【毕业学位论文】（Word原稿）股癣患者临床标本研究探讨股癣的传播途径，复发机制的阐明、分子流行病学调查和有效防治

1 第一章 前 言 股癣 (一种由皮肤癣菌侵犯腹股沟及其周围皮肤并伴随显著瘙痒的传染性疾病，是体癣在阴股部的特殊类型，有反复发作倾向。近年来国内外的报道表明股癣在皮肤浅部真菌病（ 占有较高的比率，尤其是在发展中国家，国内高达 1 ，国外占 2 ，严重影响患者的生活质量。西方一些国家将其划分为性传播疾病范畴，更加重患者的抑郁、恐慌及愧疚情绪，危害患者身心健康，甚至影响到患者的性生活等 3,4 。目前， 股癣的传染源和传染途径尚未完全知晓，故加强股癣的传播途径研究具有十分重要的意义。 股癣的致病菌主要包括红色毛癣菌（ T. 须癣毛癣菌 ( T. 和絮状表皮癣菌（ E. 。国内外大部分地区股癣的致病菌均以红色毛癣菌为主，如美国、墨西哥、巴西、芬兰、英国、西班牙、土耳其及日本等 5，其检出率可高达 由于真菌生长受地域环境、季节、气候、温度、湿度及人口流动等多种因素的影响，不同地域股癣的发病率及致病菌谱可有所不同。如伊朗的德黑兰及其西南部均以絮状表皮癣菌感染为主 16,17 ；在沙特阿拉伯的达曼城市亦以絮状表皮癣菌为主 2 ，但 利雅得 却以须癣毛癣菌为主 18 。我国地域宽广，有关股癣的报道各地不一，但总体以红色毛癣菌为主 1,19。 股癣的传播途径主要包括自身传播和外源传播 14 。自身传播是指手足癣、甲真菌病及体癣等浅部真菌病脱落的鳞屑中可携带有致病菌并长期存活，通过某种 方式粘附在腹股沟等部位，引起自体感染。外源传播主要是指直接或间接接触外源性的真菌而引起发病，包括寄居在体表、空气或土壤中的致病性真菌，周围浅部真菌病的患者或患畜等 15 。 股癣的易感因素包括遗传、性别、年龄、职业、营养状况、季节气候、基础疾病、家族史、外伤、多汗、生活习惯 、接触猫狗等动物及合并其它浅部真菌病等 26。据报道， 股癣患者中有 并其它浅部真菌病（尤其是手足和甲真菌病）发生，且股癣发病往往晚于其它浅部真菌病，多考虑其它浅部真菌病通过内源传播途径引起股癣 33 。 股癣 发病的易感因素众多，很多影响因素是实际存在却难以用有效的指标来衡量，近年来众多学者聚焦在股癣与其它浅部真菌病的关系。 2000年 股癣患处和足部两部位分离的致病菌菌种不同，前者主要为絮状表皮癣菌，后者主要 2 是须癣毛癣菌，但该结论仅依靠观察菌落在沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上的大体形态而得出 16 。 2005年蒋霞等研究发现股癣合并足癣者比例高达 并提出足癣可能是股癣的一个重要传染源，但仅依靠菌落特征、镜下孢子和菌丝的形态以及生化实验进行 菌种鉴定 1 。 2009年王洁等在对兰州地区 1560例股癣患者进行流行病学分析时提出股癣发病率的高低与体癣、手足癣有密切关系，该研究标本量大，但仅分离培养了股癣患处致病菌，未进行生化鉴定，未进一步分析其它部位致病菌种，亦无股癣合并其它部位浅部真菌病的有效数据 25 。 2007年杨宝甲在对怀柔地区体股癣患者流行病学分析及就诊前用药调查时发现体股癣患者合并手足癣等浅部真菌病者占 较 2001年的 明显上升，但此实验仅把真菌镜检阳性者列入调查对象，未对致病菌种进行培养及鉴定 34 。上述众多研 究，大体是依靠培养的菌落特征、镜下孢子和菌丝的形态以及生化实验等传统方法进行菌种型别鉴定，未从分子生物学水平去探究，无法准确反映遗传本质，亦无法明确致病菌的传播路径和特点。 2005年陈辉等采集 26例股癣患者股癣患处和趾间鳞屑，经培养均阳性者共 15例，率先采用巢式 因型相同者为 但本实验仅采集足趾间的标本，未关注其它部位浅部真菌病，虽在分子生物学水平进行研究，但未分析目的基因的单核苷酸多态性（ 点及基因突变位点 35 。