【毕业学位论文】（Word原稿）大麦矮秆及产量性状的QTL定位分析大麦种质资源硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大麦矮秆及产量性状的 位分析 I 摘 要 大麦是我国的第四大粮食作物，在国民经济生产发展中具有十分重要的地位。社会的发展和人们物质文化生活水平的提高要求培育出产量更高、品质更优、抗病性更强、适应性更广的大麦新品种，这就要求我们加强对种质资源遗传基础的研究，利用 图技术对其重要农艺性进行 图是一有效途径。目前，世界大麦 图研究与其 他作物如水稻、小麦和玉米相比，还存在很大差距，我国更是少有研究，这必将阻碍大麦育种和生产的发展。利用 图技术对大麦的株高及千粒重、穂粒数、穗长、穗密度等重要产量性状进行研究，具有十分重要的意义。 本研究 利用 以 矮秆材料 91 95皮 1 号、 印度矮生 和 白青稞 为回交亲本与高秆材料大粒麦杂交然后回交构建的 5 个 离 群体， 考查了其 田间农艺性状数据， 对其株高、穗长、千粒重、穗粒数和穗密度等性状进行了相关分析；利用 记对各个回交群体进行基因型分析，采用 数转换遗传 距离和件进行误差检验，构建了大麦 记框架连锁图，并对叶耳颜色、棱型、芒形和籽粒带壳性等质量性状进行了基因定位；采用 件的区间作图法和 件的复合区间作图法，对株高、穗长、千粒重、穗粒数和穗密度等性状的 要结果如下： 1. 5 个 性状的相关性分析结果表明：株高与穗长、千粒重、穗粒数呈正相关，而与穗密度呈负相关；穗长 与穂粒数、千粒重正相关，而 与穗密度呈负相关；穗密度和穂粒数与千粒重呈 负相关。 2. 利用群体的 记数据，构建了 5 个大麦 图群体的框架连锁图谱； 并将大麦的白色叶耳相关基因 位于 3H 染色体上，为 芒形相关基因 K、裸粒基因 n、 六 棱基因 3个质量基因分别 在 4H、 7H 和 2H 染色体上找到侧邻的 记 。 3. 复合区间作图法对 5 个性状的 析，共检测到 33 个 相关 括 10 个贡献率 30的 中有 3 个与株高相关，它们分别位于大麦的 3H、 4H 和 5H 染色体上；贡献率 30且 6 个，其中 2 个与株高相关， 1 个与 穂粒数相关，2 个与千粒重相关， 1 个与穗密度相关。 关键词 : 大麦 (.),回交群体， 遗传 连锁图 , 位 , 矮秆 .) is it is of of of to to of it is an to TL in is in of it is of to 000In 100015, C SR 1000as 1. a 1000a a 000a a 0002. C SR l on H SR H, n H H. 3. a .5 of 0 0% on H, 4H H 0% to to 000to .), BC 录 第一章 文献综述 . 1 量性状位点（ 图研究 . 1 图群体的选择 . 2 子标记的种类 . 3 量性状 位方法 . 5 麦 图研究进展 . 7 麦的分子标记遗传连锁图 . 7 麦重要农艺性状的 图研究进展 . 12 题意义及技术路线 . 13 题意义 . 13 术路线 . 14 第二章 大麦作图群体的培育及遗传连锁图谱的构建 . 15 料与方法 . 15 验材料 . 15 体田间数据的收集 . 15 记检测群体基因型 . 16 据统计 . 19 传图谱的构建方法 . 20 果与分析 . 20 1交群体的遗传连锁图谱 . 20 95交群体的遗传连锁图谱 . 20 皮 1 号回交群体的遗传连锁图谱 . 21 青稞和印度矮生回交群体的遗传连锁图谱 . 21 论 . 23 成标记定位差异的原因 . 23 量性状基因定位结果与前人结果的比较 . 23 第三章 不同作图群体的 锁分析 . 26 型数据分析 . 26 高分析 . 28 粒重分析 . 30 粒数分析 . 30 长分析 . 30 图群体的株高及产量构成因子之间的简单相关分析 . 32 用两种作图法的 析 . 33 1交群体 . 34 95 2639 回交群体 . 34 皮 1 号回交群体 . 35 度矮生回交群体和白青稞回交群体 . 35 结与讨论 . 41 第四章 全文结论 . 42 参考文献 . 43 致 谢 . 51 个人简历 . 