【毕业学位论文】（Word原稿）miR-551参与胃癌发生发展的作用及机制研究

兰州大学博士学位论文 - 1 - 前 言 胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一， 2008 年全球新发胃癌患者 989,600 例，占所有新发癌症病例的 8%，死亡 738,000，占所有死亡病例的 10%1。据 2010 年中国卫生统计年鉴报告，我国胃癌年死亡率为 0 万，是世界平均水平的 2倍多 2。胃癌已成为严重威胁人 民群众身体健康、阻碍社会经济发展的重大疾病。 目前胃癌的治疗主要是手术切除，早期胃癌患者术后 5 年生存率可达 90 以上，但绝大多数胃癌在确诊时属进展期，已失去手术根治机会， 5 年生存率仅为 11 因此，提高胃癌早期诊断率、寻找新的分子靶向治疗药物及转移、复发预警指标等已成为当今科学研究中亟待解决的重要问题。而解决这些问题的归结就是加强胃癌发病机制的研究，寻找胃癌特异性分子靶标。 一类普遍存在于动植物体内的长约 1925 编码单链小分子 过与靶 完全结合，抑制靶基因的转录或翻译发挥其生物学功能 3图 1）。自 2000 年人们真正开始认识 来， 其研究一直倍受全世界的广泛关注，迄今人类已发现和鉴定的 有两千余种6。研究显示 够调控约 2/3 人类蛋白的表达，几乎参与细胞生命 活动的每个环节，包括调控个体发育、细胞凋亡、细胞增殖和分化等生命活动 7 肿瘤的发生、转移、耐药等病理进程密切相关。已证实大约 50%得到注解的 基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（ 癌基因或抑癌基因的断裂位区（ 12误 !未指定书签。 。这说明肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些 起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。研究还表明 物种进化中相当保守，具有严格的组织特异性和时序性。 等 15检测了来自不同肿瘤组织的 400 份石蜡标本和 22 份新鲜冷冻标本中 表达，发现 表达具有明显的组织特异性，经筛查检测 48 个 定肿瘤的组织来源准确率达 90%。X 等 16在对乳腺癌的研究中发现 癌旁组织、临床病例分型不同的癌组织中表达具有显著的差异，表明 有肿瘤发生的阶段特异性，同一种肿瘤在发生发展不同分期阶段具有不同的 达谱。 有一个特性，就是在多数肿瘤组织中异常表达的 样能够在外周血中检测到，而且血清 够耐受反复冻融、酸碱、以及 的处理，对于兰州大学博士学位论文 - 2 - 处理也较 图 1. 工过程及作用机制（ 2004） 加稳定 17以上特点表明 作为理想的肿瘤生物学靶标，应用于肿瘤的诊断、预后评估及治疗等。 泛参与了胃癌的发生发展进程。 幽门螺旋杆菌（ 是 I 类致胃 癌因子 ， 研究发现 性的胃癌标本中 达显著增加 ，达水平显著下降 ， 表明 染可能通过改变相应 促进胃癌形成 21,22；近年 病毒 感染与肿瘤的关系逐渐得到人们的重视，研究表明全世界大约 6胃癌与 毒 感染有关，但病因尚不清楚，近期一项研究发现 毒感染的胃癌细胞 ( 中表达下降 ，其可 通过上调锌指转录蛋白 调表达 ， 进而 参与胃癌的浸润转移过程 23； 24研究发现 州大学博士学位论文 - 3 - 在 92% ( 34/37) 的胃癌样本中存在过表达，其平均值是正常组织的 ，表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、脉管侵犯、临床预后密切相关； 25的研究 表明 达与 相关， 因（与胃癌转移相关基因）的受体之一， 成负反馈环，达下调可激活 路并触发肿瘤转移。体内外实验进一步证实 表达可抑制肿瘤细胞侵袭 。 虽然近年来，国内外学者相继筛选鉴定出一批与胃癌密切相关6并对其功能进行了深入系统研究。但是，仍有相当一大部分胃癌发生发展进程中的作用及其分子机制未知，亟待进一步深入研究。 据此，本研究拟通过基因芯片技术筛选更多胃癌相关 通过与胃癌临床病理特征的分析，初步阐明其与胃癌发生发展的作用关系，为我们下一步的深入研究奠定坚实基础。 通过我们的研究，相信将有助于揭示 胃癌发生发展中的作用及机制，为胃癌发病机制的研究以 及未来的靶向治疗提供新的思路和理论基础，同时研究发现的 望作为 新一代胃癌特异性 分子靶标 ，为胃癌诊断、预后判效 等 提供新的参考依据。 