【毕业学位论文】（Word原稿）专一性脱硫菌LY822的分离筛选及脱硫基因工程菌的构建微生物学硕士论文

I 密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 硕士学位论文 专一性脱硫 菌 分离筛选及脱硫 基因工程菌的构建 I 要 专一性 微生物脱硫 技术 能选择 地 性脱除加氢脱硫技术难以脱除的 芳香族 含硫化合物，是实现石油及其产品深度脱硫有效的技术之一 。 分离筛选优良的菌株，构建高效的脱硫工程菌是提高微生物脱硫能力的重要途径 。本文 以此为研究目标，开展了专一性脱硫菌株的分离鉴定、脱硫基因克隆、启动子功能鉴定、表达载体和工程菌的构建以及脱硫活性评估等方面的 研究。 采用以二苯并噻吩（ 唯一硫源的培养基，经驯化培养，从我国山东胜利油田土样中分离到一株专一性脱硫菌株 该菌培养五天后的代谢产物高效液相色谱（ 析的结果表明 ， 的 全转化为 22证明该菌株是“ 4S 途径”的专一性脱硫菌。菌株形态特征及 16列分析表明，该菌属于红球菌属进化分枝，与红平红球菌 源性最高，达到 故将该菌初步鉴定 为 以 的质粒 模板， 应扩增了三个脱硫结构基因片段 小分别为 用表达质粒 别克隆了三个脱硫基因 ， 并在大肠杆菌 诱导表达，全细胞蛋白电泳分析发现有相应的清晰融合蛋白条带产生。 以带有报告基因 质粒 大肠杆菌 出发质粒，构建了三个带有不同启动子的表达质粒 击转化红平红球菌 光共聚焦显微镜检测结果表明，当 因受 硫链丝菌肽抗性基因 )启动子调控时， 因的表达 效率最高 ， 而且不再受硫酸盐的抑制。 以红平红球菌 质粒为模板，扩增了脱硫基因的全片段，连接于经 切的 得到带有脱硫基因的表达载体 分别电击转 化 和吖啶橙消除质粒的 ， 脱硫活性测定结果表明 ， 动子调控的工程菌株 脱硫能力提高最显著，即使在有硫酸盐存在的条件下，脱硫活性也不受抑制。这与用报告基因得到的研究结果一致。 在实际体系柴油（硫含量 497脱硫结果表明，带有 粒的重组菌 应 4小时的脱硫率达到 82%以上，高于原始菌株的 61%。 关键词 : 生物脱硫，二苯并噻吩，脱硫基因， is to it is be or DS of of is of is an to of as to by 6to NA as 1.0 .2 kb of is . be to of By FP in or FP in by of so of it by in by of in of 97 h, 2% of in 1% of in 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苯并噻吩 甲基亚砜 色荧光蛋白 链丝菌肽抗性基因 一性脱硫基因 类固醇基因 克隆位点 糖体结合位点 效液相色谱 百万分之一 录 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 油产品脱硫的意义 . 2 油燃料的脱硫方法 . 3 氢脱硫 . 3 氧化脱硫 . 3 吸咐脱硫 . 4 生物脱硫的研究进展 . 4 一性脱硫菌株的筛选 . 6 一性脱硫机理的研究 . 7 一性脱硫相关基因的研究 . 8 脱硫表达载体的构建 . 10 论文的研究目的及工作设想 . 10 V 第二章 专一性脱硫菌 分离和鉴定 . 12 料与方法 . 12 验材料 . 12 验方法和步骤 . 13 果与分析 . 18 硫菌的分离筛选 . 18 一性脱硫的检测 . 18 种的鉴定 . 18 硫基因的克隆和诱导表达 . 19 结 . 20 第三章 红球菌表达载体的构建 . 22 料与方法 . 22 株与质粒 . 22 培养基 . 23 试剂 . 23 抗生素 : . 24 仪器设备 . 24 实验方法和步骤 . 24 果与分析 . 32 达载体的构建 . 32 动子功能的检测和比较 . 38 小结 . 41 第四章 脱硫基因工程菌的构建及其脱硫性能检测 . 