【毕业学位论文】（Word原稿）混合阳离子交联剂甲基丙烯酸海藻酸盐微球的构建及其性能研究

兰州大学硕士研究生学位论文 I 兰州大学硕士研究生学位论文 1 前 言 软骨在全身骨骼的功能活动和生长发育中起着重要的作用，承担机械负荷后不容易发生永久变形 1。然而关节软骨损伤也是临床上常见的问题，并且一旦损伤，自我修复能力较差 2。患者常会出现关节反复疼痛、活动受限等，严重影响人们的生活。口腔颌面部常见的颞下颌关节紊乱病（ 展到后期，出现关节器质性破坏，关节软骨表面粗糙，关节盘穿孔、破裂等严重影响下颌的运动，对患者的心理，生理都造成巨大的影响 3。当前，治疗软骨损伤的主要方法有：刺激 关节自身修复和再生；软骨、骨膜和软骨细胞的移植；组织工程修复关节软骨损伤 4等。 然而无论是软骨细胞移植还是组织工程修复关节软骨损伤，都需要大量的软骨细胞。自体软骨细胞是最为理想的种子细胞，但自体软骨取材受限制，增殖能力差，体外培养易去分化、失去原有的表型 5。怎样才能使软骨细胞在体外大量增殖且能够保持原有的表型，是一个需要解决的问题。 随着生物学的发展，设计和发展模拟天然细胞外基质的物理、化学结构的三维（ 3D）细胞培养逐渐被人们认识 6，海藻酸盐水凝胶由于其良好的生物相容性 ,长期以来都被当做三维（ D）细胞培养的良好支架材料。 等首次利用海藻酸盐凝胶小球作为支架培养软骨细胞，发现软骨细胞在小球中能够维持球形形态。后续又有大量学者对软骨细胞在海藻酸盐凝胶小球中的三维（ 3D）培养进行了研究，发现软骨细胞能维持细胞的表型，分泌功能性细胞外基质，但是存在的问题是，细胞在藻酸盐凝胶小球中生长，虽然能够维持良好的表型，但是细胞的增殖不好，连续四周培养，仅有少量增殖 8。 目前， 为 使 海藻酸盐水凝胶 能更好的应用于组织工程支架材料 领域 ,对 它的 改性 研究 主要集中在 ： 强度和渗透性两个 方面。细胞能够感应细胞外基底的强度 9，基底强度能够影响细胞的表型和增殖 10对于细胞的三维（ 3D）培养，营养物质的供应是一个关键因素，材料对于营养物质的渗透性，直接关系到材料中细胞的增殖和生存 14目前提高强度的方法基本都是增加水凝胶的交联密度，这样在提高强度的同时带来了凝胶渗透性的下降。 5等将甲基丙烯酸引入藻酸盐长链，利用甲基丙烯酸中双键聚合的反应，在不增加交联密度的情况下增加海藻酸盐的强度，最后结果显示，材料强度增加，渗透性下降约 10%。 6等 研究不同阳 离子对于海藻酸盐水凝胶的影响，兰州大学硕士研究生学位论文 2 发现高 片段的藻酸盐，对于不同的阳离子 成的凝胶的强度还有渗透性不一样 . 童粤生 17等研究了混合 种离子作为阳离子交联剂，形成的藻酸盐水凝胶的性能，发现渗透性较好，能够使营养物质自由通透，但是对于凝胶的强度并没有进行直接的数据测量，通过 48振荡破损率来大体反应其强度，结果显示强度 增 高并不明显，低于 10%。所以本实验中我们假设把 合作为阳离子交联剂，与经过甲基丙烯酸改性的海藻酸盐反应，生成的水凝胶，既 具有高的强度同时又能维持其渗透性不下降，并将改进后的海藻酸盐水凝胶用于培养软骨细胞，使软骨细胞能够在体外获得 更 好的生存条件。 兰州大学硕士研究生学位论文 3 文献回顾 一，海藻酸盐的理化特性 海藻酸盐是一种从海带、马尾藻、巨藻等褐藻中提取的天然多糖高分子化合物，是由一 与 依靠 1,4一糖苷键连接，并由不同 中 单元在 18如（图 1）。 19， 水溶液中海藻酸盐的弹性按照 20。 于某一海藻酸盐，分子结构中的 的比例以及它们的排列顺序会决定该盐的性质。海藻酸盐的分子量变化范围较大在50间。海藻酸盐水溶液为较粘稠的溶液，其粘滞性与分子量相关。海藻酸钠水溶液很容易和 某些二价阳离子以离子交联的方式形成水凝胶。在海藻酸钠水溶液中加入 、 二价阳离子后， a+会与二价阳离子发生交换反应，形成交联网络结构。研究表明 16 海藻酸钠的作用力比 ， 能够与海藻酸钠的 外海藻酸钠还可以和己二酸二酰肼、赖氨酸、聚乙二醇 成稳定的共价交联水凝胶。在实际应用中较少使用共价交联来形成海藻酸钠水凝胶，因为共价交联剂通常具有一定的毒性。 