【毕业学位论文】（Word原稿）甜味蛋白Brazzein在番茄中的遗传转化研究蔬菜育种学硕士论文

密级： 论文编号 中国农业科学院 学位论文 甜味蛋白 番茄中的遗传转化研究 in in I 摘 要 甜度是番茄品质性状的一个重要指标，人们在食用番茄时往往喜欢加一些蔗糖提高甜度，但吃糖过多不利于健康。因此，培育果实甜度高而含糖量不高的品种是番茄营养品质育种的和多样性育种的一个目标。基因工程育种是实现这一目标的有效途径。甜味蛋白 一种高甜度、低热量、天然、安全的新型甜味剂，与蔗糖不同，它不会引起龋齿、心血管疾病及糖尿病人的胰岛素反应。用 化番茄，不仅可以改善番茄的品质，培育适合糖尿病人食用的番茄新品种，还可以以番茄作为生物反应器生产甜味蛋白，进行甜味蛋白的商业化生产。本研 究通过农杆菌介导的番茄叶盘转化法进行番茄的遗传转化，在构建 行了甜味蛋白在番茄中的遗传转化研究，试验过程中得到的结果如下： 1、 建立了番茄转化再生体系： 在 基础上构建转化载体，根癌农杆菌 导，叶盘转化法建立了番茄转化再生体系。筛选了适于番茄转化的培养基的配方；确定了 100mg/l 的卡那霉素为番茄转基因的最适抗性筛选浓度；明确了美味樱桃番茄、中蔬 4 号和丽春为再生能力强、适于基因转化的番茄品种，在转化过程中始终以 100mg/l 卡那霉素进行连续 的转化苗的筛选工作，极大的减小了转化植株的验证和栽培管理工作量，提高了转化生根植株的阳性比率，在最后得到的所有生根植株中阳性株比率超过 90%。 2、克隆了 动子并分析了其果实特异表达功能： 利用同源克隆的方法，从番茄红玛瑙 213 基因组中 法克隆到 1121启动子 列，构建了由 动子启动的 达载体 对它的功能进行了验证， 获得了美味樱桃番茄转 动子基因材料 。对 基因番茄进行了载体整合与表达的分析，通过基因组 证了 因的整合，一步 实了 因在转基因成熟果实中的转录表达，并且在果实中表达水平显著高于 基因番茄。基因番茄的各组织器官和不同发育时期的果实经组织化学染色后 因的表达表现出了果实发育阶段特异性和组织特异性。上述结果证明了 一个可用于转基因的果实特异性启动子。 3、合成了 因，并获得了转基因番茄材料： 通过 增合成了 码基因，并对 因进行了 T 克隆。构建了 B和 个植物表达载体。 叶盘转化法得 到了 中蔬 4 号和丽春 B 和 B 转基因番茄植株。反转录检测到了 因在转基因果实中的转录表达。对转基因果实的甜度进行了感官评价和可溶性含糖量的测定。转基因番茄果实的含糖量与野生型对照和 基因番茄对照相比没有发生改变，但转基因番茄的甜度显著高于两个对照。 关键词：番茄，果实特异性 , 启动子，甜味蛋白， is of 00We in at by We a 8P1 a a in in o. 4 1、 of an We in as a to We 00mg/l in o4 i 00 mg/l in of to In 90% of 2、 of a We 13 121bp 8P1 US 8of NA of US in at a 5S:in of US 8US in 8P1 as an in 3、 in e CR a 162CR a T We We of at of 录 摘 要 . . 一章 文献综述 . 1 1 甜味蛋白 究进展 . 1 味蛋白研究概况 . 1 内外利用甜味蛋白基因转化高等植物的研究进展 . 5 2 番茄果实特异表达启动子 . 8 8 启动子 . 9 因启动子 . 9 G 基因启动子 . 10 成酶基因启动子 . 10 3 甜味蛋白 因转化番茄的目的意义和前景展望 . 10 第二章 材料与方法 . 12 1 实验材料： . 12 茄试材 . 12 2 实验方法 : . 12 化体系建立及转化载体和菌株 . 12 8动子的功能验证 . 13 味蛋白 因的合成及其克隆 . 13 2.4 个转化载体的构建过程及方法 . 16 化植株的分子鉴定 . 