【毕业学位论文】（Word原稿）糖皮质激素对肉仔鸡空肠葡萄糖吸收的影响与机理动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 糖皮质激素对肉仔鸡空肠 葡萄糖吸收的 影响与机理 on on I 摘 要 糖皮质激素是动物 在 应激条件下分泌的重要激素， 能使 动物 在 应激条件 下 对 营养物质 的 吸收发生 改变 ， 为了探讨应激 影响营养物质吸收的机理 ， 本研究通过三个试验研究了糖皮质激素类药物地塞米松对肉仔鸡空肠葡萄糖吸收的影 响及机理： 试验一： 糖皮质激素对肉仔鸡空肠刷状缘膜葡萄糖吸收的影响 利用刷状缘膜囊体外培养法和同位素示踪法研究了长期注射不同剂量糖皮质激素药物 地塞米松对肉仔鸡空肠粘膜葡萄糖吸收的影响，以探讨应激状态下 肉仔鸡 所分泌的 糖皮质激素对 空肠葡萄糖 吸收 的影响 及其调控机制。 24只体重相近的 21日龄 爱拔益加（ 肉仔鸡随机分为 4个处理 ，其中 3 个试验组分别连续 7 天经 腹部 皮下注射地塞米松生理盐水稀释液，剂量为每 11照组则注射等量的生理盐水。实验结束时取试鸡空肠制备刷状缘膜囊，在含有 3H 孵育，采样测定空肠对 3H果表明， （ 1）地塞米松显著抑制了肉仔鸡体增重（ (3)地塞米松 处理 显著降低了肉仔鸡空肠绒毛高度、吸收面积和绒毛高度 /隐窝深度的比值（ 本试验结果 表明 应激对肉仔鸡生长的抑制可能与糖皮质激素的释放 降低肠道绒毛高度、吸收面积及增加隐窝深度而损害了肠道的吸收功能有关。 试验三：糖皮质激素对肉仔鸡空肠葡萄糖转运载体 达的影响 本试验采用实时荧光定 量方法研究了长期注射糖皮质激素类药物地塞米松对肉仔鸡空肠上皮细胞钠葡萄糖共转运载体（ 葡萄糖易化转运载体（ 达的影响。试验选取 21 日龄体重相近的 仔鸡 24 只，随机分为 4 个处理 ，其中 3 个 处理 组每只腹部皮下注射地塞米松生理盐水注射液 1量分别 1 5mg/重 ），对照组注射等体积的生理盐水，连续 7 天。结果显示 与对照组相比，各 地塞米松 处理 组 表达量 显著 降低（ 注射 地塞米松 显著影响 了 肉仔鸡空肠 II 表达量（ 此 结果表明糖皮质激素可能通过 调节 录水平的表达而影响肉仔鸡空肠对葡萄糖吸收。 总之，从以上三个试验我们可以得出糖皮质激素抑制了肉仔鸡空肠对葡萄糖的吸收，并通过调节 肉仔鸡空肠粘膜形态 和 葡萄糖转运载体 录水平表达 这两个非特异和特 异性途径 来调节肉仔鸡空肠对 葡萄糖的吸收。 关键词 ： 肉仔鸡 ， 糖皮质激素 ， 空肠 ， 葡萄糖 ， 吸收 ， 调节 is a of by It of in s to of on of in of n to is in of of to of of a of on in of by 24 to 1 of of 1mg At of 3Hof in of as (1) of (3) of in of by be to of to of of in of on of to of of on a+in of 24 1 of of 1mg of ml of of of of mg/of in of by to we of in of in by V 目 录 第一章 文献综述 . 1 一 糖皮质激素的分泌及其生理作用 . 1 二 葡萄糖在动物肠道吸收调节的分子机制研究进展 . 2 1 葡萄糖转运载体的分类 . 2 2 葡萄糖吸收机制 . 3 3 目前较常用的几种葡萄糖吸收测定方法 . 4 4 葡萄 糖吸收调节的分子机制 . 5 5 调节肠道葡萄糖吸收的因素 . 7 6 结语 . 10 第二章 试验研究 . 