蛋白质工程在农业或医药方面的应用

第 1 页 共 5 页 蛋白质工程的研究进展及其农业医药应用展望蛋白质工程的研究进展及其农业医药应用展望 摘要 摘要 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术 是生物 工程中五大工程之一 本文对蛋白质工程作了简要概述 介绍了蛋白质工程的 特点 并从蛋白质结构分析结构 功能的设计和预测 蛋白的创造和改造等方 面对蛋白质工程研究内容进行详细论述 并以实例作了蛋白工程的应用 随着 社会和技术的不断发展 蛋白质工程技术在农业和医药方面的作用越来越突出 必将为社会的发展和许多重大社会问题的解决提供极大的支持 关键词关键词 蛋白质工程特点 研究内容 农业应用 医药应用 展望 蛋白质是生命的体现者 离开了蛋白质 生命将不复存在 可是 生物体 内存在的天然蛋白质 有的往往不尽人意 需要进行改造 由于蛋白质是由许 多氨基酸按一定顺序连接而成的 每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序 所 以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质 而氨基酸是由三联体密码决 定的 只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的 蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要 对负责编码某种蛋白质的基 因重新进行设计 使合成的蛋白质变得更符合人类的需要 这种通过造成一个 或几个碱基定点突变 以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术 称为基因定点 突变技术 蛋白质工程是在基因重组技术 生物化学 分子生物学 分子遗传学等学 科的基础之上 融合了蛋白质晶体学 蛋白质动力学 蛋白质化学和计算机辅 助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域 其内容主要有两个方面 根据需 要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质 确定蛋白质化学组成 空间 结构与生物功能之间的关系 在此基础之上 实现从氨基酸序列预测蛋白质的 空间结构和生物功能 设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质 这也是蛋 白质工程最根本的目标之一 目前 蛋白质工程尚未有统一的定义 一般认为蛋白质工程就是通过基因 重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质 实际上蛋白质工程包括 蛋白质的分离纯化 蛋白质结构和功能的分析 设计和预测 通过基因重组或 其它手段改造或创造蛋白质 从广义上来说 蛋白质工程是通过物理 化学 生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质 1 1 概念概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程 包括在体 外改造已有的蛋白质 化学合成新的蛋白质 通过基因工程手段改造已有的或 创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等 为获得的新蛋白具备有意义的新 性质或新功能 常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段 第 2 页 共 5 页 2 2 蛋白质工程基本途径蛋白质工程基本途径 从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序 列 找到相对应的脱氧核苷酸 基因 3 3 蛋白质工程研究内容蛋白质工程研究内容 3 13 1 蛋白质结构分析蛋白质结构分析 蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息 以便 建立结构与功能之间关系的数据库 为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究 奠定基础 三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变 了原有生物功能的必需手段 晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发 展 但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质 几毫克 几十毫克 制备出单晶体 然后再进行繁杂的数据收集 计算和分析 另外 蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同 在分析的时候要考虑到 这个问题 核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构 这种方法绕过了结晶 X 射线衍射成像分析等难点 直接分析自然状态下的蛋白质的结构 现代核磁 共振技术已经从一维发展到三维 