基因工程第七章 基因工程的应用

第七章 基因工程应用,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,基因芯片技术,基因工程的应用,抗体,疫苗,激素,寡核苷酸药物,细胞因子,基因工程药物,7.1 基因工程药物,7.1.1 基因工程激素类药物,激素：是一类由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机化合物，通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效应。,激素（按化学性质分）,多肽蛋白类激素,甾醇类激素,脂肪酸类激素,基因工程类激素：主要指通过基因工程方法合成的蛋白多肽类激素。,胰岛素,胰岛素是最早从动物胰脏中分离出来的多肽蛋白类激素。胰岛素的合成：,胰脏胰岛的细胞,前胰岛素原,胰岛素原,成熟的胰岛素,跨膜运输,切除前导肽,在高尔基体内形成二硫键,切除C肽,合成,用基因工程生产人胰岛素的两种主要途径：,用发酵的方法生产胰岛素原，在体外将胰岛素原转变成胰岛素。（主要方法）先分别发酵生产人胰岛素的A链和B链，纯化后再在体外重组产生完整的人胰岛素。,生长激素,1985年，美国的FDA批准了第一代重组人生长激素上市。第一代重组人生长激素在大肠杆菌中表达，蛋白质的N端比天然的人生长激素多了一个甲硫氨酸残基。目前生产和使用的是第二代生物工程生长激素。第二代生物工程生长激素是以分泌蛋白的形式表达的，信号肽在分泌的过程中被自动切除而产生与天然蛋白完全一致的序列。,生长激素：是由动物脑垂体前叶分泌的一种能促进生长的蛋白类激素。,7.1.2 基因工程细胞因子类药物,细胞因子（Cytokine）：是由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽类物质。,大多数细胞因子是分泌型小分子多肽，少数细胞因子结合在细胞膜的表面。细胞因子通过与靶细胞表面的特异性受体结合后发挥作用。作用特点：多相性、网络性、高效性。生物学功能：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节机体造血功能、促进炎症反应。,细胞因子（按功能分）,干扰素（IFN）,集落刺激因子（CSF）,白细胞介素（IL）,肿瘤坏死因子（TNF）,趋化因子（chemokine）,生长因子（GF）,干扰素（interferon，IFN）,干扰素：是一类多功能细胞因子，按结构和来源可分为、三种。IFN -主要由白细胞产生，IFN -由成纤维细胞产生，IFN -主要由T细胞和NK细胞产生。,抗病毒感染,调控细胞的生长,调节免疫细胞发挥生理效应,干扰素的主要生理作用,临床应用：治疗白血病、乙型肝炎、丙型肝炎、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。,红细胞生成素（erythropoietin，EPO）,红细胞生成素：又称促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子，是一种集落刺激因子。它由肾脏和肝脏产生，其主要功能是刺激造血始细胞分化为红细胞，维持外周血中红细胞的正常水平。,1988年瑞士的Cilag公司上市了基因工程EPO。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）生产的重组人EPO于1989年被美国FDA批准上市，现已在全世界年销售额达数十亿美元，成为开发最成功的基因工程药物之一。,生产EPO的关键是建立高表达工程细胞，由于蛋白质的糖基化对其生物学活性很重要，因此以基因工程途径生产EPO不能利用大肠杆菌表达系统，只能利用哺乳动物表达系统进行生产。,EPO的临床应用：,肾功能衰竭导致的贫血；肿瘤及肿瘤放化疗所导致的贫血；骨髓增生异常综合症贫血；类风湿性关节炎和红斑狼疮所致贫血；艾滋病人因使用叠氮胸苷（AZT）治疗所致贫血。,干细胞因子（stem cell factor，SCF）,对骨髓造血干细胞和造血始细胞具有刺激效应。目前人重组SCF已完成临床实验并申请上市。SCF也可与其它细胞因子联合使用，以发挥不同的生理作用。,人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）,人表皮生长因子，因其可抑制胃酸的分泌，故又称抑胃素。它由53个氨基酸残基组成，广泛存在与人的各种体液中。,功能：对多种细胞具有刺激效应。临床应用：治疗外伤、溃疡、烧伤等。