故在单核苷酸水平进一步分析同一患者股癣致病菌与其它浅部真菌病基因的同源性，更益于分析股癣传染源和传播途径。 蒋霞等对兰州地区 2004年间 136例股癣患者临床标本进行研究，共分离致病菌 125株，计 3个菌种：红色毛癣菌 112株（ ，念珠菌 9株（ ，须癣毛癣菌 4株（ 1 。王洁等于 2000年 1月 2007年 12月对兰州地区 1560例股癣患者进行研究，发现红色毛癣菌 1221例（ ，白念珠菌 116例（ , 絮状表皮癣 菌 96例（ ，须癣毛癣菌 5例（ 等 25 。两者研究结果提示兰州地区股癣的致病菌以红色毛癣菌为主。 过扩增靶细胞基因组 析其多态性，便能比较不同个体基因组 行基因定位，作出 不仅能反映生物个体之间的遗传相关性，还能同时清晰、敏感的反映出遗传差异 40 。该法可以在未知靶 别适用于分子生物学特征不明确或不了解基因组 此被广泛用于丝状真菌的菌种鉴定 40 。 高分辨率熔解曲线分析技术是 2002年美国 技术是在聚合酶链反应（ 程中，根据碱基序列构成不同导致相对应的熔解温度不同这一 3 物理性质，直接对产物进行高分辨率熔解，利用饱和染料监控核苷酸的熔解过程，进而得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断单个核苷酸性质的差异 36,37 。此技术具有极高的敏感性，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作 ，在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型及序列匹配等方面都发挥着重要作用，受到各领域专家的青睐 38,39 。 普通 作复杂，且研究所获得的电泳图谱中相同位置的 夸大目的序列的相似性。而 果甚至可精确至单个核苷酸的差异，与普通 确、有效的展示目的序列的差异。 国内外研究显示，红色毛癣菌核糖体非转录间隔区有两个串联重复亚单元 ：串联重复序列是指 1 200个碱基左右的核心重复单位，以头尾相串联的方式重复多次所组成的重复序列。它广泛存在于真核生物和一些原核生物的基因组中，并表现出种属、碱基组成等的特异性。在基因组整体水平上，各种优势的重复序列类型不同。即使在同一重复序列类型内部，不同重复拷贝类别在同一物种的不同染色体间，以及基因的编码区和非编码区间也表现种属和碱基组成差异。 7个碱基（ 重复单位组成的，依据同一核糖体不同非转录间隔串联重复亚单元重复次数不同，扩增出大小不等、数目 不同的目的序列的原理，可将红色毛癣菌分为多个基因型，故分析同一患者股癣与其它浅部真菌病患处分离的红色毛癣菌 因型是否相同，可帮助分析股癣合并其它浅部真菌病者其股癣致病菌的来源和传播途径。 因此，本研究旨在通过 收集 2012 年 1 月 2012 年 12 月间就诊于兰州大学第二医院皮肤科门诊临床拟诊为股癣的患者，经初步鉴定同一患者 股癣 患处 与其它部位分离菌种相同者，用 术从分子水平鉴定其菌种是否相同。如经 术鉴定均为红色毛癣菌者，进一步 用 术 分析其 股癣 患处 与其它部位分离红色毛癣菌 基因型是否 相同 ，进而探讨股癣的传播途径，为其复发机制的阐明、分子流行病学调查和有效防治提供理论依据。 4 第二章 股癣病因学研究及表型鉴定 第一节 材料与方法 一、仪器与试剂 （一） 主要实验 仪器与耗材 1. 分析天平： 7海国营长江仪器厂 2. 玻璃试管：上海工业玻璃四厂 3. 海跃进医疗器械厂 4. 普通冰箱：青岛海尔股份有限公司 5. 奥林帕斯双目显微镜：日本 6. 电子天平： 特勒 海）有限公司 7. 