图 1 海藻酸盐的基本结构 单元 海藻酸钠与二价阳离子（如 交联的原理，海藻酸钠与 成海藻酸钙水凝胶，电子显微镜观察为三维网状结构，被称为“蛋格”样结构21机理如下： 1个 与海藻酸钠分子链中的两个 过 4个配位键形成“蛋格”结构， 其中 2）。 兰州大学硕士研究生学位论文 4 图 2 海藻酸钠凝胶的“蛋格”结构 二，海藻酸盐水凝胶在软骨组织工程中的应用 目前，软骨组织工程的研究内容主要集中在以下三个方面即种子细胞、支架材料和细胞体外培养的环境和条件。其中支架材料的研究一直都是软骨组织工程的研究热点。支架就是 3织细胞都存在于一定的 3 因此，在软骨组织工程中，构建一种适合细胞生长的支架材料成为组织工程的研究 热点。 在组织工程领域，现有的支架材料分为四类：金属、陶瓷、聚合物和复合材料 23。其中聚合物由于高度的可塑性而被广泛的关注。聚合物材料又分为天然和合成两种。主要包括：聚乙烯醇 、 多肽 、 氧化乙烯等合成材料以及海藻酸盐 、 壳聚糖 、 胶原 、 明胶 、 透明质酸等天然材料 24。合成材料能成规模生产，容易调控所制备水凝胶的微结构、降解速率 、 力学性能等，但最大的不足之处就是缺乏细胞识别信号。天然材料具有特异的细胞识别位点，但通常来源不足且性能存在差异。 在天然材料中，海藻酸盐价格低廉 、 来源丰富。 海藻酸盐的亲水性及带负电荷能 很好的模拟软骨细胞外基质 25。藻酸钙凝胶小球 的 表面以及内部孔隙，可以让细胞进行营养交换。在藻酸钙凝胶小球中培养软骨 细胞 ，能够保持细胞的球形形态，这对软骨细胞的表型维持非常重要 26。 其次，海藻酸盐良好的生物相容性，水溶液可以和二价阳离子作用形成凝胶小球 ， 在凝胶小球中的软骨细胞可以通过 合剂从小球中释放出来 27等特性，都 使其具备了细胞 3酸钙在 1989年首先被 等应用于组织工程研究，随后 8等将海藻酸钙复合上软骨细胞并在裸鼠皮下成功构建出了透兰州大学硕士研究生学位论文 5 明软骨组织， 杨伟东 29等将藻酸钙与骨髓基质 干 细胞复合用注射方式已在裸鼠皮下成功构建出组织工程骨，在无免疫动物体内证实海藻酸钙是一种良好的支架材料。 藻酸钙虽然有很多优点，但也存在组成成份不稳定 ,体内难以降解，体内吸收差 ,机械强度低等 30缺点。 长期增殖发展。 1等利用海藻酸钙复合软骨细胞，修复兔关节软骨缺损时，发现大约 20%的植入体被纤维组织所取代，认为藻酸钙作为细胞外支架材料其机械强度有待提高。任利玲 8等在藻酸钙凝胶小球中培养软骨细胞 ，发现在海藻酸盐凝胶小球中培养软骨细胞能维持其表型，软骨细胞能不断分泌功能性细胞外基质，再次证实以海藻酸盐水凝胶作为软骨细胞的三维培养基质是可行的，但是连续 4周培养，细胞仅有少量增殖。怎样才能克服以上的缺点，让海藻酸盐这种拥有诸多优点的组织工程支架材料，在组织工程支架材料领域发挥更大的作用，是学者们一直研究的重点。 三，海藻酸盐水凝胶的改性研究 针对海藻酸盐水凝胶的 机械 强度不足，学者们做了大量的改性研究。通过增加聚合物溶液的浓度或者增加阳离子交联剂如 浓度来增加凝胶的刚度是以前研究较多的。但是研究发 现随着聚合物溶液的浓度增加，必然会引起交联密度的上升，凝胶表面孔隙率和孔径的下降，这样即使强度提高了，对于细胞的生存却不理想 32。因为海藻酸盐微球包埋细胞作为细胞生长的支架材料，细胞生长所需的营养物质需从周围培养基中获得，藻酸盐凝胶的多孔结构，其表面有很多孔隙，这是交联形成的特有的网格状结构，也是营养物质和细胞代谢废物进出的通道。所以一旦孔隙率减 小 ，孔径减小，那么营养物质进入小球的通道便受阻，同时细胞的代谢产物也不能 很好 排出，这样细胞的生长状态和活性便会受到影响。所以理想的支架材料应该是既具有较高的机械 强度， 又 具有良好的渗透性。如何对海藻酸盐进行改性，使 得在刚度提高的同时能控制其渗透 性 的降低，是长期以来研究的难点。 目前，海藻酸盐水凝胶作为组织工程中培养细胞的支架材料的改性研究有 ： 王华明，曹 阳 33等将海藻酸钠溶液滴入壳聚糖和氯化钙的混合溶液反应合成海藻酸钙壳聚糖 (合水凝胶材料 。 