【毕业学位论文】（Word原稿）拟南芥转录因子TCP17在光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用

兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 1 第一章 前言 信号通路 在植物的生长发育过程中起着重要作用 光作为最重要的环境因素之一，在植物的生长发育过程中起着至关重要的作用。通过感知不同的光照条件，植物获得周围的环境信息，进一步调节自身的生长发育过程，来确保生命活动处于最佳状态 ( et 2007)。 光控制植物生长发育的诸多方面，如：种子萌发，开花，光形态建成，向光性等。光信号通路与植物体内激素通路存在广泛的联系，它可以改变植物体对激素信号通路的应答；同时，植物体内的激素水平也会影响其对光的响应 (M et 光信号在植物体内的传递起始于光受体对光信号的感知，随后通过一系列的级联反应，将信号向下传递至细胞核，引起光响应基因表达量的改变，进而调控植物的生长发育 ( et 2007; H. 2002)。对于萌发后的幼苗来说，光是控制其发育的决定性环境因素。 在暗下，植物幼苗出现暗形态建成的特征，表现出下胚轴伸长，顶端形成弯钩，子叶不打开；在光照条件下幼苗则表现出光形态建成的特征，主要有：下胚轴缩短，子叶张开，叶绿体数量增多，开始发育 ( et 2007)。 在控制幼苗形态建成这一过程中，光受体在感受光信号上发挥巨大的作用。植物体中比较重要的光受体主要有四个： 受红光和远红光信号； 受蓝光信号。由这些光受体传递下来的光信号在汇总 (A et 一类在进化上相当保守的蛋白，他们属于泛素 （ 统的成员，是光形态建成的关键抑制基因。在暗下，它们以 促进光形态建成的转录因子为底物，如： 底物，介导它们在蛋白酶体中发生降解，进而抑制光形态建成 (, et T et 在光照条件下， 白被光激活的光受体传递的信号所抑制，导致 促进光形态建成的转录因子的积累 (T et 是白的成员之一，它是一种泛素 接酶，它可以与许多光形态建成转录因子相互作用，与 F 族蛋白一起介导这些转录因子的降解，促进暗形态建成 (, et et 除了 ，另外一类螺旋 螺旋（ 录因子 在抑制暗下的光形态建成过程中起着重要的作用。这类转录因子被称为( et 2008)，它们可以与光敏色素（ 接相互作用，且与 作用要强于 州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 2 这类转录因 子包括以下成员： ( 及 et 遗传学和生物化学的研究表明，它们位于光敏色素（ 直接下游，介导它们的信号转导，目前也有研究表明 能参与隐花色素 （ 介导的信号转导 ( et et 2009)。在暗下， 于活化状态，调节基因表达，促进暗形 态建成 ( et 2008)；在光照条件下，光敏色素被光照激活，由非活性的红光吸收状态（ 态转化为活化的远红光吸收状态（ 与 互作用，磷酸化 致 后被蛋白酶体降解，促进光形态建成 ( et et 稳定依赖于 ( et 2008; et 目前的研究表明光敏色素可以通过 条关 键通路来传递信号，而隐花色素则主要通过 传递信号，进而调控幼苗的形态建成。最近有研究报道隐花色素 以通过与转录因子 互作用调控开花，这一研究表明，隐花色素除了 号途径外也可能存在通过直接与转录因子相互作用来调控植物的生长发育，目前与 互作用，调控幼苗光形态建成的基因还未发现。 光通过促进赤霉素（ 号通路的关键抑制蛋白 积累，来调控 号通路 ( et 最近的研究表明， 以与 合结构域直接相互作用抑制 合能力，使受 控的暗形态建成基因的表达受到抑制，从而促进光形态建成。 这种抑制作用可以被外源施加的 解除 ( et 2008; et 除了 ，其他许多激素也参与调控幼苗的光形态建成。 录因子家族另一重要成员 光参与激素控制的种子萌发过程中起着分子开关的作用。光特别是红光在诱导种子的萌发过程中起着至关重要的作用；作为调控萌 发过程中的两个重要激素， 进萌发过程， 制萌发。 