11 试验一、糖皮质激素对肉仔鸡空肠刷状缘膜葡萄糖吸收的影响 . 11 1 材料与方法 . 11 2 结果与分析 . 13 3 讨论 . 18 4 小结 . 19 试验二、糖皮质激素对肉仔鸡空肠二糖酶活性及粘膜形态的影响 . 20 1 材料与方法 . 20 2 结果与分析 . 22 3 讨论 . 26 4 小结 . 27 试验三、糖皮质激素对肉仔鸡空肠葡萄糖转运载体 达的影响 . 28 1 材料与方法 . 28 2 结果与分析 . 31 3 讨论 . 34 4 小结 . 35 第三章 全文结论 . 37 1 主要结论 . 37 2 创新之处 . 37 3 有待进一步研究的问题 . 38 参考文献 . 39 附录 . 46 附录一 蛋白含量的测定 . 46 附录二 蔗糖酶和麦芽糖酶含量的测定 . 47 附录三 肉仔鸡 18 列 . 49 致谢 . 51 作者简历 . 52 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 钠葡萄糖共转运载体 萄糖易化转运载体 刷状缘膜囊 蛋白激酶 A 蛋白激酶 C 磷脂酰肌醇 酶 高血糖素样肽 岛素 样生长因子 磷酸腺苷 皮生长因子 Y 肽 转化生长因子 脑 肾上腺轴 苯甲基磺酰氟 糖核酸酶 氧核糖核酸酶 信使 脱氧核糖核酸 转录 T 环阈值 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一 章 文 献综述 小肠是动物吸收营养物质的主要器官，研究表明其形态与功能可以根据动物所处的环境和生理状态而表现出适应性的改变，对动物生长具有重要 调节作用 。肠道对营养物质吸收的调节包括非特异性调节和特异性调节，非特异性调节主要指通过调节肠道绒毛高度、隐窝深度、隐窝细胞迁移率等方式来调节肠道对营养物质的吸收，例如 1993）研究显示高温应激可以显著降低大鼠肠道吸收面积和单位吸收面积上营养物质的吸收量；特异性调节主要指通过调节营养物质特异的转运蛋白的活性与数量来调节营养物质的吸收，例如 （ 1999）研究表明日粮 浓度可以影响肠粘膜单位蛋白中 钠 葡萄糖转运载体 表达量进而改变肠道对葡萄糖的吸收 。 此外 研究显示，肠道特异性调节和非特异性调节受多种因素的影响，包括日粮、年龄、健康状态、各种激素及活性因子等。糖皮质激素是一种重要的应激激素， 在动物遭受应激时可大量分泌， 现代集约化的动物生产中，动物不可避免地会受到各种应激，给养殖行业造成重大损失， 因而 研究应激条件下所分泌的重要激素 糖皮质激素 对动物肠道营养物质吸收的影响及机理对揭示应激状态下肠道营养物质吸收调节的规律具有重要的指导意 义 。 一 糖皮质激素的分泌及 其 生理作用 糖皮质激素是一种重要的应激激素。研究表明，当动物受到应激时，动物机体将从行为反应、植物性神经系统、神经内分泌系统和免疫系统等方面发生生物防御反应。但是，由于现代集约化的饲养方式限制了动物的活动范围，而 且植物神经系统往往只影响特定的生物系统，且作用时间相对较短，因而在实际动物生产中所产生的影响较小。而 神经内分泌系 统由于其对动物机体的影响更为广泛更为持久，所以在动物应激时发挥着更为重要的作用 。应激状态下，最为大家熟悉和认可的神经内分泌反应之一，就是下丘脑垂体肾上腺（ 的激活，其激活最终导致肾上腺皮质类固醇激素的释放，即糖皮质激素的释放， 它 是由位于肾上腺皮质束状带和 网状带的细胞所分泌的， 在人类和大多数的哺乳动物中，皮质醇是最主要的糖皮质激素，而在啮齿类动物和禽类动物中，皮质酮则是主要的糖皮质激素。 