兰州大学博士学位论文 - 4 - 正 文 第一部分 胃癌差异表达 筛选 引言 人体的一种内源性基因表达调控因子，它通过负性调控靶基因的表达， 对基因活动（生长、分化、凋亡及应激反应等）的各个层面进行调节 30近年研究发现 肿瘤的发生发展进程中伴有重要的角色，已证实多种能直接参与人类肿瘤（如胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌及淋巴瘤等）的形成 19,33 肿瘤发病机制 中所扮演的角色是非常复杂的，它通过调控癌基因或抑癌基因而发挥促癌或抑癌作用，而且在不同条件下它既可作为癌基因又可作为抑癌基因，参与多种肿瘤的形成。在同类型的细胞中，任何一个 一个靶基因能与多个 基因相互作用，从而组成了 综复杂的调控网络，参与肿瘤的发生发展 40,41。 近年来研究人员在 肿瘤关系的研究领域取得了较大进展，先 后在包括胃癌在内的多种肿瘤中筛选鉴定出大量的功能 子，为肿瘤发生发展机制研究、早期诊断及治疗等方面提供了潜在的新靶点 42尽管 仍有相当一大部分肿瘤相关被发现，并且众多 肿瘤的关系及其参与肿瘤 癌变的机理尚不清楚。本部分实验的主要目的就 是通过 因芯片筛选和鉴定胃癌异常表达的 进一步研究 胃癌的关系奠定基础。 1 材料 组织样本 收集 2009 年 10 月 2010 年 4 月甘肃省武威肿瘤医院接受手术治疗的 56 例胃癌患者作为研究对象。取胃癌及其周围癌组织（距离癌灶 5上，且经 行实验研究，其中癌组织 56 例，癌旁组织 56 例，术中取材，立即放入液氮中保存后转入 长期保存。 期以 - 5 - 病理分期第六版为标准。以上患者均保存有完整的临床资料，包括姓名、性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、浸润深度、 期及 淋巴结转移 等 。56 例患者中，男性 32 例，女性 24 例，男女比例为 ，年龄在 35 76 岁之间，中位年龄为 56 岁。所有患者术前均未接受过放、化疗。一般临床资料 （ 见表 1） 。 表 1. 胃癌组织标本临床资料 病例 例数 百分比（ %） 总数 56 性别 男 32 57 女 24 43 年龄 50 岁 18 32 50 岁 38 68 肿瘤直径 51 55 55 45 分化程度 高 /中分化 17 30 低分化 39 70 期 I 9 16 8 32 5 45 7 淋巴结转移 无 6 11 有 50 89 兰州大学博士学位论文 - 6 - 主 要试剂 司 8*60K) 片： 司 司 司 司 x ： 司 司 司 主要仪器 司 动杂交炉（ 司 净工作台：苏州净化 心机：上海医疗器械七厂 00 型酶联免疫分析仪：美国 温高速离心机：德国 子天平： S 400S 纯水设备： 微量分光光度计： GE 司 时定量 (80)：美国罗氏诊断产品有限公司 (美国 2 数字可调微量移液器：日本立洋 2 方法 提取 取试剂： 广谱型 取试剂，可以从组织、培养细胞等中直接提取 20 200 包括 5S 品在 能够被充分裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层）， - 7 - 分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到 验准备 防 染 解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手 套以口罩；使用 作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止汗液、唾液中的 解酶的污染。 品准备 所有需要使用到的玻璃器皿物品均使用含 1 去离子水 37C 浸泡超过 8 小时，包括研钵、移液器枪头、离心管等，然后在 120C 下高压灭菌 30分钟以除去残留的 体步骤 验样品的研磨和匀浆 癌细胞及正常胃黏膜细胞匀浆 （第三部分实验） 取处于对数生成期、贴壁良好的细胞，倒出培养液，用 11 次。 每 10 养细胞中加入 1 平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，用细胞刮勺剥离细胞，然后使用移液枪吹打细胞使残留细胞脱落。 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置 5 分钟。 癌及癌旁组织的研磨 将超低温冻结的胃癌或癌旁组织称量 50 速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。 