为 光信号通路的另外一个关键组分 光信号通路与其他激素通路，如 :胞分裂素 (生长素（ 脱落酸（ 整合点 (P et et et 007; D et et L et 一个具有亮氨酸拉链结构域的转录因子，它在各种波长光照条件下都起作用，通过直接调控光响应基因的表达来促进光形态建 成 ( et et H et 目前的研究表明， 细胞分裂素在蛋白水平上调控 过调控 促进降解，而 通过调控 促进 稳定 ( et 兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 3 et 但 何调控 前还不清楚。进光形态建成部分通过调控赤霉素（ 生长素（ 脱落酸（ 号通路来进行。 以直接或间接调控光形态建成过程中大量激素响应基因的表达。 其同源基因 抑制生长素信号通路中起到重要作用 (P et et 制生长素信号通过直接促进 生长素信号通路中的负 向调节因子， 及 。染色质免疫共沉淀（ 果显示许多 号通路中的基因也是 靶标，包括： ( et 同时 烯通路信号分子 号通路中 谢相 关酶 乙烯代谢相关酶 谢相关酶 莉酸（ 谢相关 L et 长素 的合成过程 生长素作为最先发现的植物激素在植物体的生殖、发育过程中起着至关重要的作用。大量的研究表明，吲哚三乙酸（ 为自然合成的生长素的主要形式在维持顶端优势、对光的响应、向地性、根和茎的建成、维管束的分化、胚胎发育、茎的伸长等重要的生长发育过程中发挥着重大作用 (004)。内源 生长素含量的改变能诱导 关基因的表达，也能通过生长素受体 控 表达 (et 2005; 2005)。生长素在植物体内通过极性运输的方式有产生部位运输到作用部位，这一过程主要由 族蛋白分别负责生长素的输入和输出。 生长素在时间和空间上的积累对植物的生命活动至关重要 (2001; 2003; et 2005)，植物体在进化过程中发展出一系列的机制如：生长素的合成、活性生长素与其他物质偶联成为活性形式、降解、运输来维持体内生长素的正常含量，但生长素的生物合成仍然是维持生长素含量的主要机制。 作为生长素的主要形式， 1930s 被发现以来一直被认为是生长素的等同物。遗传学和生物化学的研究表明色氨酸（ 植物体内主要的 成前体 (W, et 2005; , et 2010)。目前的证据显示，植物体主要存在 4 条从 途径 ： 径； 吲哚 径；吲哚 径；吲哚 称为 径 (, 州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 4 2010; , et 2009)。 径存在于少数表达将 化成 族成员物种 (, et 2009; , et 1998; K, et D, et 2000; , et 径广泛存在于植物体中，但如何产生的目前还不清楚 (, et 2010)。 径的第一步由化 转化， 胚胎发育、花的发育、幼苗生长、维管束排布、侧根发育、植物趋性、庇荫性、高温依赖的下胚轴伸长等生长发育过程中起着重要作用 (, et 2008; N, et 2008; , et 2009)。径是较为常见的合成 方式，对 胚胎发生、花的发育、幼苗生长、维管束的分化与排布有着重要作用 (, et 2002; , et 2006; , et 2007; , et 2007)。 因编码黄素单加氧酶类蛋白，是 物合成过程中的限速步骤，广泛存在于不同种植物体内 (, et 2008; , et 2002)。 通过激活标签法鉴定到了编码 5 个基因位点 (et 2001; et 2002; et 2005)，所有通过激活标签法筛选得到的 变体都表现出明显的生长素过量的表型。 拟南芥体内共有 11 个 因，他们负责催化 转化 (et 2001; et 2006)。 因之间存在功能冗余性，这表现在 因单突没有明显表型， 重突变体表现出严重的生长素缺失表型，但不同的因又有着自身功能特 异性 (et 2001)。许多环境条件的改变都会引起达量的变化，如在高温诱导的下胚轴伸长过程中， 表达量随着高温处理时间的延长而增加，这种增加是依赖红光 /远红光 通路重要转录因子 目前关于调控 达的研究还不太多，外界环境因子是如何调控 族转录因子参与拟南芥生长发育过程多个方面 植物的正常生长发育受到许多转录因子家族的调控，如： (et 2000)。 