,白细胞介素（interleukin，IL）,简称白介素，是由多种免疫细胞产生的细胞因子，它是一类重要的免疫调节因子。,1972年这个家族的第一个成员IL-1被发现，它介导淋巴细胞的增值反应。1983年发现了IL-2，它在免疫系统中发挥核心调节作用。到目前已发现20多种白介素，分别以IL-1IL-20表示。,临床应用：治疗肿瘤及某些感染性疾病如结核杆菌感染等，还可用于治疗艾滋病。,基因工程IL-2于1992年由美国的Chiron公司生产并上市。,7.1.3 基因工程抗体,抗体：是在抗原物质刺激下产生的，能与相应抗原发生特异性免疫反应的蛋白质分子。,抗体的生理功能：与特异性抗原结合发生免疫反应，活化补体，通过与不同的受体结合而介导型变态反应调节吞噬细胞的吞噬功能。抗体的临床应用：抗肿瘤、抗感染、防止器官移植中的排斥反应、抗血栓的形成、解毒等。,鼠源单克隆基因工程抗体,单克隆抗体：是由识别一种抗原决定簇的细胞产生的均一性抗体，它反应的特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少。,解决措施：通过基因工程将鼠源单克隆抗体进行改进，构建人鼠嵌合抗体或人源化抗体。基因工程抗体的临床应用：用于抗肿瘤、抗病毒、抗移植排斥反应和抗过敏反应。,缺点：鼠源单克隆抗体在重复用药时会产生抗鼠抗体导致疗效降低。,小分子抗体,小分子抗体是针对完整抗体的分子量较大、不易透过血管壁等不足而进行改进的。,小分子抗体（按构建方法分）,Fab抗体,单链抗体,单域抗体,超变区多肽抗体,人源单克隆抗体,是针对鼠源单克隆抗体存在抗鼠免疫反应的缺陷而发展起来的。,制备人源单克隆抗体的两种方法,通过噬菌体,通过小鼠,7.1.4 基因工程受体,受体：是指细胞表面与各种配体如抗体等进行特异性结合的大分子物质，它一般为糖蛋白。受体的主要功能：接受并传递信号，将信号传递到细胞内后，引发细胞的调控系统并产生一系列生理变化。,受体（根据与受体结合的配体种类不同）,细胞因子受体,免疫球蛋白受体,补体受体,抗原受体,7.1.5 基因工程疫苗,基因工程疫苗,基因工程细菌疫苗,基因工程病毒疫苗,核酸疫苗,其它基因工程疫苗,7.1.5.1 基因工程细菌疫苗,基因工程细菌疫苗,基因工程痢疾菌疫苗,基因工程霍乱菌疫苗,基因工程结核菌疫苗,基因工程伤寒菌疫苗,7.1.5.2 基因工程病毒疫苗,基因工程病毒疫苗,基因工程亚单位疫苗,基因工程载体疫苗,基因缺失活疫苗,7.1.5.3 核酸疫苗,核酸作为疫苗的优点：,其诱生的免疫应答不仅针对特异表位的抗体，还可以针对特异表位的杀伤性T细胞；能扩大抗原的免疫原性；诱生杀伤性T细胞，清除病毒感染细胞和肿瘤细胞；可与其它免疫因子联合使用。,7.1.5.4 其它基因工程疫苗,艾滋病疫苗,寄生虫疫苗,其它基因工程疫苗,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,基因芯片技术,基因工程的应用,7.2 转基因植物,转基因植物(Transgene plant)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。 转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期或花期等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体发育中，以及正常生理代谢过程中的功能。,7.2 转基因植物,抗病毒虫害转基因植物 抗逆转基因植物 药物转基因植物 转基因植物食品 其他转基因植物,7.2.1 抗病虫害转基因植物,全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13%，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药，它不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大威胁。利用基因工程技术，目前已获得多种抗虫转基因植物：苏云金杆菌毒素转基因植物，蛋白酶抑制剂转基因植物，植物凝集素转基因植物，淀粉酶抑制剂转基因植物。,苏云金杆菌毒素转基因植物,苏云金杆菌是革兰氏阳性细菌在芽孢的形成过程中能产生大量的伴胞晶体，伴胞晶体主要由分子质量130kDa的-内毒素蛋白组成。根据毒素蛋白结构的同源性和抗虫范围可分为四大类：cry、cry、cry和cry。由于Bt毒素对哺乳动物无毒害作用，因而被广泛地用来构建抗虫转基因作物。经过长期不断的努力，20世纪90年代以来，以获得了多种具有较高抗虫效果的转基因作物。