42 料与方法 . 42 验材料 . 42 研究方法 . 44 结果与分析 . 45 建质粒 . 45 建重组菌 脱硫活性比较 . 49 油脱硫实验 . 54 小结 . 54 第五章 结论与展望 . 55 考文献 . 56 致 谢 . 66 作者简历 . 67 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 言 环境污染越来越成为影响人类生存的重大问题。石油等化石燃料中含有无机硫和有机硫的化合物在燃烧后产生的二氧化硫，会造成严重环境污染 ， 排入大气会形成酸雨 ， 严重威胁环境与生态。为了保护环境 ， 很多国家对含 硫燃料的生产管理和含硫气体的排放制定了严格的法规。因此 ，对石油产品深度脱硫的研究已成为目前国内外的研究热点。 脱硫技术分为燃烧前脱硫 燃烧中脱硫和燃烧后脱硫三种。燃烧前脱硫是目前普遍采用的一种方法 ， 也 比较 适合我国国情的需要。燃烧前脱硫有物理法 化学法和生物法等 ， 物理法无法脱除有机硫 ， 而化学法脱除杂环分子中硫的效果较差 ， 切需要的反应条件苛刻 ， 耗能大。生物脱硫技术是采用微生物降解燃料中含有机硫和无机硫化合物的方法 ， 专一性比较强 ， 而且反应条件温和 ，成本低廉。 专一性脱硫是指能够选择性地攻击含硫化合物中的 CS 键而不攻击 CC 键的脱硫途径 ，其最大的优点是脱硫过程不降低化石燃料的燃烧值 ， 因此专一性脱硫也被称为非破坏性脱硫。以二苯并噻吩为模型化合物 ， 专一性脱硫可能有两种方式 ， 如图 是 的硫被连续地被还原生成 其余的 CC 结构不受破坏生成联苯。这一途径尽管能够专一性脱硫 ， 但这一过程是一个连续还原的过程 ， 这一类微生物大都是厌氧微生物 ， 脱硫速度慢 ， 脱硫产物是有害的体 ， 需要后处理过程 ， 工业应用前景不大。第二种方法是连续地氧化 的硫 ， 使其以亚硫酸盐的形式脱除 ， 而其余的结构不受破坏。这一途径 能最大限度的保持燃料的燃烧值 ， 脱硫过程无有毒物质产生 ， 易于产业化应用。 1989 年 二苯并噻吩为模型化合物分离得到了这样的专一性脱硫微生物，从而使这一设想成为现实。此后，专一性脱硫微生物被不断发现，脱硫酶与相关基因以及脱硫的机理也在不断的研究中，采用基因工程手段改良菌株以及在S H 32 - O O 一性脱硫可能的两种途径 wo 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 脱硫应用方面的研究也取得了快速的发展。 油产品脱硫的意义 化石燃料的大量应用带来了一系列的问题。燃烧后排放的氮氧化物和硫氧化物等气体不仅污染空气，影响居民的身体健康，还会形成酸雨 ， 都对环境产生严重的 危害。尤其是酸雨，到二十世纪的五十年代，酸雨就已是一个全球性的问题。石油中的主要元素组成是碳和氢 ， 而炼制和燃烧中产生污染的主要是硫 氮等。硫在石油中以无机硫和有机硫的形式存在。石油中的硫绝大部分是以有机硫化合物形式存在的，包括各种硫醇，硫醚，二硫化物和噻吩及其衍生物 (见图 一般来说 ， 有机含硫化合物中 ， 噻吩类化合物是最丰富的。噻吩类芳香含硫化合物是石油中的主要的一类含硫化合物 ， 其热稳定性高 ， 化学性质不活泼。二苯并噻吩 (取代二苯并噻吩是传统的石油加工中最难处理的一类有机含硫化合物 ， 在过去十几年 来一直被作为有机含硫化合物的模型化合物进行研究。许多沸点较低的小分子含硫有机物比较容易通过简单的化学方法除去。而在石油中含量较多的稠环噻吩类化合物却很难将其除去。除去二苯并噻吩 (一切脱硫技术的共同目标。 对于石油产品而言，燃料油中的硫化物损害汽车发动机，在燃烧时生成酸性的 染环境，同时还严重影响柴油机动车的氮氧化物 (气转化和颗粒物 (滤 系统的效率。因此 ， 降低车用燃料油中硫含量对于提高机动车尾气排放质量从而保护环境具有十分重要的意义。