S34等用海藻酸盐和壳聚糖形成交联的网状结构来培养软骨细胞。以上两个研究发现用壳聚糖对藻酸盐水凝胶进行改性后，形成的 面形成更多网格，内部呈多孔结构，孔隙间贯通性高，材料 的可塑性增加，含水率增加，结构稳定，但是凝胶的强度降低 。 童粤生 17等以氯化钙和氯化钡混合盐溶液为交兰州大学硕士研究生学位论文 6 联剂，制备海藻酸盐微囊 。 研究表明：以 ： 为 7： 3作为混合交联剂制备的微囊力学强度提高而且对于大分子物质的通透性较好 ,但是强度提高并不明显 。 通过此实验，把传统的阳离子交联剂 成了混合阳离子交联剂 这为以后学者们的研究开拓了思路。 16 等研究表明改变阳离子交联剂的种类，分别用 为阳离子交联剂形成的凝胶在性质上存在很大差异， 对于高 为交联剂，生成的 凝胶小球：体积小，强度高，孔径小； 为交联剂，生成的 凝胶小球：体积大，强度低，孔径大 ，对于高 作用与高 其原因在于 与藻酸盐的 与藻酸盐的 片段连接 ， 所以导致了以上小球性质的不同 。 2010年 5等首次把甲基丙烯酸盐引入海藻酸盐改性的材料中，研究发现通过化学交联甲基丙烯酸藻酸盐和聚二甲基丙烯酸形成凝胶，在提高藻酸盐凝胶强度的时候能够减弱对其渗透率的影响，但是这种 方法较复杂。 2011年 5等制作出甲基丙烯酸藻酸盐凝胶微球，并在光催化剂 结果 下降约 10%。 2011年 36等研究把甲基丙烯酸藻酸盐凝胶微球的光交联剂换成 后用其形成的凝胶培养牛软骨细胞，发现牛软骨细胞的生存能力大于 85%，通过改变光交联剂的种类对 时也证明了 综上，我们 假设若把 合作为阳离子交联剂 与甲基丙烯酸海藻酸盐作用，形成凝胶 ， 阳离子交联剂与 海藻酸盐的 G、 M、 论是高 片段的藻酸盐，混合阳离子都能兼顾其强度的提高和渗透性的不降低，同时甲基丙烯酸海藻酸盐的强度也高于海藻酸盐，所以既能提高海藻酸盐水凝胶的强度又不至于使其渗透性大幅下降。在本实验中我们采 用不同比例的氯化钡和氯化钙的混合盐溶液作为阳离子交联剂，制备甲基丙烯酸海藻酸盐凝胶小球，比较了不同比例的 混合溶液作为阳离子交联剂制作的凝胶小球的压缩模量和渗透性 ， 以期其能更好的应用于组织工程支架材料领域。 兰州大学硕士研究生学位论文 7 第一部分 混合阳离子交联剂甲基丙烯酸海藻酸盐微球的构建及其性能研究 随着海藻酸盐在组织工程中的应用增加，学者们发现海藻酸盐的强度不足，不能够支持细胞长期生存发展的需要 ， 并且研究发现细胞外基质的强度会影响细胞的表型、增殖 37 ， 所以学者们开始对其进行强度改性。刚开始的尝试都是从增加聚合物的浓度、增加交联剂阳离子的浓度上入手的，最后发现强度虽然提高了，但在实际培养细胞的应用中，细胞的活性还有增殖却并没有得到提升。又经过研究发现，海藻酸盐水凝胶表面，在 成胶时形成的“蛋格”样结构的孔隙，会随着交联密度的增加而减小，而这些孔隙正是营养物质进入凝胶供应细胞生长的通道。所以人们便转变思路，想寻找一种方法，既能提高海藻酸盐水凝胶的强度， 又 不至于使其凝胶的孔隙减小。在这个过程中，有国外学者研究发现，不同的二价阳离子和海藻酸盐作用形成的水凝胶的强度，孔径不同，提示我们可以改变阳离子的种类，来实现提高凝胶的强度 的同时 调控其孔径。国内又有人研究把阳离子混合作为交联剂，和海藻酸盐作用形成水凝胶，发现混合阳离子比单一阳离子形成的凝胶的性能更好，为我们在混合阳离子作为交联剂上提 供了思路，但是只改变阳离子，只能有限的改变凝胶的强度和孔隙。近年，国外学者又研究发现，通过化学反应，把甲基丙烯酸引入海藻酸盐，然后利用甲基丙烯酸上双键的不稳定性，通过光反应或者热反应使双键发生聚合， 从而 在分子量上改变海藻酸盐的性能，使其形成的凝胶具有更高的强度 ， 此实验已经获得成功，但只是使用单一的阳离子作为阳离子交联剂，没有探讨混合阳离子的效果。因此，本研究利用混合阳离子 为阳离子交联剂与甲基丙烯酸海藻酸盐进行成胶反应，并对生成的凝胶做强度和渗透性的检测，为其以后在组织工程支架材料的应用中 ，提供实验依据。 