 它们之间的核苷酸序列存在高度的同源性 而内含子大小差异大 且序列同源性 也较低 水稻胚乳直链淀粉的合成由耽位点控制 该位点的基因产物 w x 蛋白 是6 0 k d 左右的蛋白 紧密结合在淀粉粒上 由水稻v e x 基因推测的氨基酸序列表明 其多肽 r i d 7 7 个氨基酸的转运多肽和5 3 2 个氨基酸的成熟蛋白组成 耽 基因的表达调控是组 织专一性和发育时期专一性的 n o r h e m 杂交显示w x 基因在授粉后1 3 1 8 天表达最多 此后则几乎不表达 在基因积极转录时 w x 蛋白分子数量直线上升 王宗阳等1 2 叫 1 9 9 1 及蔡秀玲等 2 l 1 9 9 7 研究表明 不同水稻品种中胚乳直链淀粉含量受阡 基因转录后加工 尤其受第一内含子从前体m r n a 切除效应的调控 s a n o 等 1 9 8 6 根据非糯品种中脓蛋白的特性 进一步将脓基因分为蹄妒和蹄 两种类型 w x a 和耽6 在不同的水稻亚种间已经出现了明显的分化 其中籼稻 包括野生稻 中以蹦为主 直链淀粉含量较高 而粳稻中全为h p 直链淀粉含量较低 包劲松等田j 2 0 0 0 研 究水稻耽基因 c d 微卫星标记与稻米淀粉品质的关系发现 表观直链淀粉含量 糊 化温度 胶稠度和淀粉黏滞性谱等淀粉品质性状都与w x 基因有关 并提出利用微卫 星标记进行标记辅助选择的可行性 f e i k e 等 1 9 9 1 对双子叶植物马铃薯的g b s s 基因 结构测序分析表明 马铃薯g b s s 含有6 0 7 个氨基酸的前体蛋白 m r 为6 6 5 7 5 d 氨基 末端存在7 7 个氨基酸的转运多肽 前体蛋白转运入质体后被切除 而成为5 4 0 个氨基 酸 m r 为5 8 2 4 3 d 的成熟蛋白 不同物种植物的g b s s 从氨基酸顺序看 同源性较高 水稻与玉米同源性为8 8 水稻与大麦同源性为8 7 与马铃薯的g b s s 同源性也较 高