目前Bt毒素基因已成功转化了水稻、棉花、玉米、马铃薯、番茄、烟草、苹果、核桃、杨树、菊花和大豆等。,植物凝集素转基因植物,植物凝集素是一种糖蛋白或结合糖的蛋白质，存在于多种植物中，特别是富含于植物种子和储藏器官。当昆虫摄取含凝集素的食物后，植物凝集素于昆虫肠道粘膜上的糖配体结合，从而影响营养物质的吸收。,含雪花莲凝集素基因的马铃薯,淀粉酶抑制剂转基因植物,a-淀粉酶抑制剂广泛存在于植物种子和块茎中，尤其存在于植物种子和块茎中，尤其是在豆类好禾本科植物种子中含量丰富。他能抑制昆虫消化道淀粉酶的活性，使昆虫摄入的淀粉无法消化和水解，从而阻断昆虫的能量来源，最终导致昆虫发育不正常或死亡。 将该基因转移到烟草中，可获得能稳定表达的转基因植株，淀粉酶抑制剂能在种子中积累，体外实验表明，它对黄粉虫a-淀粉酶具有显著的抑制作用。,抗病毒转基因植物,植物病毒病害以成为植物病害的最大类群之一，随之基因工程技术的发展，为培育抗病毒的植物品种开辟了新的途径。目前已有多种方法获得抗病毒转基因植物： 利用植物自身编码的抗病毒基因培育抗病毒植物，病毒外壳蛋白转基因植物，病毒复制酶转基因植物，移动蛋白转基因植物，核糖体失活蛋白转基因植物，病毒卫星RNA转基因植物。,转基因番茄，对病毒表现强烈过敏反应。,病毒复制酶转基因植物,将病毒RNA复制酶基因改造后导入植物体后，看干扰病毒的复制，从而达到抗病毒的目的。将CMV缺损型复制酶基因导入烟草后，转化株对CMV表现了高度的抗性。,移动蛋白转基因植物,病毒在细胞间的移动主要受病毒本身编码的移动蛋白和寄主因素控制，移动蛋白能够修饰胞间连丝，同时又能与病毒核酸结合，是病毒核酸的三维结构改变成丝状的核酸-蛋白质复合体，有利于通过胞间连丝。将TMV的移动蛋白基因缺失突变后导入烟草中，转化株不仅对同一属的多种病毒具有抗性，而且对烟草脆裂病毒，黄瓜花叶病毒等具有抗性。,抗真菌转基因植物,植物对真菌等病害微生物的防御主要包括机械防护和生物学保护两个方面。当致病菌入侵植物时，植物细胞壁的结构发生变化，细胞壁的强度和硬度增加。另一方面，植物细胞被诱导合成多种活性物质如抗毒素和几丁质酶等，以抑制真菌的生长和入侵。,几丁质酶转基因植物,几丁质酶转基因植物。几丁质酶广泛存在于植物和微生物中，它能降解几丁质，该酶一般由单基因编码。由于几丁质是许多植物病原真菌细胞壁的主要成分，因而利用几丁质酶转基因植物在防治植物真菌病害中有重要作用。正常的植物中几丁质酶的活性很低，但当病原真菌侵染植物植物时能诱导产生很高的几丁质酶活性。Broglie等将菜豆几丁质酶的cDNA与CMV35S启动子重组，导入烟草和番茄中，转化株对立枯丝核菌的抗性显著提高。,转基因烟草,植物抗毒素转基因植物,植物抗毒素是植物对病原真菌侵染抵抗所产生的有毒性低分子化学物质。不同的植物科产生不同的抗毒素，将合成该抗毒素的关键酶合成克隆并导入烟草中，转化株对病原菌的抵抗能力大大提高。抗毒素存在于花生，葡萄等植物中，转化株对病原菌的抵抗能力大大提高。,7.2.2 抗逆转基因植物,植物的生活周期中会遇到各种各样不利的环境条件如盐碱、旱、寒和热等的挑战，面对这些不利的逆境，植物只能通过机体自我调节而生存下去。人类通过基因工程技术有目的的改造生物的特性，使之能在某些恶劣的环境下生长，从而为解决了人类生存与环境问题提供了新的途径。,7.2.2 抗逆转基因植物种类,抗盐转基因植物。抗旱转基因植物。抗冻转基因植物。抗除草剂转基因植物。（抗草甘膦除草剂）,1）抗盐碱转基因植物,面临的问题：全球盐碱地约占陆地面积的1/3， 在我国15亿亩耕地中约有1亿亩为盐碱地， 此外还有5亿多亩为盐碱荒地。盐碱如何影响植物生长：盐胁迫能抑制植物组织器官的生长，加速发育过程，使营养生长期和开花期缩短。盐胁迫对植物的光合作用具有抑制效应，光合作用的有关酶类受到抑制，导致植物光合作用能力下降。植物内源激素发生改变，如脱落酸（abscisic ABA）的水平明显上升。,转基因抗盐碱地,植物的耐盐是在一系列酶的调节下而发挥作用的，这些酶或蛋白分别参与植物的渗透调节、离子区域化和离子的选择吸收。参与植物细胞内渗透调节的是一类小分子有机化合物如脯氨酸、甜菜碱等，这些小分子的合成酶是耐盐相关基因研究的一个重点。通过对渗透调节剂合成基因的克隆和转移，可以大大提高植物的抗盐性。,例如：大肠杆菌+菠菜 （醛脱氢酶基因） 烟草高抗盐能力的烟草种,抗旱转基因植物,世界上有近1/3的地区属于干旱地区，干旱和沙漠化现象越来越严重，严重威胁到人类的生存和发展。那么，如何提高植物，尤其是农作物的抗旱能力呢？,美国加州大学戴维斯分校的植物学家罗莎黎伟罗认为，关键在于弄清植物在干旱的情况下是怎样死亡的。