向研钵中加入 1研磨成粉末状 的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 将匀浆液转移至离心管中，室温静置 5分钟。 12,000 g 4C 离心 5分钟。 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 兰州大学博士学位论文 - 8 - 提取 向上述步骤的匀浆裂解液中加入氯仿（ ），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡 15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置 5分钟。 12,000 g 4C 离心 15分钟。 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 15 30C 下静置 10分钟。 12,000 g 4C 离心 10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75的乙醇 1 勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁， 12,000 g 4C 离心 5分钟后小心弃去 乙醇（为了更好地控制 尽量除净乙醇）。 室温干燥沉淀 2 5分钟（不可以离心或加热干燥，否则 加入 1020l 的 溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待淀完全溶解后于 保存。 度和纯度的检测 用超微量分光光度计进行 量检测，首先用 2 1 离子水进行空白读数，再测样品。 读取 值并记录， 读数应该在 间，并且同时读取度，不符合实验要求者均重新提取。提取 56 例癌及癌旁组织、胃癌细胞及正常胃黏膜细胞的 值均在 间，符合实验要求。 芯片实验 备标记反应体系 磷酸化 用 1 将 品稀释至 50 L。 兰州大学博士学位论文 - 9 - 吸取上述稀释后的样品 2 .5 心管中，放置冰上备用。 按下表所示的顺序配制去磷酸化混合液： L) L) 0 取上述的混合液 2 体积为 4 L，枪头抽吸混匀。 将上述 4 7C 金属浴中或 温 30分钟。 品变性 在每管样品中添加 L 100% 将上述反应混合液置于 100C 金属浴中加热 5 10分钟。注意严格控制时间在上述范围内。 上述反应结束后，将样品管迅速转入冰水浴中冷却，并立即进行下面的步骤。 3 连接 将 10于 37C 温育并间隔涡旋，直至沉淀全部溶解，然后将其冷却至室温备用。 按下表配制连接反应混合液： L) L) 0 4 意：上述反应混合液应在使用前配制，配好后放在冰上，在 15 分钟内使用。 取 体积为 L，枪头抽吸混匀，稍离心。 置于 16C 温育 2 小时。反应结束后，将样品置于真空浓缩仪中完全抽干备兰州大学博士学位论文 - 10 - 用。注意：样品一定要完全抽干以去除 将真空浓缩仪的温度设定在 45C 55C 以加快抽干时间。 备 10 在冻干的 10X25L 微涡旋，以使其完全溶解，必要时可将其置于 37C 温育 4 5 分钟。 稍离心，放置备用。配制好的 10X放置在 保存 2个月，每次融化使用时，注意涡旋混匀并离心。 备杂交样品 准备 100C 的金属浴备用。 将抽干的样品重新溶解在 18L 中。 在每管中加入 0 在每管中加入 微涡旋混匀。 将上述反应混合液放置在 100C 金属浴中加热 5 分钟。 反应结束后，迅速将其转至冰水浴中冷却 5 分钟。注意：冷却的时间不应超过 15 分钟。 离心收集反应液并立即进行下面的步骤。 备杂交混合液 将合适的盖片正确放置在 座上。 用移液器缓慢地将约 45L 反应液吸至盖片上。注意：吸取反应液时，不要吸到沉淀，并尽量避免引入气泡。同时要避免枪头碰触盖片密封圈，以免破裂漏液。 将芯片点样面（带有 “样面）朝下缓慢放置在盖片上。 组装 拧紧。 稍微晃动组装好的 使里面所有的气泡可以自由移动。 将 衡放置在杂交炉的架子上，温度设定在 55C ，转速为20 杂交 20 小时。注意：在同一次实验中，要保持杂交时间一致。 片洗涤的操作流程 加入 从纸盒中取出试剂瓶，打开内外层的盖子。 兰州大学博士学位论文 - 11 - 用移液器加入 2 0%的 盖上盖子，上下颠倒混匀 5 6 次。 装上龙头，并在瓶壁上标明 “已经加入 注意： 和 在使用前均应按照上述步骤加入 热 在无菌的试剂瓶中倒入 1L 的 。 