实验材料及溶液配制 验材料及主要仪器 低粘度海藻酸钠（ 国）；氯化钙 (分析纯 )；氯化钡（分析纯）；海生工）； 国）； 亚试剂 ）； 灵威）；热引发剂 冻干燥机 (核磁分析仪；万能材料测试仪 紫外分光光度计；透析袋； 兰州大学硕士研究生学位论文 8 验方法 基丙烯酸藻酸盐 (制备 1）配置 l 缓冲液： 子量为 l，配置 250ml 冲液。 称取 末，加入 250三蒸水中，玻璃棒搅拌至完全溶解，调节 h=4保存，待用。 2）按照质量体积比 1/100的浓度 ,把藻酸盐溶解在 50ml 冲液导入圆底烧瓶中 ,加入 酸盐粉末。放入磁子，在磁力搅拌机搅拌将约 酸盐完全溶于 冲液。 3） 按照 15等的方法制作 搅拌均匀的海藻酸盐溶液中，按照2： 2： 1 的比例，相继加入 1 基二甲基胺丙基碳化二亚胺 ) 、 。其中 藻酸盐的糖醛酸基团的比例保持在 5/100 不变。因为藻酸盐是大分子 ,分子量是一个大体的范围 ,所以藻酸盐分子量的确定我们采用算出它一个 G 或 M 单元的分子量 ,然后算出 酸盐中含有多少摩尔的 G 或 M 单元 ,也就确定了糖醛酸基团的摩尔数 ,最终确定 用量。一个 G 或 75,所以 照 基团的比例保持在 5/100 不变的比例需要加入的 0照 ： 2： 1的比例 ,需加入的 摩尔量依次为 :000以 用量依次为： ， 02366g。以上混合液依旧放在圆底烧瓶中，在磁力搅拌器上搅拌 19h， 194000的透析袋中，进行透析，每 6水 (透析用的是蒸馏水 )透析 48小时，然后视透析完成的情况，若是觉得透析后透析袋里的水太多，可以把透析好的溶液在冷冻干燥的前一天取出来，放在烧瓶中，放入磁子，进行搅拌蒸发，也可以先放在烘箱中温度 30左右，烘 右，然后放在磁力搅拌机上进行搅拌 、 蒸发 ， 以便于第二天进行冷冻干燥的效果。 4） 把透析好的溶液进行冷冻干燥：取液氮，装样，每个样都要贴上自己的标签，装好样后在液氮中冷冻，一定要全部冻成冰，放在冷冻干燥的机器上进行抽真空，使得冰在低温下升华挥发，需要时间为 24h，最后收集产物。 5） 对产物 中混有 核磁谱图分析 39：取少量产物（ 放入核磁管，溶解于氘水中，用 300核磁检测，最后对检测结果做氢谱分析 ,通过氢谱分析看产物有没有按预期结果引入需要引入的双键基团。 兰州大学硕士研究生学位论文 9 合阳离子凝胶小球的制备 1）配制二价阳离子总浓度为 的氯化钙和氯化钡混合盐溶液。 7： 3的混合阳离子盐溶液 的 配制：称取氯化钙 化钡 于 50蒸水中，在磁力搅拌器上搅拌 完全溶解，滴入几滴稀盐酸溶液，中 和生成的碳酸钡沉淀最后调节 4保存，待用。 5： 5 的混合阳离子盐溶液配制：化钡 0余步骤同上。 3：7 的混合阳离子盐溶液配制：称取氯化钙 化钡 于50蒸水中，其余步骤同上。 0： 10 的混合阳离子盐溶液配制：称取氯化钙 0余步骤同上。 2） 按照质量百分比 1/100 配置得到的产物 ( 混合溶液25照 11000 的质量百分比添加热引发剂。量筒量取 25馏水倒入烧杯中 ,然后用电子天平称取 产物 ( 放入磁子搅拌 ,使产物溶解 ,然后加入 热反应引发剂 (重结晶的 搅拌使溶解 以下简称溶液 A. 3）准备一个 100圆底烧瓶 ,贴上标签 7： 3 加入 30 7： 3 的混合溶液。然后用成胶针头， 5滴滴入 5溶液 A,形成凝胶小球。油 浴加热使热反应发生 ,温度为 80 ,反应时间为 5 小时 收集产物凝胶小球 ,收集方法为用滤布过滤 ,产物小球用蒸馏水冲洗两次 ,然后把小球转移到培养皿中 ,30蒸馏水孵浴，待用。用此方法分别制作 5： 7、 3： 7 组的凝胶小球。制作出的小球直径大约为 2 验分组 1)对照组：称取海藻酸盐 1g，溶于 100磁力搅拌器上搅拌 制成 质量百分比 1/100的 海藻酸盐溶液，以下称为溶液 B，待用。取 30 0： 10 的混合阳离子盐溶液 放在一个100后用成胶针头， 5针管，逐滴滴入 5溶液 B，生成凝胶小球，反应时间 1小时，收集方法同上面的小球收集方法，最后也是放在培养皿中， 30蒸馏水孵浴，待用。 