目前，研究结果显示糖皮质激素的生理作用主要包括以下四个方面：（ 1）调节糖、脂肪 及 蛋白质代谢 ， 糖皮质激素可以加强肝糖元合成和糖原异生作用，限制骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取利用，促进组织蛋白和脂肪的分解，最终导致血液中单糖、氨基酸和 游离脂肪酸（ 浓度升高 ； （ 2）对某 些 组织 器官产生作用 ， 生理剂量的糖皮质激素是骨骼肌、心血管和神经系统等组织 器官正常活动所必需 的 ，缺乏可能使肌肉无力，心输出量降低，血管紧张性下降，红细胞数和血红蛋白含量减少，神经系统的兴奋性和反应能力下降，过量又会加速骨骼肌分解代谢，而引起组织消耗，心肌和血管平滑肌的兴奋性升高，神经系统活动加强；（ 3）参与应激反应，动员机体储备能量，增强机体对外部不良环境的适应能力；（ 4）糖皮质激素 具有抗炎抗免疫反应。 关于糖皮质激素对动物肠道营养物质吸收的影响 ，有 研究显示糖皮质激素对动物肠道功能具有重要的调节作用 ， 但是 报道 的结果并不一致。 1999）等对仔猪连续皮下注射糖皮质激素药物地塞米松 7 天 ，每天一次，每次 1mg/重 ，结果发现地塞米松通过增加蛋白质的代谢中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 而抑制了仔猪肠道的发育； 1971）等研究发现糖皮质激素药物可的松可以抑制大鼠肠道对钙离子的吸收， 2004）等 的 研究 也发现噪声应激引起的大鼠肠道葡萄糖吸收抑制与糖皮质激素分泌有关，并且利用糖皮质激素分泌抑制剂处理 大鼠 后 ,应激引起的葡萄糖吸收抑制作用消失，进一步证实了糖皮质激素的抑制吸收作用。与以上试验结果不同， 2006）研究 表明 幼 水貂 口服可的松 5mg/重，可以增强肠道顶膜水解酶的活性并促进葡萄糖及多种氨基酸的吸收，显示了糖皮质激素对肠道的正调节作用。相似地， D 2004）对人的研究发现 21天注射 糖皮质激素药物 天 9mg/重 ， 人回肠胆汁酸主动转运载体表达量提高，暗示了糖皮质激素具有促进回肠胆汁酸吸收的作用。 993)等对新生仔猪的研究发现可的松可以促进 剖腹产 仔猪 肠道钠、葡萄糖和免疫球蛋白的转运吸收。造成试验结果不一致的原因可能有以下几个：第一，动物所处 的生理阶段不同，一些处于幼龄，一些则以成年动物为试验动物；第二，所使用的糖皮质激素药物不同，虽然地塞米松、可的松及 属于糖皮质激素类药物，但药物作用的有效时间及作用方式不同，可能造成实验结果的不一致；第三，以上试验有的采用药物短期处理方式，有的采用长期处理方式，可能因药物作用时间的不同，导致试验结果产生差异；第四，可能与所研究的营养物质不同 有关，即在糖皮质激素处理下，各种营养物质的吸收并不是发生抑制的改变。总之，糖皮质激素对营养物质在肠道吸收的影响并没有一致的结论。在家禽上所做的 相关 研究 很 少，家禽，尤其是鸡，极易受到环境应激导致糖皮质激素的释放，因而研究糖皮质激素对肉仔鸡肠道葡萄糖吸收的影响及机理，对了解家禽在应激状态下发生的营养物质吸收改变的规律具有重要意义。 二 葡萄糖在动物肠道吸收调节的分子机制研究进展 单糖尤其是葡萄糖是动物体内不可缺少的营养物质，在单胃动物，其主要来源于肠道的吸收，而在反刍动物除极少量来源于肠道吸收外，主要由糖异生途径产生，然而无论是在单胃动物还是在反刍动物，它都在动物机体细胞代谢过程中发挥着重要作用。 可溶性碳水化合物营养在非反刍动物主要就是指葡萄糖的营养，可溶性 碳水化合物在消化道内经过一系列物理、化学消化 方式 消化后最终分解为单糖，其中 0，而 经典的依赖于钠离子电化学梯度驱动的肠道葡萄糖主动吸收机制被确立之前，人们已经发现动物在受到外源或内源因素影响后，肠道有一定程度地自动调整营养物质如葡萄糖等吸收的作用，而在依赖钠离子的 导的葡萄糖吸收机制被提出并被确立以后，关于肠道葡萄糖吸收调节机制的研究则更成为国内外营养学家所研究的热点。 