S S 油中的含硫化合物 1 in 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 日益严峻的环境形势对环保的要求变得越来越严格。因此 ， 对燃料燃烧前进行深度脱硫已迫在眉睫。 另外，石油中的硫还会腐蚀输送管线和贮存设备，使石油精炼的催化剂中毒，二硫化物稳定性差，加热易分解成 与水共存时呈酸性 ， 会严重腐蚀设备。如果油品中含有 会反应生成盐酸 ， 腐蚀更为严重。高温条件下，活泼的元素硫极易与普通钢材生成硫化亚铁，硫醇也能直接与铁作用生成硫醇铁而腐蚀设备 ， 因此石油中的硫化 物也是炼油工业的大敌 ，原油的脱硫也十分必要。 油燃料的脱硫方法 长期以来 ， 炼油工业采用碱洗的办法来脱除油品中的硫化物 ， 这一方法较为简单 ， 但存在诸多问题 ， 如环境污染严重和脱硫效率低等。原油通过碱洗可以除去油品中的绝大部分硫化物 ， 但却产生大量的含硫废水。如果不经过妥善处理 ， 对环境的危害会相当严重。因此开发新的脱硫的方法很重要 ， 除生物脱硫外 ， 脱硫方法还有加氢脱硫 氧化脱硫和吸咐脱硫。 氢脱硫 加氢脱硫是在氢气存在下使油品中的含硫 含氮化合物以及金属有机化合物发生氢解 ， 从而达到精制的目的。 该过程可以使后继工艺的催化剂免于中毒 ， 减少发动机燃料中含硫 含氮化合物分子燃烧时产生的 大气污染 ， 改善油品的使用性能。加氢脱硫 (在高温 (300 )高压 有氢存在和金属催化剂的条件下进行的脱硫反应。传统的加氢脱硫法只能脱除无机硫和简单的有机硫化合物 ， 而对于稠环噻吩类含硫化合物 ， 如二苯并噻吩(特别是烷基取代 生物，传统的 术更难以脱除。近几年来 术得到了很大的发展 ， 一方面通过改良催 化剂 (酸性催化 金属硫化物协同或碳化钼化 )，另一方面也研制了无催化剂加氢脱硫工艺 (过去不能处理的硫化物如 : 4， 6， 6在都能顺利地脱硫。在各种脱硫方法中 ， 加氢脱硫是相对成熟和完善的一种方法并已经在生产中投入使用 ， 而且加氢处理可以达到脱氮 脱氮 脱金属等的目的。但是 ， 加氢法反应条件苛刻 ， 温度在 300以上，压力在 装置投资大 ， 操作费用高 ， 导致油品成本大幅上升。正是由 于加氢脱硫成本过高 ， 导致 20世纪 80 年代以来柴油低硫化进展缓慢。柴油加氢脱硫存在经济上的问题 ， 另外脱硫副产物是对环境有害的 体 ， 面临一个二次污染和再处理的过程。因此 ， 加氢脱硫不是一个最理想的脱硫方式。 氧化脱硫 由于碳硫键近似无极性 ， 有机硫化合物与相应的有机碳氢化合物性质相似 ， 两者在水或极性溶剂中的溶解性几乎无差别。但是 ， 有机含氧化合物在水或极性溶剂中的溶解度要大于其相应的有机碳氢化合物。因此 ， 通过氧化将一个或两个氧原子连到噻吩类化合物的硫原子上 ， 就能增加其极性使其更容易溶于极性 溶剂 ， 从而达到与烃类分离的目的。从原子结构上来看 ， 硫原子比氧中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 原子多一层轨道 ， 这使得硫化合物容易接受氧原子被氧化 ， 如噻吩类化合物被氧化为砜或亚砜。这样就可以用一种选择性氧化剂将有机硫化合物氧化成砜类 ， 然后选择适宜的溶剂 (如二甲亚砜(N， N二甲基甲酰胺 (糠醛 乙腈 环丁砜 硝基甲烷 N甲基吡咯烷酮 (乙二胺等 )， 将砜类从柴油中萃取出来。根据氧化剂和反应类型的不同 ， 氧化脱硫法可分为 光化学氧化和催化氧化等方法。氧化脱硫法以其脱硫率高 (可降至 1反应条件温和 (多 为常温常压 )设备投资和操作费用低 (仅为同规模 0%以下 )工艺流程简单 (无须制氢装置和 产品质量高 安全环保 (低 等优点成为国内外研究的热点。许多氧化脱硫技术还具有同时对柴油脱酸的功能。但是硫氧化物的后处理和氧化剂的选择性等方面也还存在一系列的问题。关键在于寻找一种高效 廉价 选择性高的氧化剂体系 ， 并能寻求到氧化态硫化合物的出路。