高质量果蝇基因组DNA的抽提1实验

湖北科技学院湖北科技学院 遗传学实验报告遗传学实验报告 实验名称实验名称SDSSDS 法高质量抽提果蝇基因组法高质量抽提果蝇基因组 DNADNA 实验器材实验器材 玻璃棒 烧杯 高速离心机 1 5ml 离心管若干 枪头 水浴槽 分析天平 移 液枪 紫外光分析仪 实验材料实验材料 活体果蝇若干只 实验药品实验药品 1 mol L Tris HCl pH 7 6 1 mol L Tris HCl pH 9 0 0 5 mol L EDTA pH 8 0 10 十二烷基硫酸钠 SDS 缓冲液 A 100 ml 含 Tris HCl pH 9 0 0 1mol L EDTA 2Na pH 8 0 0 1 mol L SDS 1 8 M 醋酸钾 100 ml Tris 平衡酚 pH 8 0 氯仿 TE 含终浓度 10 M Tris Cl pH 7 6 1 M EDTA pH 8 0 100ml 异丙醇 实验目的实验目的 1 掌握动物基因组 DNA 抽取的操作过程 了解 DNA 提取的意义 2 熟悉 DNA 的提取步骤和了解 DNA 定量测定的原理 方法 实验原理实验原理 核酸是重要的生物大分子之一 脱氧核糖核酸 DNA 是核酸的一种 DNA 是绝 大多数生物 除少数 RNA 病毒外 记录 存储 传递遗传信息的分子 近年来 分子生物学技术迅速发展 在分子遗传学研究领域的诸多方面涉及到抽提基因组 DNA 的方法 DNA 的提取是进行 PCR 扩增 Southern 杂交 限制性片段长度多态 性分析等实验的基础 使用消化缓冲液 使 DNA 从细胞中释放出来 65 摄氏度温水浴可加速 DNA 溶 解 酚 氯仿 异戊醇抽提可以将蛋白质与 DNA 分离 冷的异丙醇沉淀 DNA 70 的 乙醇洗去 DNA 表面的残留的有机溶剂 药品配制药品配制 一 储存液的配制一 储存液的配制 1 11 1 1 1 mol Lmol L Tris HCl pH 7 6 Tris HCl pH 7 6 在 800 ml 水中溶解 121 1gTris 碱 加入浓盐酸 60ml 调节 pH 值至 7 6 应在 溶液冷却至室温后最后调定 pH 值 加水定容至 1L 分装后高压灭菌 1 21 2 1 1 mol Lmol L Tris HClTris HCl pH 9 0pH 9 0 在 800 ml 水中溶解 121 1gTris 碱 加入浓盐酸 大约 30 多 ml 调节 pH 值 至 9 0 应在溶液冷却至室温后最后调定 pH 值 加水定容至 1L 分装后高压灭菌 1 31 3 0 50 5 mol Lmol L EDTA pH 8 0 EDTA pH 8 0 在 800 ml 水中加入 186 1g 二水乙二胺二乙酸二钠 在磁力搅拌器上剧烈搅 拌 用 NaOH 调节 pH 值至 8 0 约需 20g NaOH 颗粒 然后定容至 1L 分装后高 压灭菌 1 41 4 10 10 十二烷基硫酸钠 十二烷基硫酸钠 SDSSDS 药品配制药品配制 在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS 加热至 68 助溶 加几滴浓盐酸调节溶 液的 pH 值至 7 2 加水定容 1L 分装备用 无需灭菌 二 试剂的配制二 试剂的配制 2 12 1 缓冲液缓冲液 A 100A 100 ml ml 含含 Tris HCl pH 9 0 Tris HCl pH 9 0 0 1mol L0 1mol L EDTA 2NaEDTA 2Na pH 8 0 pH 8 0 0 10 1 mol Lmol L SDSSDS 1 1 按下列比例加入储存液 1 mol L Tris HCl pH 9 0 10 ml 0 5 mol L EDTA pH 8 0 20 ml 10 十二烷基硫酸钠 10 ml 加适量的水定容至 100 ml 2 22 2 8 8 M M 醋酸钾 醋酸钾 100100 mlml 将 78 56g 无水醋酸钾溶解于 90ml 去离子水中 定容至 100 ml 2 32 3 TrisTris 平衡酚 平衡酚 pH 8 0pH 8 0 2 42 4 TE TE 含终浓度含终浓度 10 M10 M Tris Cl pH 7 6 Tris Cl pH 7 6 1 M1 M EDTA pH 8 0 EDTA pH 8 0 100ml100ml 按下列比例加入储存液 1 mol L Tris HCl pH 7 6 100 l 0 5 mol L EDTA pH 8 0 200 l 加适量的水定容至 100 ml 实验步骤实验步骤 1 实验室乙醚已用完 将果蝇培养瓶放入冰箱内冷冻 代替乙醚麻醉 瓶口应 朝下放置 冷冻约 5min 2 取两支 1 5ml 离心管 每支离心管装入 15 只果蝇 再次放入冰箱内 冷冻 约 5min 3 加入 90 l缓冲液 A 4 用烧秃的枪头将果蝇充分地捣碎 放回冰箱里 枪头大小接近与离心管底 部大小 避免捣碎不充分 5 取出后 放在超恒温水槽 70 水浴中温浴 30min 每 1min 旋转混匀一次 使离心管内液体受热均匀 6 加入 15 l 醋酸钾 混匀 使离心管慢慢上下倒置 不能震荡混匀 实验步骤实验步骤 7 放入冰箱冰浴 30min 8 13000rpm 