手提式高压蒸汽灭菌锅： 甘肃省医疗器械厂 8. 超净工作台：上海跃进医疗器械厂 9. 铜圈：外径 2径 约 面有一直径约 10. 精密 江市化剂厂 11. 照相机：尼康 2. 电磁炉： 阳公司 13. 一次性培养皿（直径 7接种针、接种环、酒精灯、打火机、一次性无菌针管（ 10白色蜡块、载玻片、盖玻片、玻璃 滴管、圆形烧瓶、量筒、锥形瓶、一次性塑料手套等 （二）重要试剂及来源 1. 葡萄糖粉：北京化学试剂二厂 2. 营养琼脂粉： 郑州富泰化工公司 3. 蛋白胨粉： 湖北省医药公司 4. 氯霉素：上海 生物工程公司 5. 氢氧化钾：北京化工厂 6. 蒸馏水：兰大二院普制室 7. 石炭酸：上海生工公司 5 8. 乳酸：北京化工厂 9. 棉兰： 上海标本模型厂 10. 甘油：北京化工厂 11. 磷酸二氢钾：天津科茂化学试剂有限公司 12. 尿素：北京化工厂 13. 氯化钠：北京化工厂 14. 苯酚红：上海试剂四厂 15. 透明指甲油、马铃薯 （三）主要试剂的制备 1. 10氢氧化钾（ 液 用分析天平称取 10至 100 2. 沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂（ 养基 成分包括葡萄糖 脂 白胨 馏水 1000霉素 备方法：用分析天平分别按比例称取适量的葡萄糖、蛋白胨和琼脂，用电子天平称取足量氯霉素。将此四种原料与适量蒸馏水混匀，加热同时用玻璃棒不停搅拌使其充分溶解并混匀，补足水量，调节 管培养基：分装于试管，置高压蒸汽灭菌锅中 121 灭菌 15置斜面；平皿培养基：装至锥形瓶，置高压蒸汽灭菌锅中 121 灭菌 15超净工作台上无菌倾倒平皿。待培养基冷却凝固 后置 37 恒温箱中温育 24h，检测无菌生长后置 4 冰箱保存备用。 3. 马铃薯葡萄糖琼脂（ 养基 成分包括马铃薯块 200g 300g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 馏水 1000备方法：马铃薯洗净去皮，切成小块。按配方将马铃薯放入水中，煮 30纱布过滤，榨出所有液体，补足 1000入葡糖糖及琼脂，加热溶化，调 装于试管，置高压蒸汽灭菌锅中 121 灭菌 20置斜面。待培养基冷却凝固后置 37 恒温箱 中温育 24h，检测无菌生长后置 4 冰箱保存备用。 4. 尿素琼脂培养基（ 成分包括蛋白胨 萄糖 脂 酸二氢钾 素 6 氯化钠 红 馏水 1000备方法：用分析天平分别按比例称取适量的蛋白胨、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、尿素及氯化钠，用电子天平称取足量酚红。除尿素及酚红外，其它成分相加并混匀，加热溶解，调 入酚红混匀后装入三角烧瓶， 116 高压蒸汽灭菌 30却至 45 50 ，无菌加入尿素、摇匀、分装于试管，放置斜面。待培养基冷却凝固后置 37 恒温箱中温育 24h，检测无菌生长后置 4 冰箱保存备用。 5. 乳酸酚棉兰（ 载液 成分包括石炭酸 兰染料 酸 20油 40馏水 20备方法：将除棉兰染料外成分混合，边隔水加热边充分搅拌直至完全溶解，然后加入棉兰染料 合均匀，过滤，瓶装备用。 二、临床致病菌株分离及鉴别 （一）临床标本的来源 1. 病例选 择 2012 年 1 月 2012 年 12 月就诊于兰州大学第二医院皮肤科门诊临床拟诊为股癣的患者，采用问卷调查的方法详细记录患者一般情况、卫生条件、运动情况、初发 /复发、患病时间、可疑传播途径、是否合并其它浅部真菌病、股癣与其它浅部真菌病患病先后顺序、发病后用药情况、近期是否治疗及既往病史等。 2. 