将试剂瓶放入 37C 水浴中过夜。 将 3 置于装水的碟子中，放置在 37C 水浴中过夜。 备设备 将实验中所有需要用到的碟子、架子和磁力棒，用 彻底清洗数次；尽量在每步的洗涤过程中使用同一个洗涤碟等器材。 涤芯片 具体的洗涤时间和温度如下表所示： E 1 st 2 1 nd 2 37C 5 在 1 中注满 ，于室温备用。 将 置在 2 中，注入 以漫过 入一个磁力棒，然后将 置在磁力搅拌器上。 将 37C 过夜预热的 3 放置在磁力搅拌器上，注入过夜预热的 ，打开加热装置，使温度控制在 37C 。 从杂交炉中取出 心取下芯片 /盖片，左手轻置，芯片面朝上，浸入 中，右手用扁头镊子从贴有标签的一头取下盖片，使其掉入碟子中，而后迅速将芯片放入放置在2 中的 。重复 上述步骤，直到其他的芯片放置妥当。开启磁力搅拌器，中速搅拌 5 分钟。注意：磁力搅拌器的转速不应过快，以防磁力棒跳起损坏芯片。 兰州大学博士学位论文 - 12 - 时间结束后，取出放有芯片的 水纸上轻轻控去上面沾染的液体，而后放入 3 中。开启磁力搅拌器，中速搅拌 5 分钟，注意控制温度在 37C 。 时间结束后，取出 水纸上轻轻控去上面沾染的液体，立即进行下面的步骤。 片扫描 芯片结果 采用 行扫描，用 取数据，软件设置 m, 00%， 5% 最后采用 行归一化处理，所用的算法为 验 剂盒原理 该制品使用改良后的 x 过检测反应液中 的荧光强度，达到 监控 聚合酶链式反应 (简称 一种体外用于放大特定 段的核酸扩增系统。 本原理类似于 天然复制过程，是在模板 种脱氧核苷酸和引物等存在的情况下， 合酶依赖的酶促合成反应，特异性依赖于引物与模板 特异结合。整个扩增过程分三步：第一步：变性，加热使模板 链解离，使之成为单链；第二步：退火，突然降温后主要发生为引物与模板 链的互补序列配对结合；第三步：延伸 ，在 合酶、镁离子等作用下，按碱基互补配对与半保留复制原理，形成与模板链互补的新 。重复上述循环，经过 2 3 小时后， 扩增上百万倍。实时定量逆转录 又称之为定量 为 成与 时定量 逆转录 结合，一条 被逆转录成为互补 以此为模板通过 行 增。可以 采用微量 对基因表达信息进行灵敏检测或定量分析。 该试剂盒中的 合酶由于使用了x 而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高 增灵敏度。 合荧光检测法 兰州大学博士学位论文 - 13 - 与双链 以可以通过检测反应体系中的 荧光强度，达到检测 体原理见下图。通过 与双链 过检测 以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的 、 嵌合荧光法原理图 合成 转录试剂盒制品内容 试剂盒组成内容如下表（ 20L 反应 20 次 ）： 该试剂盒中含有合成 A）多聚尾和合成 需要的全部试剂，可以将样品中的 过一次反应合成为 1 注： 200 L T 0 L 40 L 10M） 200 L 1 1 州大学博士学位论文 - 14 - 当同时需要进行多个反转录反应时，应先配制各种试剂的混合液（ 中包括 等），然后再分装到每个反应管中。以减少实验操作或实验样品之间的误差。 T 酶的混合制剂，使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保护液中含有 50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。 反转录试剂盒使用前于 C 保存，融解后的于冰上放置，使用后立即保存于 C 。 反应液的配制、分装使用新的（无污染的）无 的枪头、 ，尽量避免污染。 A）加尾反应和反转录反应 按下列组份配制反应液（反应液配制在冰上进行） 反转录反应条件 向所得到的反应液中添加 足至 100 L。取 2L 稀释液加入到下一步的 应体系中，进行定量检测。 物合成 31 对 物均购自 司 ，以人 U6 内参 。 应 试剂 剂量 2 10 L 2 L T 2 L 10l1g/l） 1 L up 0 L 37C 60 )加尾和反转录反应 85C 5 酶的失活反应 兰州大学博士学位论文 - 15 - 剂盒制品内容 试剂盒组成内容如下表 （ 50 L 反应 200 次） 注： 使用时请上下颠倒 轻轻均匀混合，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应不足。 配制反应液时，试剂于冰上放置。 