52 V 英 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 量性状位点 记辅助选择 交 倍单倍体 重组自交系 近等基因系群体 渐渗系 代换系 制性酶切片段长度多态性 随机扩增多态性 简单重复序列 扩增片断长度多态性 单核苷酸多态性 插入缺失 标记分析法 间作图法 合区间作图法 合酶链式反应 二烷基硫酸钠 株高 穗长 000 千粒重 穂粒数 穗密度 摩 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 大麦（ H. .）属于禾本科（ 小麦族（ 大麦属（ 物， 是世界上最古老的粮食作物之一 。它适合广 泛的气候：从亚寒带到亚热带都能生长。由于它具有生育期短、早熟、抗逆性强和适应性广等优点，至今依旧是高寒、干旱和盐碱地区主要的粮食作物，在我国是仅次于水稻、玉米、小麦的第四大粮食作物，青藏高原地区的藏民当今仍然以裸大麦为主食。随着饲料和啤酒工业的兴起和发展，大麦早已成为饲料和酿造工业的重要原料，由于 其 蛋白质含量高于玉米，这就降低了合成饲料中蛋白质的添加量。如今世界上生产的大麦80被用作饲料，丹麦和荷兰等畜牧业发达的国家更是超过 90，其次酿造工业等约用去了 12，食用占 8左右。大麦营养丰富：高纤维、高抗氧 化成分、低脂肪、低糖，富含胆固醇生物合成抑制剂等（ et 1991; et 1991），其在医疗保健食品开发等方面也日益受到世界各国的重视。目前，大麦茶与大麦麦芽糖日益受到人们的青睐，一些关于大麦对健康潜在益处的研究仍在进行。建国以来，大麦在产量和品质等各方面都有了较大幅度的提高，特别是产量，平均亩产从 20 世纪 50 年代的 高到目前的 268加 （农业信息网）。这些都取决于育种家对大麦株高及重要产量性状的改良。社会的不断发展和人们生活 水平与质量的日益提高，对大麦的生产提出了更高的要求，需要我们培育出产量更高、品质更优、适应性更广、抗病虫性更强的新品种。但是，现代育种家正面临着亲本遗传基础狭窄的困境，要想取得育种的突破性进展，急需加强对遗传资源的引进及对其 农艺性状遗传基础的了解与掌握 。 作物的性状特征从整体上看可分为两类，即由单基因 （或寡基因） 控制的表现为非连续变异的质量性状和由多个基因控制的表现为连续变异的数量性状。作物的许多 重要 农艺性状，如产量、品质、 成熟期、 抗病性、抗逆性等 多 表现为数量性状。由于任何一个数量性状特征都是由基因组中的多 个基因和环境效应共同作用的结果， 经典的遗传分析方法已无法胜任此项研究 。随着分子生物学和生物统计技术的发展， 以分子遗传 连锁 图谱和各种统计模型为基础的数量性状位点（ 图技术 的出现 ，为数量性状遗传的研究 提供了有效的技术手段 。由于 大 麦基因组的复杂性，目前，人类 对其基因组 的了解与掌握程度远低于水稻和玉米等作物 。因此，利用 图技术，对 控制大 麦重要农艺性状 的 基因进行定位与作图尤 显 重要 ， 它不仅可以为分子标记辅助选择 （ 未来的分子设计育种(by 备 基因资源 ，也可以为 相关 基因的克隆 奠定 基础。 量性状位点（ 图研究 位的实质就是分析 遗传 标记与数量性状位点之间的连锁关系 ， 其主要做法是以标记基因型为分类依据把作图群体分成两组，比较两组间目标性状的差异显著性，以此推断该性状位点与标记位点的连锁关系。 图就是把 位的结果逐一定位到染色体的相 应 位置，并估算遗传效应 的大小 。 析的基本 步骤包括：分离群体的构建 ；分子标记连锁图的绘制；分离群体数量性状的考察和标记基因型的检测；标记基因型和数量性状值之间的相关性分析，确定染色体上的相对位置，并分析其效应的大小。 其中， 适 当 作图群体的构建 和 高密度遗传连锁图谱的绘制是进行 位作图的先决条件。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 图群体的选择 图群体 通常是 选 择 两个性状差异大、 血 缘关系较远的材料作亲本构建 而成 。 这些群体包括临时性作图群体如 体及其衍生家系、回交（ 体和永久性群体如加倍单倍体（ 体、重组自交 系（ 体及近等基因系群体（ ，这些群体在遗传连锁图构建过程中各有优缺点。 2 群体 体是由两亲本杂交后得到 ，再由其自交得到的群体。除自交不亲和外， 体极易配制，能够在较短的时间内获得较大的作图群体，提供的遗传变异也较为丰富，并可以同时估计加性和显性效应。 