标本取材 临床拟诊为股癣的患者，分别于其可疑股癣患处和其它可疑浅部真菌病患处活动边缘（无可疑皮损者于 4、 5趾间取材）用 75%的酒精消毒，以钝手术刀刮取表皮鳞屑，取水疱标本则取疱壁组织，脓疱则取脓液，病甲则以钝手术刀刮除 表层后采集病甲边缘下较深层（贴近甲床）的甲屑，滴加 10%进行沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基培养。（股癣、股癣合并足癣、股癣合并甲癣的临床照片见附图 22 （二）分离鉴定 1. 10 接镜检 将上述采集的标本置无菌载玻片上，滴加 10%滴，加盖玻片，火焰 7 外焰微微加热，勿使沸腾，然后轻压盖玻片驱除气泡，用滤纸吸除盖玻片周围的溢液，用奥林帕斯双目显微镜在低倍镜和（或）高倍镜暗视野下查见菌丝或孢子即为阳性（见附图 2阴性结果需连查两次才能确定 。 2. 养 将镜 检阳性的标本无菌接种于 体培养基上， 25 27 恒温培养箱内培养，分别于第 7d、 14d、 21d 和 28d 观察菌落生长情况，第 4w 末未见生长者视为阴性。通过观察菌落的形态、大小、生长速度、色素及镜下结构（大小分生孢子、菌丝形态）等进行菌种鉴定。所有阳性菌落都转种三次进行分离纯化，纯化方法为点植法（见附图 2 2 3. 养 此为分离与鉴定真菌的基础培养基。皮肤癣菌可在此培养基上产不同色素，如红色毛癣菌产红色，犬小孢子菌产黄色，奥杜盎小孢子菌产褐色，须癣毛癣菌不产色素。（见附图 2 4. 尿素琼脂培养基 形态学鉴定为红色毛癣菌或须癣毛癣菌的菌株均接种于此培养基，同时接种一管须癣毛癣菌标准株作为阳性对照置 25 培养， 4培养基由黄色变为红色即为阳性反应。须癣毛癣菌为阳性反应，红色毛癣菌为阴性反应。（见附图 2 5. 小培养（铜圈法） （ 1）准备工作：载玻片、盖玻片、铜圈、一次性无菌针管（ 10接种钩等。 （ 2）将载玻片、盖玻片及铜圈等消毒。 （ 3）用镊子将铜圈在火焰上加热后双面均放在蜡块上浸蜡少许后立即将其放在载玻片上，小孔侧要位于玻片的窄侧边，将盖片轻轻加热后置于 铜圈上，由此形成一个除小孔外几乎密闭的小室。 （ 4）待冷却后用注射器将融化的培养基从侧孔中注入，量约为铜圈小室的 1/2，沿载玻片横向放置并稍倾斜至冷却凝固。 （ 5）接种时通过小孔分别在靠近载玻片和盖玻片两侧的培养基上，左右适当错开以便观察。 （ 6）编号。 （ 7）放置湿盒内 25 恒温培养 3d 5d。（见附图 2 6. 制片 8 （ 1）待小培养培养成熟后取下盖玻片并迅速通过火焰固定，并使粘附有真菌菌落的一面朝下缓慢平放在滴有乳酸酚棉兰染液的载玻片上。 （ 2）用镊子夹持原来的载玻片并在火焰外焰稍加热，取下铜圈和培 养基，刮除载玻片上残留的蜡块。 （ 3）在载玻片粘附有真菌菌落处滴加一滴乳酸酚棉兰染液，盖上盖玻片。 （ 4）待乳酸酚棉兰固定好片子后用透明指甲油封存。 （ 5）贴标签编号。 （ 6）镜下观察并拍照。 第二节 结 果 1. 初步鉴定结果 检及培养 临床拟诊为股癣的患者共 86 例，镜检和培养阳性者各 39 例，分离培养出的 39 株致病菌包括红色毛癣菌 36 株，占 36/39） ；须癣毛 癣菌 3 株，占 3/39） 。 并其它浅部真菌病 同一患者股癣患处与其它部位均培养阳性者共 30 例，占股癣患者的 30/39） 。经初步表型鉴定股癣患处与其它部位分离菌种均为红色毛癣菌者共 26例，其中 1 例分别分离自股癣患处、足部及趾甲， 1 例分别分离自股癣患处与趾甲，余 24 例分别分离自股癣患处及足部；股癣患处与其它部位分离菌种不同者4 例，其中 3 例股癣致病菌为须癣毛癣菌、足癣致病菌为红色毛癣菌， 1 例股癣致病菌为红色毛癣菌、足癣致病菌为须癣毛癣菌。（菌株资料如表 2示） 2. 