录因子是一类植物特有的转录因子， 且迄今为止只在被子植物中被鉴定到， 在植物的发育过程中发挥着重要作用。 录因子的命名是根据玉米中的 鱼草中的及水稻中的 得来的(et 2007; 2009)，它们广泛参与植物的生长、细胞分裂、 器官的形成等生物学过程 (et 1995; et 1996, 1999; et 2003;et 2003)。 族成员属于螺旋 螺旋转录因子（ 家族成员，根据 构域的序列不同， 族被分为两个亚家族，即： 州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 5 在植物生长发育过程中发挥正调控的功能；和 生长发育进行负调控(2002; Li et 2005)。 因编码的蛋白都含有约 60 个氨基酸残基的保 守区域，被称为 构域。 构域介导 白与富含 列的顺式作用元件的结合 (, et 2010; L, et 2012)。 因影响玉米中侧芽的发育，在墨西哥书立的驯化过程中起着重要作用。 (et 1995; et 1999; 1998)。 变使玉米长出大量的侧枝，出现大量的穗状雄花，这与野生型中侧枝受抑制以及雌花发育的表型相反 。这些结果说明 侧枝 生长的和雄花发育的抑制子。 变体通过下调细胞周期相关的周期蛋白 3b、 1、 et 2000)。 通过用水稻中的 别作为 代表进行随机结合位点筛选，他们的结果显示 保守结合位点分别为 G(T/c)核心序列为 过单核苷酸突变的方法将G）和 +1（ C）分别突变为 T 和 A，蛋白和寡核苷酸就没有了结合作用，说明核心序列对 白与靶基因的结合至关重要。 最近的研究表明拟南芥中 录因子可以结合在核心序列为 的式作用元件上 称为 et 1995; 2002; et 2003)。 件被证明参与调控定位于线粒体的蛋白在核内的转录 (2005; et 2007; 2009; et 2009; et 2009)。研究发现，含有 白昼交替的调控， 呈现周期性的变化。酵母单杂交数据显示 录因子可以与含有 式作用元件的这些基因相互作用，同时酵母双杂交也证明 族的许多成员可以与参与生物钟的因子相互作用 (et 2010)。 录因子是拟南芥基因组中比较庞大的 一个转录因子家族，由 24 个成员组成，根据其 合结构域的氨基酸序列相似性可划分为 M. P. 2010)。近年的研究表明， 族转录因子在植物的生长、发育以及应答外界信号方面起着非常重要的作用 (M. P. 2010)。位于 支上的 表达受 导的转录后调控，对细胞分裂起着抑制作用。它们在功能 上具有很大的冗余性，主要参与叶形的发育，当超表达 ，它们的表达量被大量下调，使得叶边缘叶细胞大量增殖，叶片表现出强烈的锯齿化 (A., S. T. 2009)。通过表达超活化的 使营养生长期缩短，生殖生长提前；同时降低细胞的增殖速度，产生较小 的叶片，严重时兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 6 产生杯状子叶；同时表现出育性降低和提前衰老的表型（ , et 2011）。后来的研究表明受 控的 过与 互作用，直接结合到第一家族的 因 启动子区抑制其表达，进而控制叶片的发生和发育(, et 2012)。 编码 区域单碱基突变引起 功能缺失，将引起其靶基因 其是 表达上调，引起花瓣变窄变短，花药发育缺陷 (, et 2009)。 时还通过直接调控 成基因的表达促进 合成从而介导叶片的衰老过程 (2008)。说明 控制细胞分裂分化过程中起着重要的调节作用。 进化关系较为相近，今年来的研究表明，在野生型中超表达 抑制型蛋白 35S:扰 正常功能，会造成植株的发育异常，这主要是由于干扰了一些在器官的发生于发育过程中起关键作用的边缘基因的表达所致。在 35S:基因材料中 因， 边缘基因的表达量被大量上调，同时表达区域也扩大 (, et 2007)。进一步的研究结果表明 ， 接结合到 启动子区，通过促进 表达来降低其靶基因 表达，同时 直接参与调控 生长素信号通路的关键因子 表达 (T., M., M. M. 2007)。 