2)实验组：把上面以不同比例 合溶液与 次标记为： 7： 3为 样本 1， 5：5为样本 2， 3： 7为样本 3。 缩模量测量 为了方便测量压缩模量，我们利用 一个圆柱形的大 10 混合阳离子溶液反应，然后直接把大 放入油浴中进行热反应，反应时间也是 5小时。最后反应结束后把凝胶块从离心管中取出，用不锈钢小刀修剪成近似圆柱状。用万有材料测试仪测试各组材料的压缩模量。万有材料测试仪 3见附录一 ）的压缩速度为 1mm/至凝胶块被压为薄片终止压缩，获得凝胶块的压缩模量 ， 每 个样本 准备 5个 试样 ，重复测量5次 。 用 算得出压缩模量 。 透性测定 1） 牛血清白蛋白和胰蛋白酶溶液的吸光度和浓度之间的线性关系测定。分 别配置浓度为 0、 牛血清白蛋白和胰蛋白酶，并测量其在 280后根据吸光度和浓度建立坐标，观察坐标点之间的线性趋势，以 1d，算出 2） 按 童粤生 10等的实验方法测定凝胶渗透性：配制浓度为 4个 1000烧杯，分别加入四组已制作的凝胶小球，每个烧杯 200 个小球和 800胰蛋白酶溶液，于 12481632别取各组烧杯中的上清液 10紫外分光光度计测量 280的 ，记录各组实验数据。对 牛血清白蛋白溶液的渗透性测量方法同胰蛋白酶组。 计学分析 采用 得数据以 x s 表示。组间比较采用单因素方差分析， P 果 A 氢谱分析图（见图 4） 甲基丙烯酸藻酸盐的化学式见图 1,若 之 间出现峰 ,均为甲基丙烯酸本身的峰 ,而 之间未出现显著的峰值 ,说明产物 氢谱分析可以得出甲基丙烯酸和藻酸盐发生了反应，生成了甲基丙烯酸藻酸盐（ 兰州大学硕士研究生学位论文 11 : 4:甲基丙烯酸藻酸盐的氢谱分析结果 . 合阳离子交联剂凝胶块的压缩模量 。 从结果分析中可以得到，与对照组相比，实验组的凝胶压缩模量均有显著的提高（ p实验组中样本 2 5： 5组压缩模量最高，样本 1 7： 3组压缩模量次之，样本 3 3： 7压缩模量最低。（见表 1） 表 1 混合阳离子交联剂制作的各组凝胶小球的压缩模量（ s,n=5） . 分组 压缩模量 样本 1 样本 2 样本 3 对照组 间比较采用单因素方差分析，以 p差异有统计学意义 。 : of 合阳离子交联剂凝胶小球的渗透性 凝胶小球的直径约为 5见附录一 ) 兰州大学硕士研究生学位论文 12 凝胶小球对于胰蛋白酶的渗透性（见图 6） ， 根据 1d 测定出的上清液胰蛋白酶的吸光度值换算成浓度 . : of 图 6凝胶小球对胰蛋白酶的渗透曲线 . 凝胶小球对于分子量为 24透性的实验表明，胰酶在 2后逐渐趋于平衡。 32因素方差分析各组溶液 32的浓度之间的差异，以p结果分析中可以得到， 32本 2和样本 1 溶液中胰蛋白酶的含量较对照组降低较明显，差异有统计学意义p样本 3溶液胰蛋白酶的含量较对照组高，差异有统计学意义 p本 2溶液中胰蛋白酶的含量最低，表明样本 2小球对于胰蛋白酶的渗透性最好，和其它组之间的差异有统计学意义 p是总体来讲，四 组凝胶小球对于分子量为 24液达到平衡浓度后，溶液中胰蛋白酶的浓度最大仅下降 41%。 凝胶小球对牛血清白蛋白的渗透性（见图 7） 根据 1d 测定的上清液牛血清白蛋白的吸光度值换算成浓度。 兰州大学硕士研究生学位论文 13 : of 图 7凝胶小球对于牛血清白蛋白的渗透曲线 . 凝胶小球对于分子量为 67牛血清白蛋白分子的通透性的实验表明，牛血清白蛋白的溶液的浓度始终维持在 间，几乎没有变化，表明凝胶小球对于分子量 67 论 在以往的研究中，通过海藻酸钠和氯化钙反应生成的藻酸盐凝胶小球，小球的强度不高，易破碎，不利于海藻酸盐水凝胶在组织工程中的应用 31，同时 等研究发现基底刚度可以影响细胞的结构和功能，所以长期以来人们一直在探索对海藻酸钠水凝胶的改性，构建一种强度更大的海藻酸盐水凝胶。但是在以往的改性中，强度的增 加一般都是通过增加交联密度来实现，这样就会带来凝胶小球渗透性的下降 1。