体的一个不足之处是存在杂合基因型，对于显性标记 ， 将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型。其另一个缺点是它的每 个株系都是唯一的，只能使用一代，不能设置重复试验，很难进行连续性分析。这些都限制了 体在 图中的使用。 交（ 体 体是由 与一亲本回交产生的群体。它的特点是与 常相近，也是一种使用较多的作图群体。 体的每一分离基因座只有两种基因型 ， 最能直接反映 配子的分离比例 ，因而其作图效率 最 高 ， 这也是它优于 体的地方。不足之处是 体所提供的材料有限。另外，对于一些人工杂交比较困难的植物， 体也不太适合。 倍单倍体（ 体 加倍 单倍体群体是将 植株的花药进行离体培养，诱导产生单倍体植株，再经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体， 体可以长期保存。 体包含了 子基因的分离和重组信息，有利于 精细定位。 体使用的限制因素在于产生 株的花药培养技术，花药培养的过程可能对不同基因型的花粉产生选择效应，破坏了群体的遗传结构，造成一定的偏分离现象，从而不同程度地影响了作图的准确性。同时熟练的组织培养技术也是构建 体的关键。 组自交系（ 体 体是 究中应用较为广泛的一种作 图群体，是杂种后代经过多代自交而产生。通常从 开始，采用单粒传的方法建立。多代自交使 因型相对纯合，染色体间重组几率加大，使其能更精确地定位紧密连锁的位点，因而作图的精确度较高。 体可以繁衍保存，有利于不同实验室的协同研究。 体的不足之处在于构建花费大、所需时间长，且不能估计显性效应。 等基因系（ 体 体是两亲本 杂种的其 他 后代与轮回亲本连续回交而成。该群体个体间遗传背景相似，只存在一个或几个 离，其他基因组区段与轮回亲本几乎相同。它能 消除遗传背景的干扰，以及主效 微效 掩盖作用，实现对 精细定位（ et 2006；et 2004; et 2006），是 离和基因克隆的理想群体。控制西红柿果实大小中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 的基因 et 2000）、控制水稻穗粒数的基因 et 2005）和控制水稻籽粒大小的基因 et 2006）等都是利用 体精细定位并克隆的。 渐 渗系（ 代换 系（ 典型的 体（ 2003）。但构建此类群体需要花费很长的时间，工作量也大。 子标记的种类 早在 1923 年， 试图利用形态标记来分析数量性状多基因间的连锁关系，但苦于标记的数量有限而未能系统研究。在随后的几十年间，科研工作者利用形态标记、细胞学标记和生化标记，为主要作物遗传图谱的构建 做 了大量的工作，但由于可用的标记数量少，多数作物都没 有 建立一个 完整的遗传图谱。 20 世纪 80 年代以后，随着 各类 分子标记的相继出现与发展，大大地促进了遗传图谱的构建 。与其他类型的标记相比，分子标记具有以下优点：直接以 形式表现，不受外界环境条件和个体发育阶段的影响；数量多，分布于整个基因组；多态性高，无需专门创造特殊的遗传材料；表现为“中性”，与不良性状无必然的连锁；一些分子标记表现为共显性，能鉴定纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。 目前，己有数十种 子标记技术被发展和利用（见表 它们主要分为三类：（ 1）以 交技术为基础的分子 标记，如限制性酶切片段长度多态性（ ；（ 2）以 术为基础的分子标记，如随机扩增多态性 简单重复序列（ 扩增片断长度多态性（ ；（ 3）以核酸测定序列为基础的分子标记，如单核 苷 酸多态性 （ 插入缺失（ 指由于基因组 制性内切酶识别位点序列内的点突变、插入、缺失、重排等所造成的限制性片段数目和长度的变异，这种差异可通过选择合适的 针，通过 交检测出来。 设想最早由 （ 1980）提出， 1987 年， 构建了第一张人的 谱。 最早被用于遗传连锁图构 建的分子标记，具有数量丰富、共显性、试验稳定性好等优点。该项技术的主要缺点是：标记多态性低； 求量大；操作程序复杂 ，工作量大；需要使用放射性同位素标记探针 ， 费用较高。 记是一种操作简单、快捷且成本经济的分子标记技术，由 导的研究小组于 1990 年同时分别建立起来。