据他推测，这是由于缺水不恰当地激活了植物体内的叶子凋亡程序。若能抑制住这个程序，就可能大大提高植物的的抗旱力，而有一种名为IPT的基因就恰好可以延迟植物叶子的凋亡进程。,将含有IPT的基因片段添加到烟草(之所以选择烟草是因为它植株较大，生长迅速)的DNA内，然后观察转基因烟草(含有IPT基因的烟草)与普通烟草(不含IPT基因的烟草)在不同环境下的生长情况。结果表明，正常环境下，转基因烟草与普通烟草长得一样好；在其后15天的模拟干旱环境中，普通烟草叶子失去了叶绿素，变得枯萎，而转基因烟草则保持绿色，并且没有出现较明显的枯萎现象；恢复供应水分一周后，普通烟草枯萎死掉了，转基因烟草则很快恢复生机，且产量减幅很小。,7.2.3 药用转基因植物,目前许多蛋白类药物是通过微生物发酵和动物细胞培养等方法获得的，其成本高，产量远不能满足市场的需要。利用转基因植物为生物反应器生产蛋白类药物和疫苗是解决这一问题的一条较好途径。 利用转基因植物已生产出动物抗体、疫苗、生长因子和生长激素等多种具有药用价值的蛋白质或多肽。,转基因植物表达抗体指动物抗体的完整基因或基因片段被克隆后可在植物中进行表达。如：将免疫球蛋白重组抗体CD4基因转化烟草，获得能表达完整抗体的转基因植株。,转基因植物表达疫苗指将抗原基因导入植物并在植物中有效表达，人或动物摄入转基因植物或其中的抗原蛋白，从而产生对某种抗原的免疫应答。如：转基因烟草表达乙肝疫苗、疟疾孢子虫抗原、霍乱和腹泻。转基因马铃薯表达乙肝表面抗原。,优点：植物种植、培养条件简单能对真核蛋白质疫苗进行准确的翻译后加工，保持了自然状态下的免疫原性对人体安全，消除了动物载体对人体可能造成的潜在伤害使用方便，可直接口服免疫，并产生较强的体液和黏膜免疫反应易于加工运输，便于推广,带有乙肝抗原的药用大米,其他转基因植物,抗早衰转基因植物利用基因工程技术，使转基因植物抑制乙烯的合成或促进细胞分裂素的合成，可达到延缓植物衰老的结果。改变花色、花型的转基因植物如：将苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）的反义RNA转入红色的矮牵牛中，获得颜色变淡且红色与无色相间和全白色的两类花。利用转基因植物生产可降解塑料,7.2.4 转基因植物食品,随着人们生活水平的提高，人们越来越关注食物的口味、口感和营养价值等因素。为解决人口过多所引起的粮食相对不足的矛盾，提供可能。提高作物产量、改良作物品质提供一条崭新的途径。,转基因番茄 1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。,转基因甜椒,甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。,转基因油菜 油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。,玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。,转基因玉米,植物的产量与植物的光合作用具有密切关系 光反应 光能 化学能（ATP+NADPH）光合作用 C3途径 暗反应 将CO2还原成糖 C4途径（作用远高于C3途径） 因此，利用植物基因工程提高植物光合作用效率可以从两方面考虑，一方面抑制植物的光呼吸，减少能量损耗，另一方面：将C4途径的植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因导入C3途径植物中,得到新的转化株，达到提高产量的目的。,提高作物的产量,改良作物品质,不同的植物的可食用部位不一样，针对不同的植物，提高其可食用部位的营养成分（蛋白质、脂肪酸、维生素的种类和含量）的具体举措也不一样。,比如：谷物种子的醇溶蛋白的含量过多会影响氨基酸的平衡，因为该蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺，而赖氨酸和色氨酸的含量却很少，此外小麦面粉烤制面包时面团的伸展性由麦醇溶蛋白所决定。因此，如何改变种子储藏蛋白的种类和含量，使其蛋白质氨基酸等的组成平衡便于加工，是提高食品质量的一个关键问题。胰凝乳蛋白酶抑制剂富含赖氨酸，将其基因克隆后导入作物中，可提高种子储藏蛋白赖氨酸的含量。人们可以利用植物基因工程的技术，根据需要增减植物中饱和脂肪酸的含量。,随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾。自从 1983年首次获得转基因植物后，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。目前，农作物生物技术育种的研究已经不再处于实验室阶段，而是进入了实际应用，走到了商业化阶段。近年来，转基因植物在全球的种植面积增长迅速 .我国转基因植物的研究和开发取得了显著的进展。,21世纪植物转基因技术对于我国农业的可持续发展和13亿人中的食物安全将发挥重要的作用。我国作为一个农业大国，如果不加快生物技术发展，就难以在21世纪国际高技术产业化竞争中占有一席之地，我国的农业将会陷入受制于人的被动局面。 所以我国发展植物转基因技术的任务刻不容缓！,猜猜这是什么？,富含创意的香蕉玉米,长得多高的西瓜,富有创意的柠檬奇异果,不一般的菠萝,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,基因芯片技术,基因工程的应用,7.3 转基因动物,转基因动物（transgenetic animal），是指人类按照自己的意愿有目的、有计划、有预见地将外源基因导入动物细胞内，通过与染色体基因组进行稳定的整合，将生物性状传递给后代动物。,外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞,选择获得携有目的基因的细胞,选择合适的体外培养系统和宿主动物,外源目的基因的制备,转基因细胞胚胎发育及鉴定,筛选所得的转基因动物品系,转基因鼠的培育流程,7.3 转基因动物,7.3.1 利用转基因动物改良动物品种,7.3.2 转基因动物作为生物反应器,7.3.3 转基因动物筛选药物,7.3.4 转基因动物应用于人体器官移植,7.3.1 利用转基因动物改良动物品种,7.3.1.1.利用转基因动物技术提高动物的繁育速度,7.3.1.2.利用转基因动物技术改善动物品质,7.3.1.3.利用转基因动物技术培育抗病害动物品系,7.3.1.1.利用转基因动物技术提高动物的繁育速度,1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。,按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等,7.3.1.2.利用转基因动物技术改善动物品质,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组中，获得了能生产低乳糖或无乳糖乳汁的转基因牛，这样就能更好地满足人们的需求。 此外，通过转基因的方法还能增加牛奶中酪蛋白的含量、模拟人乳组分等等。 去除myostatin基因可延长肌肉的生长和改善肉的嫩度。 GH基因能提高瘦肉产率和饲料利用率。 IGF-1基因有助于提高羊毛产量。此外，将毛角蛋白2型中间细丝基因导入绵羊基因组中，转基因绵羊长出的羊毛光洁亮丽，羊毛中羊毛脂的含量明显提高。,7.3.1.3.利用转基因动物技术培育抗病害动物品系,将禽白血病毒包衣糖蛋白基因导入肉鸡的基因组中，转基因鸡能大量表达游离包衣糖蛋白，当禽白血病毒侵染宿主时，过量的包衣糖蛋白与宿主细胞表面受体特异性结合，从而阻断病毒的感染途径。,7.3.2 转基因动物作为生物反应器,生物反应器,（1）微生物发酵 缺点：表达蛋白不能折叠而丧失生物学活性；成本 昂贵。（2）哺乳动物细胞培养 缺点：细胞培养困难，表达量低，成本昂贵。（3）转基因动物 质量大大优于通过微生物发酵获得的产品，生产成本大大降低,转基因动物生物反应器,动物乳腺生物反应器动物血液生物反应器动物分泌腺体生物反应器,动物乳腺生物反应器,原理：将药用蛋白基因连接到乳腺蛋白质基因调节元件下游，然后将重组基因转化哺乳动物胚胎干细胞或受精卵，当转基因胚胎长成个体后，通过乳汁分泌获得表达蛋白。,动物乳腺生物反应器,优点：可使药物蛋白基因限于乳腺中高表达，能进行大量生产。表达蛋白质随乳汁及时排出体外，能促进药物蛋白基因的高水平表达。乳腺组织细胞具有蛋白质修饰功能，表达产物具有较高的生物学活性。蛋白质提取纯化的工艺简单,动物血液生物反应器,可用来生产人血红蛋白、抗体和非生物学活性状态的融合蛋白，对于有活性的蛋白质或多肽则不合适，因它会通过血液循环进入组织细胞而影响转基因动物的健康。,是利用转基因技术建立敏感动物品系和生产与人类相同疾病的动物模型来进行药物筛选,7.3.3基因工程的应用转基因动物筛选药物,利用转基因动物筛选抗肿瘤药物,Mickisch等利用转基因技术建立多药转基因鼠模型使多药耐药性基因在转基因鼠骨髓中表达，在骨髓细胞表面产生多药转运蛋白，然后测量转基因鼠能否保护骨髓细胞免受化疗药物的损害。 