股癣患者一般资料 别及年龄 男性 36 例，占 女性 3 例，占 男女之比为 12： 1。患者年龄在 16 80 岁之间，平均 ，以 16 30 岁为优势，共 26 例，占 业 学生最多，共 20 例，占 其次是职员 10 例，占 工人和自由职业各 3 例，分别占 司机和军人各 2 例，分别占 商人和退休各 1例，各占 9 MI(kg/围是 均 常范围 13 例，占 ；大于 24 12 例，占 大于 28 者 14 例，占 动多汗 31 例诉平日久坐少动，占 37 例诉平日多汗，占 疑传播途径 16 例诉搔抓患足后搔抓其它部位，占 8 例诉用同一浴巾擦洗患足与其它部位， 7 例诉经常在同一盆里或同时用洗衣机清洗内裤和袜子， 6 例诉很少对洗衣机内部以及浴缸进行消毒处理，占 6 例诉曾到公共游泳池和浴池洗浴，占 4 例诉共用鞋袜和生活用品等，占 4例诉发病前曾有动物接触史，占 4 例诉家庭其它成员患有足癣，占 一患者股癣与 其它浅部真菌病患病时间先后 股癣合并其它浅部真菌病的 30 例患者的股癣患病时间均晚于其它浅部真菌病。 表 2实验菌株资料 of 株编号 实验编号 采集时间 采集 部位 色素 尿素酶 试验 菌种鉴定 1 1a 2012 酒红色 阴性 T. 1b 2012 酒红色 阴性 T. 2a 2012 酒红色 阴性 T. 2b 2012 酒红色 阴性 T. 3a 2012 酒红色 阴性 T. 3b 2012 酒红色 阴性 T. 4a 2012 酒红色 阴性 T. 0 4b 2012 酒红色 阴性 T. 1 4c 2012 酒红色 阴性 T. 2 5a 2012 酒红色 阴性 T. 3 5b 2012 酒红色 阴性 T. 4 6a 2012 酒红色 阴性 T. 5 6b 2012 酒红色 阴性 T. 6 7a 2012 酒红色 阴性 T. 7 7b 2012 酒红色 阴性 T. 8 8a 2012 酒红色 阴性 T. 9 8c 2012 酒红色 阴性 T. 0 9a 2012 酒红色 阴性 T. 10 续表 (2菌株编号 实验编号 采集时间 采集 部位 色素 尿素酶 试验 菌种鉴定 21 9b 2012 酒红色 阴性 T. 2 10a 2012 酒红色 阴性 T. 3 10b 2012 酒红色 阴性 T. 4 11a 2012 酒红色 阴性 T. 5 11b 2012 酒红色 阴性 T. 6 12a 2012 酒红色 阴性 T. 7 12b 2012 酒红色 阴性 T. 8 13a 2012 酒红色 阴性 T. 9 13b 2012 酒红色 阴性 T. 0 14a 2012 酒红色 阴性 T. 1 14b 2012 酒红色 阴性 T. 2 15a 2012 酒红色 阴性 T. 3 15b 2012 酒红色 阴性 T. 4 16a 2012 酒红色 阴性 T. 5 16b 2012 酒红色 阴性 T. 6 17a 2012 酒红 色 阴性 T. 7 17b 2012 酒红色 阴性 T. 8 18a 2012 酒红色 阴性 T. 9 18b 2012 酒红色 阴性 T. 0 19a 2012 酒红色 阴性 T. 1 19b 2012 酒红色 阴性 T. 2 20a 2012 酒红色 阴性 T. 3 20b 2012 酒红色 阴性 T. 4 21a 2012 酒红色 阴性 T. 5 21b 2012 酒红色 阴性 T. 6 22a 2012 酒红色 阴性 T. 7 22b 2012 酒红色 阴性 T. 8 23a 2012 酒红色 阴性 T. 9 23b 2012 酒红色 阴性 T. 0 24a 2012阴 酒红色 阴性 T. 1 24b 2012 酒红色 阴性 T. 2 25a 2012 酒红色 阴性 T. 3 