20 3 生理水平上检测转基因植株的风味变化和糖含量比较试验 . 23 甜味蛋白番茄的品尝试验设计： . 23 基因植株中影响番茄甜度的可溶性糖含量的测定： . 23 第三章 结果与分析 . 24 1 番茄转化再生培养体系的建立 . 25 茄转化再生培养流程图 . 25 果分析 . 27 2 番茄果实特异表达启动子 克隆及功能研究 . 31 8序列 . 31 过构建转化载体 化番茄验证 功能 . 32 3 因合成及克隆 . 36 成 因并进行 克隆 . 36 得到的 克隆阳性菌落进兴酶切鉴定和测序 . 36 4 体的构建及转化到根癌农杆菌 . 37 建好的 体图 . 37 组阳性克隆的分子生物学鉴定 . 37 4.3 化到农杆菌 . 39 5 甜味蛋白 番茄的遗传转化 . 39 杆菌介导的番茄转化及转基因植株的分子鉴定 . 40 第四章 讨论 . 47 1 番茄转化再生体系的讨论 . 47 2 动子果实特异表达功能分析 . 47 3 甜味蛋白基因对番茄的遗传转化分析 . 48 第五章 结论 . 50 参考文献 . 51 V 图 表 目 录 表 1 七种甜味蛋白的特征 . 2 图 1 果实 . 3 图 2 白骨架结构上决定甜味活性的关键氨基酸残基位点 , . 3 图 3 体图 . 18 表格 2 葡萄糖标准曲线的制作方法 : . 24 表格 3 样品中含糖量的测定方法 . 24 图 4 番茄转化再生培养流程 . 26 表格 4 度的筛选 . 28 表 5 三个番茄品种的转化再生能力比较 . 28 图 5 番茄转化再生培养过程图片 . 29 图 6 番茄基因组 泳检测图 . 30 图 7 测 化得到的转化植株 . 30 图 8 茄果实特异表达载体 . 32 图 9 基因植株的基因组 定 . 33 图 10 动子果实特异性 转录调节功能的一步 测 . 33 图 11 组织化学方法检测 35s 调控下 因在番茄叶片和果实中的表达比较 . 34 图 12 转基因支柱花药中的表达检测 . 34 图 13 基因植株根部的表达比较 . 35 图 14 在相同染色时间内 化阳性株果实不同发育时期的染色效果 . 35 图 15 成 因的编码基因 图 16 增鉴定 克隆 . 36 图 17 酶切鉴定 重组质粒 . 36 图 18、 元表达载体图 . 37 19 测转化到大肠杆菌的 性克隆 . 38 图 20 35s 上游引物与 游引物 增鉴定 . 38 图 21 酶切结果 . 38 图 22 化到农杆菌中的检测 . 39 图 23 化到农杆菌中的检测 . 39 表格 6 各种转化载体转化得到的转基因番茄列表 . 40 图 24 转基因番茄的基因组 泳检测结果 . 41 图 25 一步 证 基因植株中 转录水平表达 . 41 图 26 一步 证 转基因番茄叶片中的积累 . 41 表格 7 第一次转基因番茄甜度品尝试验结果 . 42 表格 8 第二次转基因番茄甜度品尝试验结果 . 42 表格 9 手持测糖仪测定转基因番茄可溶性糖含量结果 . 43 图 27 葡萄糖标准曲线 . 44 表格 10 转基因番茄可溶性糖含量分析 . 44 图 28 A、 B 两组转基因番茄组内单株间可溶性糖含量比较分析 . 45 图 29 . 46 图 30 边缘序列的启动子元件结构 . 47 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 1 甜味蛋白 酸、甜、苦、辣、咸五味中甜味是最受欢迎的味觉，作为甜味剂的蔗糖一直是我们生活中不可缺少的甜味剂，然而蔗糖的过量摄入则会引起肥胖症、龋齿、各种心血管疾病，及引发糖尿病人的胰岛素反应等症状。随着人们生活水平的提高，上述症状越来越凸显在现代人的生活中，人们对食品的要求也越来越高，找到一种蔗糖的替代品是甜味剂市场的迫切需要，因此从天然资源中寻找开发新型甜味剂自 20 世纪 70 年代以来一直受到人们的关注。