从而可筛选新抗肿瘤药物。,利用转基因动物筛选抗艾滋病病毒药物,HIV对感染宿主有高选择性，只有长臂猿和黑猩猩对其敏感，但这两种动物不能用于医学研究。Ruprecht等用转基因鼠对-干扰素和齐多夫定（AZT）治疗艾滋病及病毒血症进行研究，结果表明2种药物联合使用可100%抑制病毒血症的发生。还有Mehtali等建立了一种双基因系统转基因鼠模型，也可以用来筛选新的抗艾滋病药物。,转基因动物还被用于筛选抗其他疾病药物,抗乙肝病毒（HDV）的药物筛选内皮素（ET）受体拮抗剂的筛选,转基因动物筛选与传统筛选的比较：,7.3.4 转基因动物应用于人体器官移植,20世纪的一项伟大创举是人体器官移植，这项技术拯救了无数重危病人的生命，而且带来了近代医学的一场深刻革命。该领域的先驱者马斯博士因此获得了1990年诺贝尔医学奖。,器官移植已成为许多终末期疾病首选的治疗方法。全世界至今接受心、肝、肾等移植者已达60余万例。但随着外科手术的成功，免疫抑制剂的不断发展，移植成功率的提高，出现了供体严重短缺现象。,目前，只有1/2的患者有机会接受移植，大约有1/5的患者在等待中死亡。等待器官移植时间越长，患者死亡机率越大。因此，供者器官来源不足严重困扰着器官移植手术的推广和应用。,器官移植面临着两个难题：,一是供移植用的器官来源不足；,二是人体对移入的导体器官产生免疫排斥反应。,“动物人体”异种器官移植!,用实验动物组织和器官代替人类器官的优点：, 动物器官取之不尽； 动物器官比人造器官更具自然和生物性； 动物器官随用随取，可克服使用人体器官 存在的一些伦理及法律问题。,人 VS 猪,平均体重 60kg 4080kg 体 温 3637 3637 心 率 60100 次/min 5560 次/min,人体对移入的导体器官产生免疫排斥反应,人体内存在针对异种动物组织抗原成分的天然抗体( nature antibody) ，其针对的靶分子是猪血管内皮细胞表面的- 半乳糖成分。异种器官移植后，可出现由天然抗体介导的、补体依赖的细胞毒效应，引起移植物血管内皮细胞溶破、血栓形成以及炎症反应，导致超急性排斥反应(hyperacute rejection) 的发生，从而使移植器官发生不可逆性缺血、变性和坏死。应用免疫抑制药物对抗异种移植排斥反应效果不佳。 目前，通过层析技术，清除受者血清内的抗半乳糖天然抗体，有可能克服异种器官移植超急性排斥反应。但在克服了超急性排斥反应后，异种移植尚须防治以T细胞效应为主的急、慢性和迟发型排斥反应，难度也很大。,如果动物的器官移植到人的身上，人是否会显示动物的特征呢? 如果某人在生育前就进行了异种器官移植，他的下一代体内会不会存在动物的基因? 这会不会威胁人类的安全? 异种器官移植是否破坏自然法则? 是否会被错用或滥用?,？,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,基因芯片技术,基因工程的应用,7.4 基因治疗,基因治疗：是指以正常的基因替代或修补病人细胞中的缺陷基因从而达到治疗疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。,1990年9月14日，美国年仅4岁的女孩阿尚蒂接受了世界上第一例基因治疗临床试验。,基因治疗,体细胞基因治疗,生殖细胞基因治疗,基因治疗,体外基因治疗,体内基因治疗,体外基因治疗,从患者体内取出带有基因缺陷的细胞并培养。通过基因转移进行遗传修正。将修正后的细胞通过融合或移植的方法转入患者体内。,体内基因治疗,体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。,基因治疗技术的四个环节,基因诊断,基因分离,载体构建,基因转移,用于治疗的基因,正常基因,反义基因,自杀基因,基因诊断：,是指利用多种基因检测技术对人体病变基因进行定位分析。,基因分离：,是指利用DNA重组技术克隆、鉴定、扩增和纯化用于治疗的基因，并根据病变基因的定位，与特异性整合序列和基因表达调控元件进行体外重组。,体内疗法,体外疗法,表达载体的构建是基因治疗成功与否的关键。,病毒型载体,非病毒型载体,目前基因治疗中使用的载体,基因转移方法,7.4.1 肿瘤的基因治疗,7.4.2 分子遗传病的基因治疗,7.4.3 心血管病的基因治疗,7.4.4 艾滋病的基因治疗,肿瘤的基因治疗,肿瘤的发生与细胞中染色体DNA结构的变化密切相关。传统方法治愈率低，复发率和死亡率高。