25b 2012 酒红色 阴性 T. 4 26a 2012 酒红色 阴性 T. 5 26b 2012 酒红色 阴性 T. 6 27a 2012 无 阳性 T. 7 27b 2012 酒红色 阳性 T. 8 28a 2012 无 阳性 T. 9 28b 2012 酒红色 阴性 T. 0 29a 2012 酒红色 阴性 T. 1 29b 2012 无 阳性 T. 2 30a 2012 无 阳性 T. 63 30b 2012 酒红色 阴性 T. ： 数字为患者代码，数字后字母代表不同的部位（ a 代表股癣患病部位， b 代表足部， c 代表趾甲） 11 第三章 股癣传播途径的分子生物学研究 第一节 材料及方法 一、仪器与试剂 （一）主要实验仪器及耗材 1. 电子天平： 特勒 海）有限公司 2. 高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司 3. 超净工作台：上海跃进医疗器械厂 4. 普通冰箱： 16T 岛海尔股份有限公司 5. 超低温冰箱 ：青岛海尔股份有限公司 6. 电热恒温水浴箱： 海一恒科学仪器有限公司 7. 恒温金属浴： 海兰豹实验仪器有限公司 8. 旋涡混合器： 门市麒麟医用仪器厂 9. 台式高速离心机： 国 10. 台式低温高速离心机： 国 11. 微型低速离心机： 沙湘仪离心机仪器有限公司 12. 微量核酸蛋白测定仪 ： 北京中西远大科技有限公司 13. 000型 大利亚 14. 恒温摇床：太仓豪诚实验仪器制造有限公司 15. 全自动凝胶成像分析系统： 海嘉鹏科技有限公司 16. 单道移液器： 21020100国 17. 微波炉： 的公司 18. 电泳仪： 京六一仪器厂 19. 离心管、薄壁 次性塑料手套、一次性滴管、圆形烧瓶、量筒、接种针、酒精灯、打火机等 （二）重要试剂及来源 1. 真菌基因组 生工生物工程（上海）股份有限公司 2. 00 生物工程（大连）有限公司合成。由 ,000 12 3,000 2,000 1,500 1,000 750 500 250 100 9条带，其中 1,000 3. 引物：宝生物工程（大连）有限公司合成 4. 生物工程（大连）有限公司合成 5. 2根 生化科技（北京）有限公司 6. 75%的乙醇：天津富宇精细化工有限公司 7. 异丙醇：北化精细化学品有限责任公司 8. 京中生瑞泰科技有限公司 9. 花青素核酸染料：上海生物工程公司 10. 西班牙 海川翔生物科技有限公司 11. 50海生物工程公司 12. 工生物工程（上海）股份有限公司 13. 蒸馏水：兰大二院普制室 （三）试剂制备 1. 随机引物稀释 将引物冻干粉管低速离心后，加入 220l 分振荡 5分钟后，混匀离心，配制成 100用前再稀释 5倍，配制成终浓度为 20 2. 上游引物稀释 将引物冻干粉管低速离心后，加入 100l 分振 5匀离心，配制成 100用前再稀释 5倍，配制成终浓度为 20 3. 下游引物稀释 将引物冻干粉管低速离心后，加入 106l 分振荡 5匀离心，配制成 100用前再稀释 5倍，配制成终浓度为 20 4. 冲液 50的 00倍后制成 分颠倒混匀，室温保存。 5. 2%琼脂糖凝 胶 13 用电子天平称取琼脂糖 与 00热煮沸 ， 融化 至透明状态后 摇匀 ，如此反复 3次后，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却， 即 制备 成 脂糖凝胶 。 6. 沙氏液基（ 成分包括葡萄糖 白胨 馏水 1000霉素 200备方法：用分析天平分别按比例称取适量的葡萄糖和蛋白胨，用电子天平称取足量氯霉素。