而具有高甜度、低热量天然安全特点的甜味蛋白，作 为一种新型甜味剂逐渐吸引了人们的视线，在已发现的七种甜味蛋白中有几种已经被开发为商品，并在欧美，日本等发达国家市场作为食品添加剂销售。近年来，随着植物分子生物学技术的发展，农业科学家利用甜味蛋白高甜度的特点，将甜味蛋白基因转化到农作物中，来改良农作物的口感，随着研究的不断深入，甜味蛋白基因改良的作物将会为人们提供更多的可以放心食用的健康食品。 从六十年代以来已经发现了七种甜味蛋白，他们分别是（ 972） 972） 989） 989） （ 968） 味蛋白），（ 1983） ( 1994)七种甜味蛋白分为三类： 1)甜蛋白：其蛋白本身就具有甜味，包括 2)甜味诱发蛋白： 有味调节功能，又名奇果蛋白，口含微量 3 分钟后再喝 尔 /升柠檬酸即可产生甜味感觉 ,并且甜味可以持久达 2 个小时； 3)蛋白质本身具有甜味，而且具有味调节功能，兼具甜蛋白和甜味诱发蛋白的性质，且遇水时其可再次激发产生甜味。 目前研究的最多的甜味蛋白是 甜味蛋白的最大特点是他们大多甜度极高，大约是同浓度蔗糖的数百倍以上，并且这些甜味蛋白热值低，迎合了当前大众对低热量食品的消费需要，并且甜味蛋白不像某些氨基酸甜味剂那样会导致人体内氨基酸不平衡，是食品饮料工业理想的甜味剂。但大多数天然甜味蛋白的最大缺点是，在高温或 极端 件下会部分或全部丧失其甜味。表 1 是七种甜味蛋白的生物学特征，经比较不难发现甜味蛋白 这七种甜味蛋白中分子量最小的单链蛋白，并且甜度是同浓度蔗糖的 2000 倍。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 表 1 七种甜味蛋白的特征 of 白名称 甜蛋白 分子量 白肽链结构及长度 酸结构 相对甜度 来源 链 207 测 3000 T h a u m a t o c o c c u s 链 测 3000 链 114 测 550 链 测 500 链 测 100 链 191 测 遇酸变甜 链 54 测 2000 甜味蛋白 绍 甜味蛋白 稳定性与酸碱稳定性最好，最易溶于水的甜味蛋白，在威斯康馨大学由 (994)从一种西部非洲热带地区的攀缘灌木 通过灵长类动物传播种子，在原产地加蓬当地居民很早就用 1968）曾从 r. 一成果取得了 1994年的美国国家专利。 子量是 6473 道尔顿，等电点为 5，甜度为 2%蔗糖水溶液的 2000 倍， 子量是 12000 道尔顿，是蔗糖甜度的 500 倍， 没有测序，还不能确定 98 扩展 2 个小时后仍有甜味 (996)，产生的甜味可持续较长时间，比另一种甜味剂 甜味更接近于蔗糖。（ 996）对 多肽链序 列进行了研究，指出 三种氨基酸序列， I、 4 个氨基酸残基， ， 54 个氨基酸残基的 该蛋白的主要组成成分， 有53 个氨基酸残基，缺少一个氨基末端的 甜度是 54 个氨基酸 二倍。 别位于 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 间，这些二硫键决定了 白的稳定性，它的空间结构包括一个 a 螺旋和三个反向平行的 折叠片层， (998)报导 可溶性结构与已知的 构不具相似性。在 白多肽链内近七分之一的氨基酸为赖氨酸，所以 且可能是赖氨酸的 来源。 图 1 果实 白结构与甜味活性的关系 图 2 白骨架结构上决定甜味活性的关键氨基酸残基位点 , of of to be of 图注：标出了决定 味活性的关键的氨基酸残基的位置 突变会使甜度增加； 突变会降低甜度； 置的突变会极强的降低甜度， 会引起甜度变化。 