在计算机的辅助下 可以有效地分析并直接 模拟出蛋白质的空间结构 蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态 机理 从某种意义上讲 核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变 国外有许 多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸 酶抑制剂与蛋白质的结合情况 以 开发 具有高度专一性的药用蛋白质 3 23 2 结构 功能的设计和预测结构 功能的设计和预测 根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据 可以预测 一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能 反之也可以根据特定的生物功能 设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构 通过基因重组等实验可以直接考察分析 结构与功能之间的关系 也可以通过分子动力学 分子热力学等 根据能量最 低 同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结 构和生物功能 虽然这方面的工作尚在起步阶段 但可预见将来能建立一套完 整的理论来解释结构与功能之间的关系 用以设计 预测蛋白质的结构和功能 蛋白质的改造 从简单的物理 化学法到复杂的基因重组等等有多种方法 物理 化学法 对蛋白质进行变性 复性处理 修饰蛋白质侧链官能团 分割 肽链 改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等 生物化学法 使用蛋白酶选择性地分割蛋白质 利用转糖苷酶 酯酶 酰酶等去除或连接不 同化学基团 利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等 以上方法只能对相同或相 似的基团或化学键发生作用 缺乏特异性 不能针对特定的部位起作用 采用 基因重组技术或人工合成 DNA 不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全 新的蛋白质 蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成的肽构成的 氨基酸 序列就是蛋白质的一级结构 它决定着蛋白质的空间结构和生物功能 而氨基 酸序列是由合成蛋白质的基因的 DNA 序列决定的 改变 DNA 序列就可以改变蛋 白质的氨基酸序列 实现蛋白质的可调控生物合成 在确定基因序列或氨基酸 第 3 页 共 5 页 序列与蛋白质功能之间关系之前 宜采用随机诱变 造成碱基对的缺失 插入 或替代 这样就可以将研究目标限定在一定的区域内 从而大大减少基因分析 的长度 一旦目标 DNA 明确以后 就可以运用定位突变等技术来进行研究 4 4 蛋白质工程的实际应用蛋白质工程的实际应用 4 14 1 提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性 葡萄糖异构酶 GI 在工业上应用广泛 为提高其热稳定性 朱国萍等人 在确定第 138 位甘氨酸 Gly138 为目标氨基酸后 用双引物法对 GI 基因进行体 外定点诱变 以脯氨酸 Pro138 替代 Gly138 含突变体的重组质粒在大肠杆 菌中表达 结果突变型 GI 比野生型的热半衰期长一倍 最适反应温度提高 10 12 酶比活相同 据分析 Pro 替代 Gly138 后 可能由于引入了一个吡 咯环 该侧链刚好能够填充于 Gly138 附近的空洞 使蛋白质空间结构更具刚性 从而提高了酶的热稳定性 4 24 2 蛋白质活性的改变蛋白质活性的改变 通常饭后 30 60min 人血液中胰岛素的含量达到高峰 120 180min 内恢 复到基础水平 而目前临床上使用的胰岛素制剂注射后 120min 后才出现高峰且 持续 180 240min 与人生理状况不符 实验表明 胰岛素在高浓度 大于 10 5mol L 时以二聚体形式存在 低浓度时 小于 10 9mol L 时主要以单 体形式存在 设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体 类胰岛素生长 因子 I IGF I 的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性 但 IGF I 不形成二聚体 IGF I 的 B 结构域 与胰岛素 B 链相对应 中 B28 B29 氨基酸序列与胰岛素 B 链的 B28 B29 相比 发生颠倒 因此 将胰 岛素 B 链改为 B28Lys B29Pro 获得单体速效胰岛素 该速效胰岛素已通过临 床实验 4 34 3 治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面 药物作用于癌细胞 特异性地抑制或杀死癌 细胞 药物保护正常细胞免受化学药物的侵害 可以提高化学治疗的剂量 疱 症病毒 HSV 胸腺嘧啶激酶 TK 可以催化胸腺嘧啶和其他结构类似物如 GANCICLOVIR 