将此三种原料与适量蒸馏水混匀，加热同时用玻璃棒不停搅拌使其充分溶解并混 匀，补足水量，分装于试管，置高压蒸汽灭菌锅中 121 灭菌 1537 恒温箱中温育 24h，检测无菌生长后置 4 冰箱保存备用。 二、实验方法 （一）标本来源 经上述表型 鉴定 同一患者 股癣患处与其它部位分离菌种均为红色毛癣菌的26例患者的 53株菌株 及红色毛癣菌标准株 1株（由北大医院皮肤性病科惠赠，编号为 （二）菌株基因组 取 1. 收集菌丝 将上述菌株接种于 8 培养 2种至 10 30 恒温摇床 160次 /分震荡培养，约 3d 5丰富的菌丝球，用双层无菌纱布过滤收集菌丝体，无菌水洗涤 3次，滤纸挤压干水分。 2. 按试剂盒方法提取 1）电子天平称取 20液氮研磨成粉末，加入到 入400l l 荡混匀。 65 水浴 1 （ 2）加入 200l F，充分颠倒混匀， 冰箱放置 5 （ 3）室温 10,000上清液（ 500l 550l）转移到新的 （ 4）加入等体积的异 丙醇，颠倒 5 8次使之充分混匀，室温放置 23温 10,000上清。 （ 5）加入 1醇，颠倒漂洗 1310,000上清。 14 （ 6）重复步骤 5一次。 （ 7）开盖室温倒置 510 （ 8）得到的 0l 100l 3. 测 度 用 微量核酸蛋白测定仪 测定提取的 整 0l40l， 冰箱 保存。 （三）随机扩增多态性 析（ of 1. 增反应体系 以上述提取的 5 为引物进行随机扩增多态性 25 2002物（ 20M） 板 1l和 1l。 2. 增反应条件 94 预变性 330个循环： 94 变性 30s， 36 退 30s， 72 延伸 2后 72 总延伸 5 3 物电泳 扩增反应结束后以 00 取 脂糖凝胶，以 800胶置凝胶成像仪中观察结果并摄像。通过比较实验菌株与红色毛癣菌标准菌株产生的 析是否为红色毛癣菌。 （四）高分辨率熔解曲线技术（ 1 增反应体系 以上述提取的 5和 5 为引物扩增 25在 200 2x 物 （ 20M） 各 板 1l和 15 2. 增反应条件 95 预变性 30s 后，进行 30 个循环，包括： 98 变性 10s， 57 退 30s， 72延伸 1后 72 总延伸 2 3. 析 增产物在 000 中继续进行熔解曲线分析。 升温到 95 ，获得样品的熔解曲线。根据同一患者不同部位分离实验菌株产生的熔解曲线 的曲度、曲峰及数目 是否相同进行种内基因分型。 4. 物电泳 以 00 标准，取 4l 上述扩增产物点样于 脂糖凝胶，以 80V 电压下进行电泳 20 ，凝胶置凝胶成像仪中观察结果并摄像。根据同一患者不同部位分离实验菌株产生的 纹图是否相 同进行种内基因分型。 第二节 结 果 1 物电泳结果 26例患者的 53株实验菌株及红色毛癣菌标准株的基因组 显示株间差异性。 （如图 2 M S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 5000 3000 2000 1500 1000 750 500 250 100 16 M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 M 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 5000 3000 2000 1500 1000 750 500 250 100 5000 3000 2000 1500 1000 750 500 250 100 5000 3000 2000 1500 1000 750 500 250 100 17 M 46 47 48 49 50 51 52 53 字 1 图 2以 . CR . 