1 葡萄糖转运载体的分类 体内葡萄糖转运载体主要分为两类，一 类是不依赖于钠离子的易化转运载体（ 族，根据其分布及与葡萄糖亲和力的不同将其分为 种，其分布具有明显的组织特异性： 要分布于红细胞膜； 要分布于肝脏、胰腺细胞及肾脏和小肠上皮细胞的基底侧； 脑组织分布较多； 胰岛素反应 敏感，主要分布于肌肉、脂肪等组织内； 要分布于肠上皮细胞刷状缘，作用主要 是 参与肠道果糖的转运； 于机体所有组织但量很小； 主要集中在肝细胞内网状体膜上。另一类是依赖于钠离子的主动中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 转运载体（ 族，也是本文主要讨论的载体，其包括 个成员， 次分布于肾小管上皮细胞，作用主要是介导葡萄糖和半乳糖跨膜吸收； 少量分布于肠上皮 细胞刷状缘膜 外，主要分布于肾小管上皮细胞，主要作用是介导葡萄糖在肾小管的重吸收。 2 葡萄糖吸收机制 萄糖吸收机制的提出 1958 年， 究发现猪肠道葡萄糖吸收依赖于钠离子， 此提出了现在经典的葡萄糖跨膜假说，他提出葡萄糖跨肠上皮细胞膜转运的驱动力主要来源于跨膜钠 离子电化学梯度，后来的研究证明肠道葡萄糖吸收主要由位于肠上皮细胞刷状缘膜上的载体 介导，并依赖于跨膜钠离子梯度 (， 1992； 1993)，而这一跨膜梯度则主要是由位于肠上皮细胞基底膜上的钠钾 来维持 （ ， 1992） ，葡萄糖由肠上皮细胞进入血液中则主要是由位于基底膜上的易化转运载体 介导。在此基础上 （ 1993） 研究表明 转运 1葡萄糖需要 2钠离子，在钠钾 作用下胞内钠离子浓度约为 10外浓度约为 140见，肠道葡萄糖跨膜吸收主要涉及到 钠钾 三个蛋白。 转运过程见 图 1 结构及生物学特性 一个高亲和力的肠道葡萄糖主动转运载体。 1987 年， 首次克隆出兔的接着人 （ ， 1989） 、绵羊 （ ， 1995） 等物种的 相继克隆，于 2000 年完成了鸡 分氨基酸和 测序工作。细胞膜上不同物质的转运载体具有一定同源性，例如 钠依 赖的核苷转运载体有 64同源性 （ ，1989） ，这可能暗示 50 多种 赖的物质转运载体是一个超基因家族。不同物种的 有较大同源性，兔和人 别编码 662 和 664 个氨基酸（约 73两个蛋白氨基酸同源性达 94，其中 84的氨基酸序列完全一致 （ ， 1992）。 鸡 人、兔、绵中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 羊及鼠 比同源性在 84 88之间 （ ， 2000） 。在结构上， (1996)研究显示， 有 14 个跨膜 螺旋，其中 个疏水螺旋分别位于从 和第 12 个螺旋上。 如图 1可以转运葡萄糖外还可转运半乳糖、 葡萄糖和 3转运能力 为 葡萄糖 葡萄糖 半乳糖 3外， 转运作用可以被根皮苷特异性抑制， 所以 根皮苷常被用来研究 性。 3 目前较常用的几种葡萄糖吸收测定方法 据 人所开发出来 的电压钳原理所设计出的专门用于研究上皮组织电生理属性的仪器，这一仪器使得研究跨膜离子转运，无论主动和被动转运都变 得简单易行，现在这一仪器也被用来研究单层培养细胞的离子转运属性 ，其原理是在两个有机玻璃制成的小室之间置一片上皮组织（例 如 肠上皮粘膜、动物皮膜及单层培养细胞等）作为隔膜，利用电压钳钳制膜两侧电压，通过检测连于两室的回路电流（称为短路电流）或通过同位素来研究物质在两室之间跨膜转运过程。其中两室内液体的构成、浓度以及温度等都应根据具体需要加以灵活和严格控制。