第一家族成员，它们控制发育叶片、特殊花器官以及幼嫩节间细胞的增殖，共同参与了调控拟南芥节间和叶形的发育 (, et 2011)。研究表明， 与 族成员相似的机制调控发育过程，持续表达 动子驱动的 制蛋白，使植株矮小，叶片上卷且出现大量小二未分化细胞； 影响花瓣，花柄，花丝的发育 (G, et 2012)。 基因植株中 边缘基因的表达量上调 (G, et 2012)，同时， 以与 启动子结合，参与生长素信号通路的调控。 同时 过直接与3 和 启动子区结合抑制表皮毛和子叶中的核内复制 (Y, et 2012)。 胚胎的微管组织中表达，在种子的萌发过程调节胚胎的生长潜能。最近有报道 乙酰氨基葡萄糖转移酶 互作用而被乙酰氨基葡萄糖基化（ 影响 细胞分裂素（ 敏感性，同时 促进 应基因的表达 (, et 2012)。 与调控细胞的增大，分裂，以及分化， 2/M 期表达的 的启动子区结合，调控细胞分裂 (, et 2009)。表达 制基因引起根和下胚轴中 252 个基因下调，这些基因的启动子区都含有 列 这些基因中有许多是控制细胞壁合成兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 7 相关基因以及控制植物发育的转录因子 (, et 2009; , et 2012)。 玉米中 源，在发育的侧芽中表达，抑制腋芽的表达，失突变体产生大量的侧枝。 控侧芽发育这一过程中处于 号通路的下游，且是生长素介导的顶端优势所必须的 (, et 2007; A, et 2007)。 在生物钟的调控过程中， 成了植物体生物钟调控环路， 活性， 制 转录，但 有 合能力， 以与 互作用，直接结合到 启动子区。 生物钟的重要组成部分，与 功能相同，共同抑制 时 表达受 L, et 2009)。 于 支上，与 源性较高。我们 用激活标签法从 景下筛选得到 恢复突变体 现出 剩的表型，同时 35S:现出 失突变体的表型，说明 R 通路中有着重要作用。进一步研究表明， 以直接结合到 成关键 基因 启动子区，促进其表达，使内源 量增加，促进植物的生长(, et 2011; ,et 2010 )。 族转录因子除了在拟南芥的生长发育过程中发挥着重要作用，也参与调控其他物种的生命过程。豌豆 录因子 玉米 及拟南芥 源，在独脚金内酯的下游调控分枝 (,et 2012)。棉花中 于第一家族成员，含有 344 个氨基酸残基，通过促进 生物合成促进棉花纤维的伸长和根毛的发育 (, et 2012)。 扰 表达，导致棉纤维变短，在拟南芥中超表达该基因促进根毛发生和伸长。 在金鱼草中， 以与矮牵牛 南芥 同源基因 同调控器官边缘基因的表达。 目前虽然有大量的文章报道 族成员的功能，但并不系统也不完全，我们对 录因子家族参与的生物学过程及其机理的认识还存在大量的空白，大部分 族成员的功能都没有报道。同时由于 族存在高度冗余性，单基因缺失一般不会有任何明显的 表型，因此我们将 24 个 族成员用 35S 强启动子驱动超表达在野生型（ ，研究各个 录因子控制的不同生物学功能。通过在野生型中过表达 们获得了大量的一手数据，表明 与了拟南芥生长发育的各个方面。其中我们感兴趣的 于 支的成员，与 进化上的关系最近，它们与同为 支的 州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 8 同，并不受 控，因此推测它们在生物学功能上也不尽相同。 生长素能促进细胞伸长，光对下胚轴的伸长有抑制作用，但这两 者之间的联系目前并不清楚。 前面的研究表明 因过表达会导致光下下胚轴的伸长， 而暗下不便，说明 因调控下胚轴伸长是依赖于光的。 我们的进一步研究表明， 生长素合成限速酶编码基因 表达受光调控， 而光控因表达是依赖于 ，同时 表达受光调控， 说明 兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 9 第二章 材料与方法 于 术的基因克隆 需试剂 基因特异性引物，通用引物 50保真酶 验步骤 在感兴趣的基因两端设计引物， 基因序列可以从 站查找，如果克隆基因本身我们一般以 为参考序列，如果克隆启动子区我们一般选取 500区域。