和 ACYCLOVIR 无环鸟苷磷酸化 GANCICLOVIR 和 ACYCLOVIR 缺少 3 端羟基 就可以终止 DNA 的合成 从而杀死癌细胞 HSV TK 催化 GANCICLOVIR 和 ACYCLOVIR 的能力可以通过基因突变来提高 从大量的随机突 变中筛选出一种 在酶活性部位附近有 6 个氨基酸被替换 催化能力分别提高 43 和 20 倍 O6 烷基 鸟嘌呤是 DNA 经烷基化剂 包括化疗用亚硝基药物 处理以后形成的主要诱变剂和细胞毒素 所以这些亚硝基药物的使用剂量受到 限制 O6 烷基 鸟嘌呤 DNA 烷基转移酶 O6 Alkylguanine DNAalkyltransferase AGT 能够将鸟嘌呤 O6 上的烷基去除 掉 起到保护作用 通过反向病毒转染 人类 AGT 在鼠骨髓细胞中表达并起到 保护作用 通过突变处理 得到一些正突变 AGT 基因且活性都比野生型的高 经检查发现一个突变基因中的第 139 位脯氨酸被丙氨酸替代 4 44 4 嵌合抗体和人缘化抗体嵌合抗体和人缘化抗体 免疫球蛋白呈 Y 型 由二条重链和二条轻链通过二硫键相互连接而构成 每条链可分为可变区 N 端 和恒定区 C 端 抗原的吸附位点在可变区 细 第 4 页 共 5 页 胞毒素或其他功能因子的吸附位点在恒定区 每个可变区中有三个部分在氨基 酸序列上是高度变化 在三维结构上是处在 折叠端头的松散结构 CDR 是 抗原的结合位点 其余部分为 CDR 的支持结构 不同种属的 CDR 结构是保守的 这样就可以通过蛋白质工程对抗体进行改造 5 5 蛋白质工程进展蛋白质工程进展 当前 蛋白质工程是发展较好 较快的分子工程 这是因为在进行蛋白质 分子设计后 已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成 最早的蛋白工程是 福什特 Forsht 等在 1982 1985 年间对酪氨酰 t RNA 合成酶的分子改造 工作 他根据 XRD X 射线衍射 实测该酶与底物结合部位结构 用定位突变技 术改变与底物结合的氨基酸残基 并用动力学方法测量所得变体酶的活性 深 入探讨了酶与底物的作用机制 佩里 Perry 1984 年通过将溶菌酶中 Ile 3 改成 Cys 3 并进一步氧化生成 Cys 3 Cys 97 二硫键 使酶热稳定性提 高 显著改进了这种食品工业用酶的应用价值 1987 年福什特通过将枯草杆菌 蛋白酶分子表面的 Asp 99 和 Glu 156 改成 Lys 而导致了活性中心 His 64 质子 pKa 从 7 下降到 6 使酶在 pH 6 时的活力提高 10 倍 工业用 酶最佳 pH 的改变预示可带来巨大经济效益 蛋白工程还可对酶的催化活性 底 物专一性 抗氧化性 热变性 碱变性等加以改变 由此可以看出蛋白工程的 威力及其光辉前景 上述各例是通过对关键氨基酸残基的置换与增删进行蛋白 工程的一类方法 另一类是以某个典型的折叠进行 从头设计 的方法 1988 年杜邦公司宣布 成功设计并合成了由四段反平行 螺旋组成为 73 个氨基 残基的成果 这显示 按人们预期要求 通过从头设计以折叠成新蛋白的目标 已是可望又可及了 预测结构的模型法 在奠定分子生物学基础时起过重大作 用 蛋白的一级结构 包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确 结合模 型法 通过分子工程来预测高级结构 已成为人们所瞩目的问题了 6 6 蛋白质工程在农业领域的应用蛋白质工程在农业领域的应用 蛋白质工程正在成为改造农业 大幅度提高粮食产量的新途径 如植物光 合作用是利用白光能将二氧化碳转化成贮成能量淀粉 在植物叶片中普遍存在 着一种重要的起催化作用的酶 它能固定住二氧化碳 这种酶叫核酮糖 二磷酸羧化酶 而这种酶具有双重性 它既能固定二氧化碳 又会使二 氧化碳在光照条件下通过光呼吸作用损失一半 即光合效率只有 现在 这种酶的三维结构已经搞清楚了 参与研究的工作人员认为 可以通过蛋白质 工程改造这种酶 控制其不利于人需要的一面 从而大大提高其光合作用效率 增加粮食产量 近年来 美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题 以蛋白质工程作 为设计优良微生物农药的新思路 他们实施对微生物蛋白质结构进行修改 仅 此一举 使微生物农药的杀虫率提高了 倍 7 7 蛋白质工程在农业领域的应用蛋白质工程在农业领域的应用 许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性 在酶反应器中可延长 酶的半衰期或增强其热稳定性 也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨 第 5 页 共 5 页 基酸抗氧化失活的能力 在这个领域已取得了一些重要研究成果 用蛋白质工 程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径 如人的 干扰素和 白细胞 是两种抗癌作用的蛋白质 但在它们的分子结构中 有一个不成对的 基因 是游离的 因而很不稳定 会使蛋白质失去活性 当通过蛋白质工程修 饰这种不稳定的结构就可以提高这两种抗癌物质的生物活性 美国的 公司成功地修饰了这两种治