它是以随机的寡核苷酸 (一般 810引物，对基因组行非定点的扩增，从而获得 多态性。其具有以下特点：设计引物不需要知道 态性高，信息量大； 品需求量少；技术简单，安全性高；成本较低。但是，记一般是显性遗传 (极少数是共显性遗传的 )，不能鉴别杂合子和纯合子；只能区分分子量大小不同的片段，而不能区分碱基序列不同但大小相同的片段。同时， 术受反应条件的影响较大 ， 重复性较差 ， 实验结果很难在不同的实验室之间重复。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 表 要的分子标记技术 of 子标记 英文名称 以 分子标记 限制性酶切片段长度多态性 单链构象多态性 变性梯度凝胶电泳 以 基础的分子标记 随机扩增多态性 单链构象多态性 简单重复序列 锚定简单重复序列 相关序列扩增多态性 反转录转座子间扩多态性 反转录转座子插入多态性 序列标签位点 扩增片段长度多态性 酶解扩增多态性序列 特定序列扩增的多态性 选择性微卫星多态性 of 以核酸测定序列为基础的分子标记 单核甘酸多态性 插入缺失 称微卫星 是一种由 16 核苷酸为基本重复单位（被称之为基序， 成的长达几十个到上百个核苷酸的串联重复序列。广泛地分布于真核生物的基因组中。在不同材料中，同一个 点基本重复单位出现的次数可能不尽相同，因而存在着多态性。 端的序列多是相对保守的单拷贝序列，因此可以根据其两端的序列设计特异引物进行扩增，经电泳检测其多态性。 1970 年在寄生蟹基因组中最早被发现，到 20 世纪 90年代逐渐发展成为一种常用的分子标记。由于它具有多态性高、分布广泛、染色体特异性 、共显性遗传、灵敏度高、无放射性、操作简便、经济有效，重复率和可信度高等优点，具有其他分子标记，如 不具备的一些优越性，是进行遗传资源鉴定、重要农艺性状中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 5 基因的标记、遗传连锁图的构建、遗传多样性与比较基因组学研究的理想标记。 记技术的一个显著特点是其引物开发比较困难，因其设计是建立在基因组序列测定的基础上，并且需要上群体检测其有效性。但随着分子生物学发展和各种基因组测序工作的展开，大量基因组序列 ,特别是 列的释放，大大地促进了 记技术的发展，目前 是水稻、 小麦、玉米和大麦等作物研究中应用较多的一类分子标记。 由荷兰科学家 1993）发展的一种检测 态性的方法。它聚合了 优点，现已被广泛应用于多样性研究、遗传作图、基因定位等方面。其基本原理是选择扩增基因组 制酶切片段。方法是选用一种多切点限制性内切酶和一种寡切点限制性内切性酶，同时切割基因组 链酶切片段的粘性末端接上人工接头，作为 板，用由核心序列（与人工接头互补）、识别序列（与酶切位点互补）和选择序列组成的引 物选择性扩增成套的限制性酶切片段，进而检测其多态性。 术具有以下优点：标记数量丰富，覆盖整个生物基因组；提供的信息量大，每次可检测 50100 条谱带； 量少；假阳性率低，试验重复性好；引物具有通用性，可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。 不足之处在于：试验操作程序复杂、研究费用高；对 纯度和内切酶的质量要求较高；难以很快将 记定位到特定的染色体上；显性标记。 指个体间 列的单碱基变异 ,包括单个碱基的转换、颠换、插入、缺失等。其中颠 换的发生较少，而单个碱基置换的发生较多，它也是等位基因间序列差异最为普遍的类型。 非转录区的 多于转录区，而在转录区也是非同义突变 (有氨基酸序列的改变 )的频率比其他方式突变的频率低得多。这可能与表达序列承受较大的选择压力有关。与其他分子标记相比， 有以下显著特点 : 位点更丰富，例如水稻大约每 268有一个 具代表性；遗传稳定性更高；易实现分析的自动化，实现批量检测。因此， 有广阔的应用前景，被普遍认为是继第一代遗传标记 二代多态性标 记 后的第三代遗传标记。 发掘是建立在大量的基因组测序的基础上，研究费用较高。但是，由于 认为是一种能稳定遗传的早期突变，它的出现可能是许多基因产生突变的原因，因此受到越来越多研究者的关注。人类的许多疾病遗传被证实与 关，研究者期望构建高密度的 谱，用关联分析（ 的方法定位一批由多基因控制的疾病，如糖尿病、高血压、癌症等的主效基因（ 1997）。