在引物的 5端加上同源重组序列的一部分。 通过两轮 增目的片段：第一轮用基因特异性引物扩增，如果是克隆基因采用 为模板，如果克隆启动子序列则用基因组 为模板。反应体系一般为 20增条件为 第二轮以通用的 为扩增引物，这两条引物与第一扩增引物有一段重叠区，通过 法能将整个 源重组区整合到基因两端。 反应体系一般为 40应条件为： 回收目的片段：将第二轮 物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外灯下将目的片段切割下来按照胶回收试剂盒的方法步骤回收目的片段。 应：取回收得到的目的片段 入 管中，再加入 门载体 及 P 酶，混合均匀， 25 放置 2时，为了提高重组效率我们一般孵育过夜。 转化：将制备好的大肠 杆菌 受态细胞从 出，置于冰上待其慢慢融化后将 应产物全部加入感受态细胞中，用枪头轻轻搅匀（不能上下吹打），放置在冰上静置 30 分钟，然后在 42 水浴中热激 90 秒，立即取出在冰上放置至少 2 分钟，加入不含抗生素的液体 养基 37 孵育 1 小时使抗性基因表达。将孵育好的菌液在 8000离心 1 分钟，吸去多余上清，留取 100右，用加样枪吹打均匀，全部涂布在含有 生素的固体 养基上， 37 孵育过夜。 阳性克隆的鉴定：将过夜培养的平板取出，用无菌的枪头挑取单克隆在 10 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 10 无菌水中吹 打均匀（一般挑取 4 个单克隆），取 2为模板用基因特异引物进行 增，有大小正确的目的条带的为阳性克隆。 将初步鉴定为阳性克隆的剩余菌液加入 3 液体 养中 37 摇培过夜。将过夜培养物取出8000心收集细胞沉淀，用质粒小量提取试剂盒提取质粒。取 3粒用 7 酶切 2 小时，酶切结果通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。酶切结果正确的为阳性克隆。将经鉴定为阳性的质粒通过测序进一步确定其 准确性，若测序结果经与数据库中的序列比对正确，则得到 应：取 1测 序鉴定正确的 1达载体， R 酶，混合均匀， 25 孵育过夜。 含有目的片段的表达载体的获得：将 应产物经过转化 ，涂布在含有卡那霉素的 体平板上，经过菌落 切，鉴定得到阳性克隆。 基因植株的获得 化农杆菌 将用酒精消毒后的电击杯用流水冲洗数次，再用纯水润洗，晾干后置于冰上待用。用将含有目的片段的表达载体用超纯水稀释 10 倍；将农杆菌（ 受态细胞从 出至于冰上，待其融化后，加入 1释过的质粒，用枪头搅匀。将感受态细胞全 部加入电击杯中，用电转仪进行电击转化 。转化完成后迅速加入 1含抗生素的 体培养基 ， 28 孵育 2 小时。离心沉淀细胞，涂布在含有卡那霉素和庆大霉素的 体培养基上， 28 培养 48 小时左右。 通过菌落 定阳性克隆，并在 3有卡那霉素和庆大霉素的 体培养基中扩大培养过夜。取出一部分保存菌种（ 15 的甘油中）。另取 100入 50体 养基中， 28 培养过夜。 杆菌转染植株 将过夜培养的农杆菌离心收集沉淀，重悬于 50蔗糖溶液（使用前加入15面活性剂）。 将抽薹 后生长状态良好的拟南芥花序浸没入农杆菌悬浮液中30 秒，避光 12 小时后，移至正常光照条件下培养。为了提高转基因效率一般 基因植株鉴定 收集转基因后所得种子，为 ，将 种子经过抗性筛选得到转基因成功植株，此时还要通过基于 一步确定转基因是否成功。 兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 11 南芥基因组 速提取法 料与试剂 试剂： 、 丙醇、 70% 1 2 异丙醇 4 70% 方法步骤 1 取约 25 小的叶片于 中，加 250 l 磨。 2 （材料较多时选做） 18000 g 离心 5弃杂质沉淀，留上清液。 3 加 250 l 异丙醇，颠倒混匀。 