构与甜味活性的关系，（高广华 1999）对 白分子中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、和精氨酸进行了化学修饰，修饰后的 度的降低或失去甜味，研究指出半胱氨酸对 白具有极为重要的结构意义，半胱氨酸的还原和烷基化会导致级结构的解体和三级结构的破坏，从而使 失甜味活性；除半胱氨酸外的其他氨基酸残基的化学修饰也显示具有决定 味活性的关键氨基酸位点，并推测 甜味活性中心：一个是以 a 螺旋和 折叠的 之中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 间的转角为中心，包括分子中唯一的组氨酸 及 一个是以 折叠的 和 之间的 转角为中心，包括 通过氨基酸突变研究 结构 ( 000)，当 29 位的 为 甜味，然而突变第 30 位的 突变第 33 位的 会导致 味消失；在 转角区域氨基酸的改变同样会导致 去甜味活性， 41 位的 为 产生了所有氨基酸突变体中最高的甜度；但同时改变两个氨基酸残基则会大大 的降低 度；并在 29 和 36 氨基酸位点检测主链和副链长度对甜度的影响，结果表明主链对诱导产生甜味起主要作用，而副链的长度起次要作用；还发现 N 和 C 末端对的生甜味也很重要。 通过改变 骨架结构 (000)，详细指出了在 骨架结构中特定位置的氨基酸的变化所引起的 度的变化。 序列与干扰昆虫消化的植物蛋白相似，他的折叠方式同蝎子毒液中的毒素相似。 1998 年组织了一个研究小组研究 白的结构， 研究中得到 15 个 似的蛋白质，每一个 似蛋白都是沿着 基酸序列有一个氨基酸突变的突变体，氨基酸的改变影响了蛋白质的构型，进而影响了蛋白质的甜度；核磁共振技术进行检验时每一蛋白都采用与 同的折叠方式，除一个蛋白突变体形成支架结构外，其他的蛋白突变体同状相同。 14 个 似蛋白和天然 白及蔗糖 的味觉对比显示， 14 个突变体中有 4 个突变体几乎没有甜味， 6 个突变体甜度显著降低， 2 个突变体同 样甜，并且是 合物甜度的两倍。尽管 14 个突变体的形状同 同，但是多肽链上氨基酸的改变造成的链之间的差异影响了甜度；并发现 子中有两个区域决定 甜味活性，这些区域内的氨基酸变化均会引起 甜度变化，并指出这些区域可能和受体的结合有关； 甜味受体结合引发灵长类动物的甜味感觉的机理还没有报道，并且甜味受体还没有分 离出来。 通过 变体研究 白的甜度与特定氢键完整性之间的关系（ 三个具有甜味表型的突变体具有相同的氢键，三个不甜的突变体在 在此打节，并缺少一个 间的氢键，蛋白质结构产生扭曲；另有两个不甜的突变体中缺少连接 N 和 C 末端的氢键，对 变体 的研究表明突变体的 N 末端和 C 末端较野生型的更为活跃。 外源生物中的表达研究进展 天然来源及其 在一定温度范围内和酸性条件下的稳定性使其成为低卡路里甜味剂的理想选择，在开发甜味蛋白的过程中，人工合成了 白，但人工合成的 L 型 D 型 有甜味。由于受成本的制约及 随着人们对甜味蛋白认识的加深， 自从上世纪 90 年代从 分离出 白，不断有报道揭示了利用微生物表达系统和植物表达系统大规模生产工业用 可能性。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 设计编码 基因（ 000），使用在大肠杆菌中表达的偏爱密码子，人工合成 因，并在大肠杆菌中表达出 组蛋白质，重组蛋白具有类似于天然甜味。 美国 司 1998 年宣布将利用转基因玉米生产食用 味剂，要在玉米中低成本中提取 定甜味蛋白是正在发展的低卡路里甜味剂市场的理想产品，并计划从 1 吨加工玉米中提取出 1 千克的 个量至少相当于 1000 千克的糖。一些公司也正在开发将 因用于改良 生产鲜产品的农作物中，但 司拥有对这种甜味剂提取的专利权。 2000）在商业计划书中表示由于商业竞争的需要要求 玉米中高效表达，并且每吨玉米中提取的 白必须相当于 500 千克糖。在已经进行的研究阶段 可行性，得到的 白占总的可溶性蛋白的 研究阶段 划使用不同的启动子和信号肽及基因修饰等方法来提高基因的表达水平；另外 将开发转基因玉米加工技术，从玉米中提取纯化 化的 进行味觉测试以确定适合商业生产的最适配方。 2