型结果 用 术 以 引物 扩增 26 例患者的 53 株红色毛癣菌 的 ， 每个标本对应一条熔解曲线，通过观察其熔解曲线 的曲度、曲峰及数目 是否相同进行种内基因分型，共分为 3 型（ 如图 2 2示）。23 例患者多部位菌株曲线型别相同： 18 例两部位或两部位以上菌株均为 1 型曲线，占 3 例均为 2 型曲线，占 2 例均为 3 型曲线，占 有 3 例患者两部位菌株 曲线为 不同型别，两部位曲线型别分别为 1 型和 2 型、 2型和 1 型、 3 型和 1 型。此外，经 析未见 基因突变位点。 图 2红色毛癣菌 3种基因型的 of . 000 3000 2000 1500 1000 750 500 250 100 18 5000 3000 2000 1500 1000 750 500 250 100 M 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b M 为 子量标准，数字 1别代表不同患者，字母 a 代表股癣患处、 b 代表其它部位 图 2多部位分离红色毛癣菌 a b CR . of 2红色毛癣菌 3种基因型的 RM of . . 物电泳结果 将 物直接电泳 ，通过分析其 纹图 (如下图 2示 )可 分为3 型，分别如 1a（ 750、 2a（ 1000 750和 3a（ 175015001250000 750泳道所示。 23 例患者多部位菌株基因 型相同： 18 例两部位或两部位以上菌株与 1 号患者电泳结果相同，占 3 例与 2 号患者电泳结果相同，占 2 例与 3 号患者电泳结果相同，占 有 3 例患者两部位 19 菌株 增显示为不同基因型，分别如 4、 5 和 6 号患者电泳结果所示。将电泳结果与 型结果进行比对分析，两者结果一一对应， 即 析产生的 1、 2 和 3 型曲线分别对应于电泳 1a、 2a 和 3a 泳道的 纹图，最终两者分型结果完全一致。 20 第三节 讨 论 1. 足癣和甲真菌病 与股癣的关系 股癣、足癣和甲真菌病均为皮肤科的常见病及多发病，足癣及甲真菌病等浅部真菌病脱落的鳞屑可携带有致病菌并长期存活，进而作为一个潜在的传染源引起股癣。故分析同一患者股癣患处与其它部位分离的菌种是否相同，可作为判断股癣致病菌来源的一个依据。在我国股癣及其它浅部真菌病的致病菌均以红色毛癣菌最为常见，但此菌种存在多种不同的基因型，故股癣与其它浅部真菌病致病菌均为此菌种时，需进一步鉴定其基因型是否相同。 过扩增靶细胞基因组 析其多态性，便能比较不同个 体基因组 行基因定位，作出 不仅能反映生物个体之间的遗传相关性，还能同时清晰、敏感的反映出遗传差异 40 。该法可以在未知靶 别适用于分子生物学特征不明确或不了解基因组 此被广泛用于丝状真菌的菌种鉴定 40 。本实验经传统的 表型鉴定方法分析出 46例股癣患者中有 26例患者股癣患处与其它部位分离菌株均为红色毛癣菌，以 6例患者的 53株实验菌株及红色毛癣菌标准株 ，此 53株实验菌株 扩增后的产物片段长度多态性 完全一致，且 与红色毛癣菌标准株亦完全一致，即此 53株菌株经 高分辨率熔解曲线分析技术是 2002年美国 技术是在 据碱基序列构成不同导致相对应的熔解温度不同这一物理性质，直接对产物进行高分辨率熔解，利用饱和染料监控核苷酸的熔解过程，进而得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断单个核苷酸性质的差异 37。 以上述 26例患者的 53株红色毛癣菌为模板，对其可变区 析， 每一个样本对应一根分析曲线，不同基因型得到的目的片段大小、数目及碱基序列不同，其扩增曲线曲度、曲峰及数目不同，可直接读出样本的基因型。经 53株标本共分为 3个基因型。其中