4 18000 g 离心 5 5 弃上清， 70% 作冲洗，弃 6 10000 g 离心 5 s，将残留的液体收集至管底。 7 枪头吸去残留液体，室温下充分干燥沉淀（干燥必须彻底 ） 。 8 加 100 l 5 l 即可进行 分离植物基因组 材料和试剂 试剂： 0833）、 工， 0105）、 1 2% 温存储： 试剂 加入量（ 100 工作浓度 g 2%（ w/v） 试剂名称 母液浓度 工作浓度 1 M 200 250 （ 25 0 % 兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 12 g 1%（ w/v） M 10100 420mM up 00 2 1M 0 容至 200膜过滤除菌， 4存储。 3 4g，调 溶解， 00膜过滤除菌， 4存储。 4 氯仿 /异戊醇（ v/v： 24/1）。 法步骤 1 65预热 2% 2 取 1拟南芥叶片放入离心管，液氮速冻 10s，用烧好的枪头充分研磨成粉末； 3 加入 500L 2% 65水浴 20 10倒混匀 一下）； 4 加等体积氯仿 /异戊醇（ 24/1），轻缓地颠倒混匀，室温 18000g 离心 2 5 上清 450L 转至新离心管，加入 450L 异丙醇（ 冷效果更佳），颠倒混匀， 淀 20 18000g 离心 5 6 弃上清，加入 75%乙醇洗涤沉淀； 7 弃上清， 12000g 离心 30 s，吸去残留乙醇； 8 沉淀自然干燥，加入 50缓吹打混匀，溶解 9 期保存。 色质免疫共沉淀（ 料试剂 7 天龄 35S:基因幼苗 ，生长条件： 16 小时光照， 8 小时黑暗 体 100 g 解在 5醇中。（使用前加入溶液中） : 蔗糖 , 10 10 5 1 注意：在使用之前加入 : 蔗糖 , 10 10 1% 州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 13 5 1 : 蔗糖 , 10 2 5 1 50 10 1% 1 16.7 167 1.2 1 150 1% 2 20 500 1% 2 20 1% 1% 1 10 1% 意：新鲜配制，使用前加热至 65C) TE 10 1 010mg/4mg/ml 方法步骤 取材： 将拟南芥种子经春化后播种到土中。取 大小的整株植株作为实验材料。（要尽量保证植物上不沾有土和其他杂质） 甲醛交联： 1 将材料置于 50 心管中，用 40 ml 洗两次，尽量将水 吸干。 2 向离心管中加入 37 甲醛溶液没过材料，盖上戳有小孔的盖子，放入真空干燥器中抽真空 10 3 加入 2.5 M 甘氨酸终止交联，抽真空 5 4 打开盖子，移去上清，用 40 ml 洗材料两次，尽量将水吸干。并将植物材料放于两张吸水纸间，尽量将其表面的水吸干。（到这步，材料经过液氮速冻后冻存于 ） 染色质制备：（以下步骤都必须保证在低温下完成） 1 用液氮预冷研钵，将植物材料放入研钵中，加入少许液氮，研磨至粉末状（可加入 研磨更充分）。 2 用预冷的药匙将粉末转 移到 30冰上预冷的 中，涡旋混匀，放置 冰上至溶液均一。 3 将第 2 步所得到的抽提物用微量过滤器过滤到在冰上预冷的新的 50心兰州大学硕士研究生学位论文 拟南芥转录因子 光信号转导和生长素合成过程中起着重要作用 14 管中。 4 重复第 3 步。 5 将抽提物在 4C 以 4000 心 20 心倒去上清液，用 1 重悬沉淀，用枪头吹打均匀，转移到 中。 6 4C 以 13000 心 10上清，沉淀用 300 l 重悬，并吹打均匀。 7 取 300 l 于新的 中，用枪头吸取上一步中的溶液，小心加在其上。 8 4C 以 13000心 1h，与此同时，配置 10 20P 于 4C 预冷。 9 移去上清，沉淀用 200l 用前加入 4 l 50 悬，用枪头吹打均匀，并用漩涡混匀。取出 10 l 用琼脂糖凝胶检测。 10 按探索好的条件超声处理染色质材料。 11 4C 以 13000 心 10 上清转移到新的 中。 12 重复第 11 步。取 10 l 样品与第 9 步的样品用 脂糖凝胶分离。 免疫沉淀 : 1 将超声处理好的样品取出 20 l 于新