在高效催化剂作用下 ， 用空气作氧化剂 ， 对柴油中的有机硫化合物进行缓和的催化氧化，是一个很有前途的研究方向 。 吸咐脱硫 最早的 吸咐脱硫技术主要用于气体脱硫。后来的研究发现很多吸附剂也具有从汽油和柴油中脱除含硫 含氧和含氮等极性有机化合物的能力 ， 如分子筛 活性炭 氧化铝及一些复合氧化物等。由于芳烃和硫化物极性很相近 ， 因而使用一般的吸附剂在脱硫的同时也吸附了大量的芳烃。为此 ，用于汽油和柴油脱硫的吸附剂通常需要进行改性处理 ， 如用 换的 X 型沸石 用 换的石 经处理的红泥 用 理的白土 用 理的斜方冰积岩 丝光沸石等都对硫化物有较好的选择性。近期国外较有代表性的汽油与柴油吸附脱硫技术有三种 ， 具有各自的特 点。 工艺过程简单 易操作 投资及操作费用低 ， 但要求吸附剂具有较高的容硫量并且易再生 ， 以延长吸附 再生的操作周期。 术是流化床吸附脱硫技术 ， 工艺过程较复杂 ， 但脱硫率较高 ， 加工费用较低。而 S术是临氢状态下的流化床吸附脱硫技术，工艺过程比 术复杂，但脱硫率最高，原料适用范围广，从所使用的吸附剂及工艺条件来看， S程应具有一定的加氢反应。然而吸咐脱硫在吸咐的选择性和吸咐剂再处理方面还存在许多问题需要解决。目前 ， 汽 柴油吸附脱硫技术在国 内外刚刚起步 ， 随着新型吸附剂的研制及吸附剂再生技术的不断完善 ， 吸附脱硫技术将具有广阔的应用前景。 以上三种脱硫技术各有利弊 ， 但都不完善 ， 也不能满足环保对燃料油的要求。相比物理法和化学法，生物脱硫既能脱除无机硫也能脱除有机硫，尤其是具有“ 4S”途径的专一性脱硫微生物，选择性攻击杂环化合物上的 而不打断苯环上的 ，完好地保留了燃料的热值，反应条件温和，设备简单，耗能少，成本和操作费用低，为石油产品深度脱硫技术的广泛应用提供了广阔的前景。 生物脱硫的研究进展 早在 1935 年 ， 就有报道用某种硫 还原菌脱硫粗油中的硫。早期是把原油在通气条件下与水相中的细菌接触 ， 使油中有机硫化合物转化为水溶性无机硫化合物 ， 从而选择性地进行烃类的脱硫。但是 ， 细菌反应不易控制 ， 脱硫过程需消耗大量的油。后来的 30 年中由于相关技术的缺乏 ，研究内容被局限在筛选有效的脱硫微生物的工作上。 50 年代 布了第一份石油生物脱中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 硫的专利后 ， 陆续公布了许多专利 ， 使生物脱硫技术发展进入了第一次高潮 ， 涉及的微生物种类及其脱硫特性也不断扩展。 1968 年， 人在研究苯环化合物对农作物生长影响时发现假单胞菌属的以将 化成为几种不同的水溶性产物，他们通过进一步研究发现这样氧化的结果是 环中的 发生了断裂 ， 使其最后变成了水溶性较强的分子 ， 但硫并没有从分子中除去， 这就是所谓的 “径 ”(如图 示 )。 径是以 的碳代谢为目的活动 ， 通过这一途径 ， 硫并没有真正从杂环化合物中脱除 ， 只是因为产物具有水溶性 ， 从而可以使硫化物离开油相而进入水相。这一途径尽管可以脱硫 ， 但却使杂环化合物分子本身被破坏 ， 石油的燃烧值降低 ， 因而应用前景不大。 1974 年， 装有油的 4 升发酵罐中进行培养，五天内脱去原油中 55%的硫，但也损失了 30%的原油。随后 ， 司报道用假单胞菌将有机硫化合物降解为水溶性产物，并产生表面活性剂，有利于油水接触，但其脱硫效率较低，仅为传统 1/10。所以这些微生物不适合商业化应用 ， 因为它会破坏稠环芳香硫化物的碳骨架 ， 将其变成水溶性产物从燃料中脱除 ， 损失了燃料的燃烧值。 在 90 年代初，也发现了由 提供碳源又提供硫源的微 生物，它能将 次部分降解为 砜 ，最后生成苯甲酸酯和硫酸盐这样的微生物有 管有报道称该菌对添加 原油进行脱硫时并不攻击 管有报道称该菌对添加 原油进行脱硫时并不攻击烃类化合物 ， 但必竞降低了石油的燃烧值 ， 因此不是一种理想的脱硫途径。