在组织工程中作为包埋细胞的材料，凝胶小球的渗透性是影响营养物质进入和细胞代谢产物排出的重要物理参数。目前国际上通常使用截留相对分子质量作为凝胶渗透性的表征，截留相对分子质量反应了凝胶对不同相对分子质量溶质的通透能力 40在本实验中用相对分子质量较大的牛血清白蛋白和相对分子质量较小的胰蛋白酶两种蛋白考察凝胶的渗透性。本实验研究得出， 5： 5组凝胶小球的强度比对照组有了显著的提高，同时对于胰蛋白酶的渗透性 也比对照组好，对于分子量较大的牛血清白蛋白与对照组一样具有截留作用。由于生长因子如白细胞介素类、表皮生长因子类等生物活性分子的分子量均在兰州大学硕士研究生学位论文 14 20下，而免疫大分子如 分子量均在 100上，所以该方法制作的小球可以满足小球内细胞对于营养物质的需要和分泌物的释放，并且可以起到对免疫大分子的屏障作用。所以应用 5： 5作为混合阳离子交联剂与甲基丙烯酸藻酸盐作用生成的凝胶小球，有希望成为一种更好的体外三维培养细胞和体内移植物包埋的支架材料。但是，本实验中采用热反应（加热到 80）来达到双键的断裂聚合，在实际应用中可能会受到限制，已有国外的研究资料表明 5，热反应使双键断裂聚合的反应可以在光反应条件下同样进行，光反应过程中可以用循环水冷却的方法，这样就可以控制温度维持在常温不变，使这种材料成为理想的组织工程材料变为可能。 兰州大学硕士研究生学位论文 15 第二部分 兔膝关 节软骨细胞的体外单层培养以及包有软骨细胞的藻酸盐凝胶小球的构建 软骨是由软骨细胞和胞外基质组成的，在体内分布在关节表面的软骨叫做关节软骨，在临床中，关节软骨的损伤是十分常见的一种疾病，一旦软骨损伤，便会影响关节的 活动，给人们的正常生活带来极大的影响。所以一直以来，对于关节软骨损伤的修复，都是一个重要的研究课题。近年来，由于组织工程技术的发展和应用，用组织工程方法来修复关节软骨损伤，被人们所认识到，并且取得了一定的成效，向人们展示出了广阔的前景。组织工程的研究内容一般都包括三个方面即种子细胞、支架材料和细胞生长的外环境。作为软骨组织工程的种子细胞，自体软骨细胞是最理想的，但是由于取材受限，增殖能力差，体外培养时容易发生去分化而失去原来的表型，使软骨组织工程的种子细胞来源受到限制。 近年来，随着三维（ 3D）培养细胞技术 的发展，人们发现，三维培养可以模拟软骨细胞的天然生长环境，有效的维持软骨细胞的表型，并且可以促进软骨细胞的增殖，让人们看到了在体外大量获得自体软骨细胞作为种子细胞的可能，本实验就是想在体外应用三维培养的方法，培养软骨细胞，检测细胞的增殖、活性、表型为软骨组织工程的研究提供一些实验数据。 兰州大学硕士研究生学位论文 16 实验一 兔膝关节软骨细胞的原代分离、培养及鉴定 软骨细胞的原代分离，培养是一项基本成熟的技术，早在 1967年，3等就用通过胰酶和型胶原酶消化关节软骨的方法，成功的把软骨细胞从坚韧的细 胞外基质中分离出来。此后，又有很多学者成功的在体外培养了动物和人的关节软骨细胞，对软骨细胞的体外培养条件，形态，增殖等做了详细的研究。 要试剂 高糖 剂型）（ 司 ,美国）；胎牛血清 (国 ,胎牛血清（ 国 杭州四季青公司）；胎牛血清（ 美 国 国 司）；胰蛋白酶（美国 司）；型胶原酶（美国 司） ；型胶原酶（美国 司）； 6孔 /24 孔 /96 孔板（ 国）；二甲基亚砜（ 京，亚太精细化工）；兔型胶原多克隆抗体（ 汉 博奥森公司）；羊抗兔 杉金桥，北京）； 杉金桥 北京）；甲苯胺蓝（美国 司）； 4%的多聚甲醛（索莱宝）。 要仪器 倒置相差显微镜（日本 州净化设备厂）；温孵育箱（德国 离心机（上海安亨 科学仪器厂）；烘干箱（德国 高温高压灭菌器（山东新华医疗器械司）；恒温摇床（美国 要溶液配制 1）高糖 将袋装干粉型 入 1000烧杯中加入磁力搅拌棒，并置于恒温磁力搅拌器上充分搅拌 4h，搅拌快结束时，整 到 右。准备消毒好的无菌金属滤器（ 膜已经提前安装好，并和滤器一起消毒），放入无菌超净台内。准备 4 个消毒好的 250超净台内安装过滤器进行过滤。装瓶后用封口膜及胶布密封口径，放入 4冰箱，备用。 