重叠pcr总结.doc

目的基因模板Y1 目的基因模板Y2引物分别为：P1,R1;P2,R21、 简易融合PCR1. 待融合片段的独立扩增 具体步骤：ddH2O 9.5ul2Gcbuffer 25ul用量参考TaKaRa目录dNTP 8ulPrimer 1 0.5ul (稀释后的浓度为25uM,终浓度0.25umol/L)Primer 20.5ul(终浓度0.25umol/L)LA Taq 0.5ul(产品浓度为5U/ul)总DNA6ul(浓度是0.05 ug/ul,质量为0.3ug)50ul体系反应程序95 5min94 1.5min65 30s3072 2min72 7minPCR后得到：目的基Y1 50uL，目的基因Y2 50uL。DAN电泳检测样品2. 融合 PCR反应 PCR产物 (不回收 )等体积混合为模板 ddH2O 4.5ul2Gcbuffer 25ul用量参考TaKaRa目录dNTP 8ulLA Taq 0.25ul(产品浓度为5U/ul)总DNAx ul(浓度是0.05 ug/ul,质量为0.3ug)25ul体系ss 、ss片段 (不回收 )的加入量依次以 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 L等体积混合 (对应的 DNA量分别约 2、4、6、8、10、20、40、60、80 ng 反应程序95 5min94 1.5min65 30s572 2min继续加入25uL反应溶液（Taq酶，dNTP ,buffer，引物G1和G4）继续pcr95 4min94 40min65 45s3072 1min72 10minPCR后得到：取5uL电泳检测，检查是否出现目的基因，切胶纯化2、 高效融合 PCR 1. 引物设计 大写序列为扩增片段的特异性引物序列, 小写序列为相邻片段的互补序列 特意序列为20左右，互补序列为202. 待融合片段的独立扩增 具体步骤：ddH2O 9.5ul2Gcbuffer 25ul用量参考TaKaRa目录dNTP 8ulPrimer 1 0.5ul (稀释后的浓度为25uM,终浓度0.25umol/L)Primer 20.5ul(终浓度0.25umol/L)LA Taq 0.5ul(产品浓度为5U/ul)总DNA6ul(浓度是0.05 ug/ul,质量为0.3ug)50ul体系反应程序95 5min94 1.5min65 30s3072 2min72 7minPCR后得到：目的基Y1 50uL，目的基因Y2 50uL。DAN电泳检测样品扩增产物用 0. 8% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 确定目的条带, 切胶 Ge l Extraction M ini K it回收。 待融合片段 引物 反应条件 长度 ( bp)A l A l1, A l2 35 cycles ( 95bC 40 s, 61bC 50 s, 72bC 3 m in) 1593Ab Ab1, Ab2 30 cycles ( 95bC 30 s, 61bC 30 s, 72bC 4 m in) 1966Ar A r1, Ar2 35 cycles ( 95bC 40 s, 61bC 50 s, 72bC 2 m in) 1037Bl Bl1, Bl2 35 cycles ( 95bC 40 s, 57bC 50 s, 72bC 6 m in) 3159Bh Bh1, Bh2 30 cycles ( 95bC 30 s, 58bC 30 s, 72bC 3 m in) 1451Br Br1, Br2 35 cycles ( 95bC 40 s, 58bC 50 s, 72bC 1. 5m in) 633C l C l1, Cl2 35 cycles ( 95bC 40 s, 61bC 50 s, 72bC 3 m in) 1593Cb Cb1, Cb2 30 cycles ( 95bC 30 s, 61bC 30 s, 72bC 4 m in) 1966Cr Cr1, Cr2 35 cycles ( 95bC 40 s, 61bC 50 s, 72bC 2 m in) 1062Ch Ch1, Ch2 30 cycles ( 95bC 30 s, 61bC 30 s, 72bC 3 m in) 1429 3. 融合 PCR反应 测定各回收产物中目的片段浓度, 在 50Ll体系中加入等摩尔的待融合片段 (要求 DNA 总量不少于800ng), 不添加引物, 使用 P fu DNA Polymerase 进行各片段的互补延伸,以形成全长的融合 PCR产物 (中间产物 )。 融合产物 待融合片段 反应条件 长度 ( bp)A lbr A ,l Ab, A r 11 cycles ( 95bC 15 s, 60bC 20 s, 72bC 9 m in) 4. 5B lhr B,l Bh, Br 11 cycles ( 95bC 15 s, 56bC 20 s, 72bC 10 m in ) 5. 2C lbrh C,l Cb, Cr Ch 13 cycles ( 95bC 15 s, 60bC 30 s, 72bC 10 m in ) 5. 9 4. 融合片段的全长扩增 融合产物全长扩增反应条件 融合产物 引物 反应条件 长度 ( bp)A lbr A l1, A r2 30 cycles ( 95bC 10 s, 61bC 30 s, 68bC 4 m in) 4. 5B lhr B l1, Br2 30 cycles ( 95bC 10 s, 57bC 30 s, 68bC 5 m in) 5. 2C lbrh