这样从二十世纪 70 年代起， 术的研究进入第二次高潮 ， 研究者从单纯的菌种筛选中摆脱出来 ， 开始研究各个菌种脱硫的代谢机理 ， 这些机理的阐明不仅解 释了这些菌种不能应用于工业化生产的原因 ， 也为专一性脱硫思想提供了重要的依据。实际上从上世纪 70 年代开始的 “径 ”研究直至现在也没有停止 ， 因为尽管它不适合于石油脱硫 ， 却可以用于石油污染的生物治理。 们分离的假单胞菌 专一性地切断 2基联苯 。反应中没有 非常遗憾的是该菌性能不稳定 ， 甚至于后来这一活性丧失 ， 不能再次重复以前 的性状 ， 也不可能投入应用。 1989年 , 美国 的研究 人员 展开了深入的研究，提出了生物降解 称 “4S”途径， 实现了生物催化脱硫的重大突破。 在美国该菌种已被 被休斯顿的能源生物公司 (断。 专门从事 1995年 3月投产了 试装置， 1997年在得克萨斯州建成气升式反应器 。 1999年 1月， 001年第三季度投产。除加工该炼油厂的 795m3/装置将可生产约 kt/到目前为止 ， 生物脱硫工业化生产尚处于起步阶段。以下从专一性脱硫菌种筛选 脱硫机理研究 脱硫基因研究和应用研究几方面来综述专一性脱硫技术的研究现状。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 一性脱硫菌株的筛选 脱硫微生物的菌种分离是生物脱硫的基础。自发现硫菌属氧化铁杆菌 够氧化黄铁矿以来，研究人员一直在寻找其他一些用于脱硫的微生物。 1974 年 据 18守序列设计引物，运用 技术研究了被含有 石油污染的土壤的真菌变化情况，结果表明 土壤中的真菌是有持续的选择性作用的。在专一性脱 硫菌 脱硫基因被克隆与测序之后，用 研究石油污染土壤中有三个优势菌群 ， 分别是放线菌 土壤细菌和未能鉴别的菌群。在生物脱硫研究中，常把二苯并噻吩 (为杂环有机硫化物的模型化合物，但用苯并噻吩也筛选到了类似的专一性脱硫菌。高效的筛选技术 ， 为获得所期望的专一性脱硫菌奠定了基础。已报道了几十株的脱硫菌 ， 这些微生物有细菌类 ， 也有真菌类 ， 多数是革兰氏阳性菌 ， 只有少数是革兰氏阴性 O O O O O i b e n z o t h i o p h e n e c i s - - 1 , 2 - d i h y d r o x y d i b e n z o t h i o p h e n ec i s - 4 - 2 - ( 3 - h y d r o x y ) t h i o n a p h t h e ny l 2 - o x o - 3 - b u t e n o i c a c i h y d r o x y - 2 - f o r m y l b e n z o t h i o p h e n et r a n s - 4 - 2 - ( 3 - h y d r o x y ) t h i o n a p h t h e n y l 2 - o x o - 3 - b u t e n o i c a c i 硫代谢的“ 径” “国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 菌。为数最多的还是诺卡氏菌属的 红球菌。由于菌种及相关工艺的专利保护 ， 各国研究机构最初都致力于分离得到有自主知识产权的合适菌种。继 后，到目前为止，已经有几十株具有特异性脱硫途径的细菌报道，其中多属红平红球菌，如 1。与红球菌分类位置较近的一些菌，如 213E(0816)，有一些分类位置较远的菌如 。以上这些菌种均是革兰氏阳性菌 ， 能专一性脱硫的革兰氏阴性菌是 内近年来也分离到一些脱硫微生物，如中国科学院过程工程研究所分离的 本实验室分离的 。这些菌大都是室 温菌 ， 适宜的生长温度在 2830。近年来人们认识到嗜热菌将给工业应用带来方便。由于温度升高 ， 酶促反应的速度也相应地得到提高 ， 杂菌污