菌种鉴定实验过程.doc

菌种鉴定实验过程一、仪器与试剂1、仪器仪器名称仪器来源型号测序仪Applied Biosystems3730XLDNA电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN稳压电泳仪北京六一仪器厂DYY-5电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司DK-8D凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司FR980恒温培养箱太仓市科教器材厂DHP-9162恒温摇床太仓市实验设备厂TH2-CPCR仪Applied Biosystems2720 thermal cycler冷冻高速离心机BBIHC-2518RSurf系列精密单道可调移液器生工SP10-10001. 试剂试剂名称试剂来源cat. No.Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8255Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8259Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒生工SK8257DreamTaq-TM DNA PolymeraseMBIEP0702dNTP生工D0056琼脂糖BBIAB0014SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒生工SK8131DNA Ladder Mix maker生工SM0337引物生工合成部合成枪头、PCR管、离心管等生工铸塑部生产克隆测序用pMD18-T Vector 连接试剂盒TakaraD101ASanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒生工SK8191二、实验过程1、基因组DNA提取 按SK8255（细菌）、 SK8259（真菌）、 SK8257（酵母）试剂盒操作。2、PCR扩增2.1 菌种鉴定通用引物： 所属类别名称序列53扩增序列PCR长度/bp细菌7F1540RCAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA16S rDNA1500bp左右27F1492RAGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT16S rDNA1500bp左右真菌ITS1 ITS4TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGC内转录间隔区1和2600bp左右NS1 NS6GTAGTCATATGCTTGTCTCGCATCACAGACCTGTTATTGCCTC18S rDNA1300bp左右酵母菌NL1NL4GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGGGTCCGTGTTTCAAGACGG26S rDNA D1/D2区500bp左右2.2 PCR反应体系：试剂体积（l）Template（基因组DNA 20-50ng/l）0.510Buffer（with Mg2+）2.5dNTP （各2.5mM）1酶0.2F（10uM）0.5R（10uM）0.5加双蒸H2O 至252.3 PCR循环条件：温度时间程序944min预变性9445 sec30 cycle 5545sec721 min7210 min修复延伸4终止反应3、凝胶电泳1琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察（见电泳图DNA Ladder Mix make）。 16SrDNA 18SrDNA ITS 26S4、纯化回收PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131 ），PCR产物用PCR引物直接测序。如需要做克隆测序需要进行下面的步骤：5、连接 按Takara pMD18-T Vector 连接试剂盒操作。6、感受态细胞的制备：（氯化钙法）6.1 从于37培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1 L烧瓶中。于37剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转分)。 6.2 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至 0。6.3 于 4 , 以4000转分离心10分钟，回收细胞。6.4 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。 6.5 以10 ml用冰预冷的 0.1 molL CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。 6.6 于 4,，以4000 转分离心10分钟，回收细胞。 6.7 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。 6.8 每50ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。 6.9 将细胞分装成小份(100l/支)，放于-70冻存。 7、连接产物转化7.1 取100ml感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。7.2 加入10ml连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。7.3 42水浴热激90秒。冰上放置1520分钟。7.4 加400ml LB培养基，37 200250 rpm振荡培养1小时。7.5 用枪头吸取200 ml培养菌液，涂布在预先用20ml 100 mM IPTG和100ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨苄青霉素平板上。7.6 平板在37下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。8、蓝白斑筛选当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物b-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，9、质粒提取与测序用M13+_引物扩增（体系如上）。.M13+/-引物测序三、测序结果分析16SrDNA 序列在核糖体数据库/index.jsp 上比对；比对结果范例：domainBacteria (0/20/1186838) （界） phylumActinobacteria (0/20/176308)（门） classActinobacteria (0/20/176308) （纲） subclassActinobacteridae (0/20/167455) （亚纲） orderActinomycetales (0/20/166237) （目） suborderStreptomycineae (0/20/10027) （亚目） familyStreptomycetaceae (0/20/10027)（科） genusStreptomyces (0/20/9681) （属）S000691624 not_calculated0.9951242 Str