兰州大学硕士研究生学位论文 17 2） 用电子天平称取 12入 1000烧杯中，加入 1000馏水，放入磁子，在磁力搅拌器上设置中速搅拌约 1h 至完全溶解，分装于 4 个 250上针头，灭菌消毒，消毒完毕后，待温度降至室温后， 4冰箱保存备用。 3） 称取 12 入 1000烧杯中，加入 1000馏水，放入磁子，在磁力搅拌器上设置中速搅拌约 1h 至完全溶解，分装于 4 个 250清瓶，插上针头，灭菌消毒，消毒完毕后，待温度降至室温后， 4冰箱保存备用。 4） 胰蛋白酶： 称取胰蛋白酶粉末 入 200杯中，先用少许 胰酶粉调制糊状，在定容至 100拌混匀，在超净台内过滤除菌，分装置小青瓶中于 存备用。 5） 取一个消毒好的 100入 90菌 加入 10酶，混匀， 4冰箱保存备用。 6） 称取 入 200杯中，用100无菌超净台，过滤除菌， 冰箱保存备用。 7）双抗（青链霉素）： 在无菌操作台内，用 5射器加 4理盐水于青霉素（ 80 万单位 /瓶）混匀，在用 5射器加 5理盐水于链霉素（ 100万单位 /瓶）中，混匀，然后弃去 1 8滤器过滤至已消毒的小青瓶中， 存备用。 8） 1g/L型胶原酶： 100胶原酶溶于 100 5%胎牛血清的高糖 ，磁力搅拌至完全溶解， 膜过滤除菌，分装至小青瓶，存备用。 9）胎牛血清的分装： 将新买来的胎牛血清放入 4冰箱过夜，第二天完全化开后，在无菌超净台上，分装置小青瓶中， 存备用。对于小牛血清，还需要灭活其中的补体，将化开的小牛血清放入 56恒温水浴箱中，每 5分钟摇晃一次，总灭活时间为 30活后的处理同胎牛血清。 10)冰醋酸液： 00配现用。 11） 液： 称取 末，溶于 20滤除菌后，分装于小青瓶中， 4冰箱保存备用。 12）甲苯胺蓝染液： 称取甲苯胺蓝颗粒 00后加入三蒸水，定容至 50光放在磁力搅拌器上低速搅拌，至完全溶解，兰州大学硕士研究生学位论文 18 现配现用。 13）兔型胶原多克隆抗体 (一抗 )： 体中加入 100温解冻 10加入 100装至 10个小的 管 20用。 14）细胞冻存液： 在无菌操作台内，按照 ： 4:1的比例，配制冻存液，现配现用。 15）完全培养液： 在无菌操作台内，准备一个已消毒的 100清瓶，加入 90101抗、 1氨酰胺， 2匀， 4冰箱保存备用。 验方法 验动物 出生后 1 月龄的日本大耳白 兔 （图 8 见附录一 ）（中国农业科学院兰州兽类研究所提供） 子膝关节软骨细胞的分离、培养、消化、传代 1）对实验所要用到的器械进行消毒，包括刻、尖吸，离心管及盖子，锥形瓶，烧杯，一个手术器械盒（咬骨钳，大小剪刀 ，大小镊子，手术刀及刀片，持针器），玻璃培养皿。 2）耳缘静脉栓塞法处死兔子，在 75%的工业酒精中浸泡 1h 消毒，提前准备好无菌操作台的消毒，在无菌操作台内对兔子进行膝关节的解剖，游离出双侧膝关节，放入无菌烧杯中，烧杯中注入含双抗的 没膝关节，然后收拾超净工作台，把分离好的膝关节带入无菌间，在无菌间的超净台上进行软骨细胞的分离。 3）在无菌超净台内，先对游离出的膝关节进行一些修理，使关节表面完全暴露，然后用 12#手术刀片，从膝关节软骨表面，把软骨层轻轻取下来，放入提前准备好的六孔板的一个孔中，孔里面注 满含双抗的 骨细胞取完后，用含双抗的 洗 3 遍（图 9 见附录一 ），用眼科镊转移至 50菌消毒的小烧杯中，滴入一两滴 后用眼科剪剪碎至 1入胰蛋白酶，进行消化 30化期间用玻璃棒搅拌，帮助消化。胰蛋白酶消化完成后，用尖吸吸掉胰蛋白酶，加入型胶原酶，视软骨的量，加入 10移至锥形瓶，放入恒温摇床中， 37， 86r/化 6h。 