作物的重要农艺性状基因与 关系也开始受到研究者的重视。 量性状 位方法 随着分子标记技术的发展，许多作物己获得了高密度的分子标记连锁图谱，不断发展的生物统计方法也使得 图理论不断完善。自 20 世纪 80 年代以来，已经发展了 20 多种 位作图的方法，应用比较广泛的主要包括单标记作图法、区间作图法、复合区间作图法（ 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 6 1993）、混合线性模型的复合区间作图法 (1998)等。 标记分析法 （ 单标记分析法是基于加显模型，用方差分析、回归分析或似然比检验方法逐一看各 个分子标记与表型之间的关系，即根据分离群体标记基因型间的数量性状平均值的差异来分析确定该标记所在区域有无 存在显著差异 ， 则说明控制该数量性状的 标记连锁；否则，就不存在相关关系。单标记法不需要完整的分子标记连锁图谱，是早期 位多采用的方法。（ 1982）利用这种方法研究了番茄回交群体的 4 个数量性状，定位了 21 个 1988）用 12 个标记对一个 体中的 170 个单株进行研究，检测并定位了番茄 18 个数量性状的 85 个 单标记分析法存在许多缺点 (1989):（ 1）不能确定标记是与一个 锁还是与几个 锁； (2)无法确切估计 可能位置和效应；（ 3) 由于将遗传效应与重组率混合在一起，低估了 遗传效应； (4) 无法检测基因型与环境的互作；（ 5）容易出现假阳性；（ 6）检测效率不高 ， 所需个体数较多。 间作图法 （ 为了克服单标记分析法存在的问题， 1989）提出了基于两个侧邻标记的区间作图法。该方法采用正态混合分布 的最大似然函数和线性回归模型，借助于完整的分子标记连锁图谱，计算基因组的任一相邻标记之间的任一位置上存在 不存在 似然函数比值的对数（ ），并绘制 该染色体上是否存在的似然图谱，当 超过某一给定的阈值时， 可能位置可以用 持区间表示出来。 (1994 )利用区间作图法对水稻的一个重组自交系进行抗稻瘟病性定位分析，找到了 14 个与抗病性有关的 (1990)用这种方法在番茄上定位了 6 个与果实重量、 4 个与果实可溶性固型物和 5 个与果实 关的 与单标记分析法相比，区间作图法具有明显的优点： (1)能从支持区间推断 可能位置；(2)若是一条染色体上只存在一个 法可以实现对其位置和效应的近无偏估计； (3)测所需的个体数可以减少。因此，区间作图法一度成为 图的标准方法。区间作图法的缺点是定位的 间往往太宽，而一个性状在同一染色体上有多个 常常会标错 位置，产生幻影 同染色体 的互作会增加标记类别内的表型方差，降低发现 效能。同时，区间作图法每次只能检验两个标记，标记的信息利用率低 。 合区间作图法（ 为了解决区间作图法存在上述问题， 993)提出把多元线性回归与区间作图结合起来的复合区间作图法。该方法的要点是，对某一特定标记区间进行检测时，将与其 他 锁的标记也拟合在模型中以控制背景遗传效应，假定不存在上位性效应和基因型与环境的互作，用类似于区间作图的方法获得各参数的最大似然值，计算似然比，绘制各染色体的似然图谱，根据似然比统计量的显著性，获得 能位置的标记区间。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 7 复合区间作图法的主要 优点是： (1)采用 然图来显示 可能位置及显著程度，保留了区间作图法的优点（ 1994）； (2)一次只检验一个区间，把多个 多维搜索降低为一维搜索； (3)在不具有上位性和 环境互作的情况下，可以实现对 置和效应的无偏估计； (4)充分利用了整个基因组的标记信息； (5)以所选择的多个标记为条件，在较大程度上控制了背景遗传效应，提高了作图的精度和效率。复合区间作图法目前还存在一些有待解决的问题 :(1)不能分析上位性及 环境互作等复杂的遗传学问颗； (2)为了保证统计量有 一定的自由度，需要从大量的标记中筛选出一部分有用的标记，而筛选时采用的显著性水平以及筛选的方法均会对定位结果产生影响； (3)由于拟合在模型中的标记会吸收其附近的 应，复合区间作图法需要为检验的区间开辟一个窗口，窗口内的标记不能包括在模型中。但适合的窗口大小不易确定，过小，检验的效率会降低，过大，与区间连锁的 会使 置和效应的估计产生