随着越来越多的肿瘤基因被克隆，基因治疗已成为一种新型的有效的方法,基因治疗策略,抑癌基因治疗法基因修饰疫苗法免疫基因治疗法自杀基因治疗法,抑癌基因治疗法,原理：抑癌基因的失活与癌基因的激活是其中的关键环节，如果向患者导入抑癌基因、恢复人体抑制肿瘤的功能，从而可以达到治疗的目的。通过抑癌基因与宿主体内癌基因的DNA或mRNA结合而达到目的P53，RB,WT1,NF1，DDC等,基因修饰疫苗,将外源基因导入肿瘤细胞，试图改变细胞的致瘤性和增强免疫原性，有利于被机体T细胞识别，进而被机体消灭。过程：细胞因子基因的克隆构建重组反转录病毒载体缺陷型重组反转录病毒的包装肿瘤细胞的转染和检测白介素系列基因，干扰素基因等,肿瘤的免疫基因治疗,利用免疫基因对肿瘤进行治疗的方法。包括：肿瘤的细胞因子基因治疗，肿瘤的MHC基因治疗，肿瘤抗原靶向的基因治疗，肿瘤的共刺激分子基因治疗，抗体介导的肿瘤免疫基因治疗和综合性肿瘤免疫基因治疗等。,自杀基因治疗肿瘤,自杀基因是一类前体药物酶转化基因、药物敏感基因或酶-前体药物激活基因。Tk GCV系统，CD-5-FC系统等,分子遗传病的基因治疗,血友病的基因治疗地中海贫血的基因治疗,血友病的基因治疗,血友病：一种遗传性出血疾病，它是因血液中缺乏凝血因子而引起的严重凝血功能障碍。 根据缺乏凝血因子的不同，分为： 血友病A 血友病B 血友病C,1991年，血友病B成为世界上第二个进行基因治疗的遗传病。 人凝血因子是一种分子质量为56kDa的糖蛋白，其中糖的含量约占整个分子的17%。 该蛋白质由肝细胞产生，在肝内经一系列酶学的修饰，变为成熟的hF，然后分泌到血液中，参与血液凝固过程中的一系列反应， hF在血液中的半衰期为20h。,1982年，英国牛津大学的Brownlee等克隆了hF的cDNA及全序列DNA。 完整的hF mRNA总长度为2802个碱基，在5端有一段29个碱基的非编码序列，在3端有一段长度为1390个碱基的非编码区。 目前发现的血友病B病例几乎都是由于hF基因结构异常变化而引起的。,血友病B基因治疗采用皮肤成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞等作为靶细胞。 基因转移的方式包括DNA直接注射、反转录病毒途径、腺病毒途径等。 1985年，Anson等首次将人hF cDNA基因转移到大鼠和人皮肤成纤维细胞，首先提出利用人皮肤成纤维细胞途径治疗血友病B的设想。 1991年，复旦大学遗传学研究所与上海市长海医院等合作将两例血友病B患者进行了世界上首次血友病B基因治疗的临床特殊试验。,血友病A在临床上的症状与血友病B类似。 凝血因子的分子量较大，总长为2332个氨基酸残基，天然hF的分子质量为330kDa。 1984年，美国加州旧金山Genentech.Inc.的研究人员成功克隆了人的凝血因子的基因。 Toole等构建了hF结构域缺少的hF cDNA表达载体，不仅没有影响F的活性，而且使表达量和活性比全长F cDNA提高了10倍。,地中海贫血的基因治疗,地中海贫血：由于珠蛋白与珠蛋白基因表达失调而引起的遗传性溶血疾病，其中以地中海贫血病的危害较为严重。 人类珠蛋白基因是由多个基因组成的基因簇，其中珠蛋白基因簇位于16号染色体短臂上，珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂上。,根据珠蛋白表达的发育阶段特性可将珠蛋白分为三类: 胚胎珠蛋白基因（、） 成年珠蛋白基因（、） 胎儿珠蛋白基因（G、A）,地中海贫血由于珠蛋白基因缺失或其他功能障碍使得珠蛋白的合成减少或不能合成。 分为三类： 地贫1（两个基因缺失） 地贫2（缺失一个基因） 地贫3（非基因缺失型，个别碱基突变）地中海贫血是由于珠蛋白合成显著减少或完全不能合成而引起的。,心血管病的基因治疗,心血管疾病 单基因遗传病 多基因心血管病 是危害人类生命健康最严重的疾病之一，其发病率和病死率均为各疾病之首,单基因心血管疾病,分类 家族性高胆固醇血症 遗传性扩张性 心肌病 肥厚性心肌病 长Q-T综合征 遗传性心肌营养不良,医疗进展 1993年 美国费城医学中心 肝细胞体外培养 重组LDL-R反转录筛选大量培养 门静脉肝脏 1996年 极低密度脂蛋白受体基因(VLDL-R)腺病毒介导注入肝脏 1999年 利用假型反转录病毒载体(VSV-G)代替MMLV,通过转染将LDL-R基因导入肝细胞,多基因心血管疾病,分类 梗塞性血管病 高血压 动脉粥样硬化 心肌肥厚 新功能不全,医疗进展 1995年 Isner 最先应用VEGF基因治疗 1997年 美国FDA批准VEGF的临床应用 1998年 Shyu 证明裸血管生成素-1的质粒有促进新血管的生成和 侧枝循环的建立,高血压 治病机理尚不清楚，是一种最常见的心血管病。 