离心 15min 9 将上清转移至新的离心管 除去任何沉淀或界面杂质 10 加入 1 倍体积的氯仿 约 90 l 充分混匀 不是振荡 11 13000rpm 离心 5 分钟 12 重复 9 11 13 将上清液移至新的离心管 14 加入 50 l 异丙醇 充分混匀 15 10000rpm 离心 5 分钟 16 吸去上清 不要丢失沉淀 17 加入 1ml70 乙醇洗沉淀 18 13000rpm 离心 5 分钟 19 在真空干燥箱中使沉淀干燥 20 用 100 lTE 悬浮沉淀 结果与分析结果与分析 此次试验成功完成 并抽提出果蝇 DNA 进行两次抽提分四组 第一次在与 异丙醇混合后 用枪头挑弄有很细丝状物 此物可能为杂质也可能为 DNA 第二 组的在与异丙醇混合后有明显的黑色絮状物出现 此物为果蝇 DNA 第一组的结果分析 因为没有进行紫外线辨别 不能确定是否为 DNA 若不是 DNA 则未提取出来的原因可能有 1 冷冻 研磨不够充分 2 加入试剂后未混匀 反应不够充分或者是充分的振荡破坏了 DNA 分子 3 加入试剂量有误差 第二组的结果分析 1 DNA 成功提取出来 配置的相应的试剂浓度基本无偏差 2 在捣碎果蝇时 捣碎的足够充分 使得 DNA 和蛋白质复合物更易提取出来 而得到分离 3 相应的温浴 冰浴 冷冻时间充足 使得反应更加完全 以及离心的时间也完 全按照操作步骤 严谨不误 4 根据所加入果蝇的数量 每一步操作所加入试剂的量也严格加入 5 在加入氯仿时 混匀的充分 使得 DNA 蛋白质复合物中的蛋白质充分的变性 从而分离出 DNA 讨论与心得讨论与心得 在 DNA 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题 1 DNA 的二级结构和双链易受多种因素 如强酸 强碱 加热 低盐浓度 有机溶剂 酰胺类 尿素等 的影响引起双链解开 即 变性 因此抽提 时避免使用变性的条件 2 抑制内外源 DNase 的活力 DNase 就象一把刀 它能把大分子的 DNA 切成 碎片 所以要加以杜绝 现可以通过多种途径来做到这一点 a 低温操作 b 调节 pH 使偏碱 pH8 0 c 抽提液中加表面活性剂 d 加螯合剂 EDTA 除去酶的铺助因子 Mg2 使酶活性丧失 3 防止化学降解 如过酸或过碱以及其它化学因素 会使 DNA 降解 一般综 合考虑 取 pH8 0 左右为宜 4 防止物理因素降解 如温度太高或机械张力剪切等 DNA 分子特别大 极 易被机械张力拉断 甚至在细管中稍急一些的流动也会使 DNA 断裂 所以 在抽提过程中要特别注意这一点 操作过程要尽量简便 温和 减少搅拌次 数 也不要剧烈摇动 5 避免在操作过程中机械振动过于剧烈 以免 造成 DNA 的断裂 6 使用离心机要注意安全 先定时 再将转速从零慢慢增大 7 乙醇洗涤 DNA 后一定要晾干 否则电泳点样时样品容易上漂 8 移液抢使用时应垂直 9 若有沉淀或界面杂质 可将移液抢深入离心管底部 吸出沉淀杂质 小组成员小组成员陈少威 陈 亚 余 威 周建文 张 超 周数军 附 附 遗传学实验考核标准遗传学实验考核标准 一 实验名称合理一 实验名称合理 10 分分 A 实验名称简明扼要 包含了实验材料 目的和方法 9 10 分 B 实验名称包含实验材料 方法和目的 但不简明扼要 8 分 C 名称不全 7 分 二 实验材料和药品的准备二 实验材料和药品的准备 10 分分 A 实验材料选用合理 处理正确 实验药品配制准确 9 分 B 实验材料选用合理 处理基本正确 药品配制正确 8 分 C 实验材料 药品选用有误 但处理和配制正确 7 分 D 实验材料 药品选用有误 处理和配制有误 6 6 分 三 实验目的明确三 实验目的明确 10 分分 A 实验目的和所做实验相符 9 分 B 实验目的和所做实验有联系 但有误 8 分 C 实验目的和所做实验不相符 7 分 四 实验器材 仪器的准备四 实验器材 仪器的准备 10 分分 A 所选器材 仪器及耗材准备充分 9 分 B 所选器材 仪器及耗材准备合理 8 分 C 所选器材 仪器及耗材准备不充分 7 分 D 所选器材 仪器及耗材不能完成实验所有步骤 6 6 分 五 实验操作步骤五 实验操作步骤 10 分分 A 能熟练完成整个实验所有操作 仪器 器材使用熟练 9 分 B 能完成整个实验所有操作 仪器 器材使用一般 8 分 C 基本完成整个实验的操作步骤 7 分 D 不能完成 有 无 合理解释 5 6 分 六 实验原理的解释六 实验原理的解释 10 分分 A 实验原理叙述简明 扼要 对实验的关键步骤做合理的叙述 9 分 B 对实验原理叙述正确 对未对关键步骤做合理解释 8 分 C 对实验原理叙述不完全正确 7 分 D 对实验原理叙述不正确 5 6 分 七 实验结果准确性七 实验结果准确性 10 分分 A 实验结果准确 完美 9 10 分 B 实验结果准确 但不完整 8 分 C 有实验结果 但不完全体现 7 分 D 有实验结果 有 无 合理解释 5 6 分 八 实验结果解释合理八 实验结果解释合理 10 分分 A 对实验结果分析准确 9 10 分 B 对实验结果分析基本准确 8 分 C 对实验结果的分析有误 7 分 D 无实验结果 有 无 合理解释 5 6 分 九 讨论九