4）消化完成后，在无菌超净台内，用 80目金属滤网过滤消化液至一个兰州大学硕士研究生学位论文 19 已消毒的六孔板中，过滤完成后，把消化液转移至 101000r/心 5上清，加入 800r/上清，加入 5右的完全培养液，吹打成单细胞悬液，血细胞计数板计数，按照1*105/浓度接种于 50次性塑料培养瓶中，放入饱和湿度、 5%37恒温孵育箱中培养，视细胞生长状况， 72 5）原代软骨细胞大约一周可以长满瓶壁的 80%然后用 酶消化， 消化时间两分钟左右，在显微镜下观察细胞之间分开，变成圆形，代表消化到位，然后倒掉消化液，加入完全培养液，把瓶壁上的细胞都吹打下来，吹打要用力均匀，尽量不要产生气泡，吹 打 成单细胞悬液后，用血细胞计数板计数，按照 1*105/ 膝关节软骨细胞的冻存和复苏 1）冻存一般都选择对数生长期的细胞，冻存前一天全量换液，冻存时用 酶把细胞消化下来，加入完培终止消化后，吹打成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，然后放入离心管中， 1000r/上清液，根据细胞的量 ,按照细胞 密度为 5*10607/入冻存液，吹打成单细胞悬液 ， 分装于无菌冻存管中，每只冻存管加入的量不要超过一半的容积，拧紧管口，封口膜封闭，白胶布封口，包上棉花，放入 4冰箱 1h， 箱 1h，然后放入 箱保存，冻存管和棉花上都应做好标记，标明细胞的代数，冻存时间等，一般冻存时间不能超过三个月，否则对细胞的活性会有影响。 2）复苏细胞时，于 箱取出冻存管，在无菌操作台内，放入提前准备好的 37水浴中，轻轻摇动，以便速溶。溶解后，去除棉花，用酒精擦拭管壁，吸出细胞悬液到离心管中，然后 加入 10 倍体积的完培， 800r/上清，加入完全培养液，吹打成单细胞悬液，分装于 50胞培养瓶中培养，因冻存对细胞的活性有一定的影响，复苏后的细胞浓度应该大于正常培养的细胞浓度。次日观察细胞状态，视情况换液。 骨细胞的甲苯胺蓝染色鉴定和免疫组化染色鉴定 细胞的准备和固定： 取 处于对数生长期的软骨细胞，用 酶消化成单细胞悬液，计数后，以 2*104/浓度接种于预先放置了 4 个222玻片的六孔板中，放入孵育箱中培养两天，待细胞铺满盖玻片60%， 取出盖玻片 4%多聚甲醛固定 30 甲苯胺蓝染色： 1) 漂洗：流水轻轻漂洗固定的细胞爬片 5 兰州大学硕士研究生学位论文 20 2）染色：细胞爬片漂洗完成后，不要太干，放入甲苯胺蓝染液中，染色 30水轻轻冲洗， 去除 多余的染液。 3） 分化： 入冰醋酸液分化至胞核和颗粒清晰或者切片逐一进入75%95%的乙醇溶液，各 5入无水乙醇两次，每次 1 4）流水冲洗。 5）透明：过二甲苯溶液两次，每次 1 6) 封片：从二甲苯中取出爬片后，在载玻片上滴加适量的中性树胶（ 1把爬片轻轻的由一端到 另 一端 放下，注意排气泡，放好后，就不要动了。 7）镜下观察细胞的染色情况，照相。 免疫组化染色： 1) 漂洗：流水轻轻漂洗固定的细胞爬片 5 2） 3%双氧水室温孵育 30处内源性过氧化物酶的活性。 3）滴加封闭血清工作液，室温孵育 15 除 血清，勿洗。 4）在以上处理的细胞爬片上，滴加兔型胶原多克隆抗体（按照 1:50的比例用 4过夜。 5） 次三分钟。 6)滴加生物素标记的山羊抗兔 37孵育 15 7） 次三分钟。 8） 显色 2现配现用，避光保存） 9）自来水充分冲洗。 10）脱水：切片逐一进入 75%95%的乙醇溶液，各 5入无水乙醇两次，每次 1 11）二甲苯透明和中性树脂封片同甲苯胺蓝染色。 果 代软骨细胞及 软骨细胞的倒置显微镜观察 贴壁的软骨细胞呈多角形或者短梭形，细胞核为圆形或者椭圆形，细胞核及核仁清晰可见，位于细胞中心（图 10见附录一 ）。随着培养时间延长，细胞进入对数期生长后，密度增加，整体看去呈不规则的“铺路石”样（图11 见附录一 ）。细胞由原代 传至 后，大约 5h 左右完成贴壁，第二天进入对数生长期，一到两天既可以长满整个瓶壁，传至 以后，细胞形态兰州大学硕士研究生学位论文 21 发生一定的改变，变大，不规则，继续传代至 以后，细胞较稀时，形态如洒落地面的鸡蛋清。 骨细胞的鉴定 细胞爬片的甲苯胺蓝染色：糖胺聚糖为酸性物质用甲苯胺蓝等碱性染料染色后，可见细胞内出现蓝紫色异染颗粒，表明细胞分泌大量的氨基多糖，此种染色对软骨细胞特异性不强（图 12 见附录一 ）。 细胞爬片的型胶原免疫组化染色 ：可见 胞浆着色，呈棕黄色，表明有型胶分