参与血压调控的基因有 上调血压 血管紧张素系统基因 下调血压 心钠素基因、激肽释放酶基因,艾滋病的基因治疗,HIV是反转录病毒，其中含有病毒基因组RNA和反转录酶。HIV-1和HIV-2,HIV-1的基因是由双拷贝的单链RNA构成，两端的长末端重复序列中有polyA，TATA以及调节病毒基因组转录的顺式活性调节序列。Gag- P24,p17,p15 病毒的颗粒组装Env gp120,gp41 病毒的感染Pol 逆转录酶，蛋白酶，整合酶除此之外，还有6个调节基因对病毒复制起关键作用。Trt,rev,vpu,nef,vpr,vif,Gag- P24,p17,p15 病毒的颗粒组装Env gp120,gp41 病毒的感染Pol 逆转录酶，蛋白酶，整合酶,HIV的基因治疗是利用物理或化学的方法，将目的基因导入合适的靶细胞内，间接或直接抑制癌细胞的复制，或提高机体对艾滋病病毒的免疫能力。靶细胞HIV敏感型的细胞。如人的T淋巴细胞目的基因通过病毒导入靶细胞,HIV感染的基因治疗途径,利用反义核酸互补病毒RNA或DNA抑制相应基因表达利用PRE和TRA的类似物竞争性的结合病毒调节蛋白Tat和Rev，抑制mRNA的合成和运输利用细胞内抗体清除HIV外壳蛋白将突变的病毒基因导入HIV感染细胞，表达相应的蛋白，抑制其复制利用细胞内趋化因子关闭病毒进入细胞的通道,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,基因芯片技术,基因工程的应用,7.5 基因芯片,基因芯片简介 基因芯片的原理 基因芯片的相关技术基因芯片的应用基因芯片技术的研究方向及当前面临的困难我国基因芯片的研究现状,Questions:,1.基因芯片技术的出现对人类的发展是利还是弊呢?2.基因芯片究竟能给人类带来什么好处?,7.5.1基因芯片的简介,怎样去研究如此众多基因序列数据在生命过程中所担负的功能 ?基因芯片:又称DNA芯片、生物芯片. 该技术系指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后,与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析.而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。,7.5.2 基因芯片的原理,基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法.基因芯片技术应用了三种关键技术: 微阵列制作技术 探针杂交技术 扫描分析处理技术在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。,7.5.3 基因芯片的相关技术,(1) 微阵列制作技术制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。1.基因芯片载体 (1) 载体材料要求 A.表面具有可进行化学反应的活性基团 B.惰性的,有足够的稳定性 C.单位载体结合的DNA分子能达到最佳容量 D.具有良好的生物兼容性,(一) 微阵列制作技术,(2)载体材料类型无机材料天然有机材料人工合成的有机高分子聚合物各种高分子聚合物制成的膜目前适合制作基因芯片的载体材料: 硅片,玻璃片,瓷片,聚丙烯膜,尼龙膜等,(一) 微阵列制作技术,2.探针DNA或RNA分子主要来源于从细胞中提取的mRNA反转录后的cDNA文库.还利用PCR扩增技术和DNA固相合成技术获得所需要的各种基因序列.3.制作方法 (1)点接触法:由点样机将DNA探针分子直接点接到载体上 (3000个点每平方厘米) (2)喷墨法:通过压电晶体或其他推进方式将生物分子从微小的喷嘴喷射到载体上 (10 000个点每平方厘米) (3)光刻DNA合成法:将光不稳定保护基团的四种DNA模块固定在玻片上,通过光脱保护,以少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列合成DNA (250 000组每平方厘米),三.基因芯片的相关技术,(二) 探针杂交技术1.样品制备 必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。2.杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。 影响异源杂交双链形成的因素:靶标浓度,探针浓度,核酸分子的碱基组成,盐浓度,温度等,三.基因芯片的相关技术,(三)扫描分析处理