制品中含有荧光染料 ，配制 反应液的配制、分装使用新的无 污染的）枪头、 量避免污染。 应液的配制 （反应液配制在冰上进行） 件 ：预变性 95C 10 1 ： 应 95C 50 0C 20： 95C 15s， 60C 30s， 95C 15s x I（ 2 1.0 5 支 50 200 L 1 支 I（ 50 200 L 1 支 试剂 使用量 终浓度 x I（ 2） L 1 L L 菌蒸馏水） L 5 L 兰州大学博士学位论文 - 16 - 验结果分析 应结束后分析熔解曲线，从而判定扩增产物是否有非特异性扩增。 根据 目的基因经一定次数的扩增循环而出现指数级增长时，其激发的荧光信号即达到一定的设定阈值强度而被 荧光探头 捕获，仪器即给出此时的扩增循环的次数，即扩增的目的基因出现指数增长的最低循环数。最低循环数以 Ct(表示，与反应体系中原先目的基因 实际拷贝数呈反比。以 来反映目的基因 始含量， 越低，目的基因 始含量越高。通过各样本的复孔取平均值，即得到样本中目的基因扩增的 作为目的基因定量判定。根据每孔的 ，以 U6 作为内参，使用实时荧光定量 对定量 法，用 t（ 表示 组织中的相对表达量 。第三部分细胞实验中， 用 N=2- 表示 达在胃癌细胞中相对正常细胞的倍数，此时 瘤 -（ 常。 计学处理 应用 计软件包处理数据，结果以均数 标准误 （ E）表示，采用 P 为差异具有统计学意义。 3 结果 芯片样品的质检 本研究选取两例胃癌患者组织标本进行芯片实 验，癌组织（ 癌旁组织（ 两例， 采用 100 泳来评估 验样本是否降解。 6， 且 28S/18S 示组织 本质量较好 （表 2，图 2）。 表 2. 品质控信息 样本编号 浓度(g/L) 体积 (L) 总量(g) 100 果 8S/18S 1 100 格 2 100 格 3 100 格 4 100 格 兰州大学博士学位论文 - 17 - 图 2. 电泳 图（ 100 5S 12018S 186928S 3500 胃癌相关 筛选 釆用上海伯豪生物有限技 术公司的 8*60K) 因芯片，此基因芯片包含 1907 个人类 因。 胃癌组织标本与癌旁组织标本相比，我们设定在两对样本中同时上调或下调2 倍以上，且 4 个数值中至少有 2 个信号值高于 6 为筛选标准，结果发现 14 个达在胃癌组织中呈显著上调和 16 个 达在胃癌组织中呈显著下调（表 3）。对初筛的 30 种胃癌差异表达 行聚类分析（图 3）。 兰州大学博士学位论文 - 18 - 表 3. 初筛 胃癌 组织 中 差异表达的 o. in 1 p p p p p p p p p 0 p 1 p 2 p 3 p 4 p 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 州大学博士学位论文 - 19 - 癌相关 胃癌组织中表达的验证 我们采用 法对芯片筛选出的 30 个 一在 56 对胃癌组织及癌旁组织中的表达进行了检测，结果显示 22 个 胃癌组织中存在差异表达，其中 10 个 胃癌组织中高表达， 12 个 胃癌组织中低表达。另有 8 个 表达与胃癌无明显相关性（表 4）。 图 3. 基因芯片聚类分析图 兰州大学博士学位论文 - 20 - 表 4. 筛选 胃癌组织中的表达 of in E) of in E) 2 3 4 7 8 9 0 11 12 13 14 5 16 7 18 9 0 1 22 23 24 25 26 27 28 29 30 注： t（ 表示 组织中的相对表达量 ， 达越低 ，当 胃癌组织中小于 癌旁组织 时，说明此胃癌组织中高表达，反之亦然。 兰州大学博士学位论文 - 21 - 验 说明 （以 例） 增曲线 实验中 每个样本重复 3 次，从扩增曲线可见各样品的重复性比较好，各样品的扩增效率比较一致（图 4）。 图 4. 胃癌组织中 增曲线 解曲线 通过 相应熔解曲线分析，确认 物的特异性，熔解曲线为单峰，无明显杂峰，表明无引物二聚体扩增和非特异扩增（图 5）。 图 5. 胃癌组织中 解曲线 兰州大学博士学位论文 - 22 - 4 讨论 一类普遍存在于动植物体内的长约 1925 编码单链小分子广泛存在于线虫、果蝇、哺乳动物、植物等真核生物，在进化上具有保守性 45它可参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢，甚至可通过 径调节干细胞的分化11,48 近年研究人员发现 肿瘤基因组异常密切相关，并在多种肿瘤组织中表达失衡，目前认为引起 肿瘤中表达水平发生