此方法因其简便 快捷 且测量值以单位时间内单位面积 粘膜的转运量计 算更为准确，而成为目前国 内 外使用较多的一种研究物质跨膜转运的方法。 1998 年， 2002 年， 利用 法 研究表明 激了 新西兰白兔 空肠 粘膜 葡萄糖转运，且此过程涉及到 作用 。 于 2005 年用此方法研究了 因敲除后，糖皮质激素对鼠肠道葡萄糖吸收的影响；可见这一装置已被广泛用来研究各种因素对肠道葡萄糖、氨基酸、及钠、钙 等营养物质肠道跨膜吸收的影响。 状缘膜囊法 刷状缘膜囊（ 是指通过一定方法（目前较常用的是 淀法）来提取肠上皮中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 细胞顶膜，然后在特定缓冲液中重新环化为球状的膜囊， 于是 在球状膜囊表面均匀分布着一些营养物质的转运载体，例如 钠葡萄糖共转运载体 、氨基酸转运载体及二肽转运载体等，利用此膜囊可以研究这些载体的动力学特性和这些载体介导的营养物质转运的调节情况 ， （ 1970）、（ 1980）、 1981）都 对此方法有详细报道。 (1997)和（ 1999） 分别用此方法研究了发育和高钠低钠日粮对肠道葡萄糖吸收的影响。此方法是研究转运载体动力学特性常用的方法，且由于膜囊排除了代谢对转运测定的干扰，所以测量值相对更为精确，但是 提取及之后的葡萄糖测定步骤较为繁琐，不如 快捷。 翻肠囊法 外翻肠囊法根据外翻后的肠囊是否结扎可将其分为两种：一种为结扎肠囊法，将外翻的肠囊中注入一定液体（囊内液），然后置于孵育液（囊外液）中孵育，一段时间后，取囊内囊外液分别测定待测物质含量变化， 以此评定物质转运量， (2004)和林成招 (2005)等分别用此方法研究了 导的葡萄糖吸收中的作用及大豆黄酮对大鼠肠上皮细胞葡萄糖氨基酸吸收的影响；另一种为非结扎外翻肠囊法，将肠囊外翻并裱于特定棒上，再置于含同位素的孵育液中孵育，在物质未透过浆膜之前取出，测定肠上同位素的量以确定营养物质的转运量， (1996)用此方法研究了鸡小肠和大肠葡萄糖吸收的动力学特性，两种方法以单位肠道湿重为基础且未考虑代谢对物质转运的影响，因而定量准确性较低，但是相比之下前一种方 法更为常用。 外肠环法 体外肠环法也是使用较早的一种研究营养物质转运的方法， 1994） 对此方法有详细介绍。大致过程是先将一肠段从体内取出，将含有待测物质的液体灌入肠腔内后，放入培养液内培养，然后取不同时间的肠腔液，测定营养物质消失量，以此确定营养物质转运量， （ 1933） 用此方法研究了氨基酸的吸收特点。此法现在使用较少。 以上四种方法均为体外试验法，此外研究葡萄糖吸收的体外试验法还有单个细胞法，由于此种方法需要选择性分离肠上皮细胞并进行净化以获得纯净的上皮 细胞群，观察单个细胞对营养物质的转运情况，技术难度较大因而使用较少。体外试验法因为其普遍 未 考虑代谢对吸收的影响及分离的小肠处于非正常生理状况下等缺点，研究者也尝试多种体内研究方法，例如小肠插管法、肠袢法和静脉套管取血法等，但由于其操作复杂等原因，目前体外法依然是研究葡萄糖等物质肠道吸收的主要方法。 4 葡萄糖吸收调节的分子机制 节肠上皮细胞 录和翻译 水平上 的表达 大量研究表明 导的肠道葡萄糖吸收调节涉及到 蛋白的从头合成。反刍动物由于其独特生理特性，成为研究 葡萄糖吸收调节机制的一种重要的动物模型，羊小肠正常情况下由于肠腔中没有葡萄糖，因而不表达 白和 是肠腔灌注葡萄糖明显中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 增加了 性和蛋白含量， 量增加相对较少，暗示日粮可能在翻译和转录水平调节葡萄糖吸收。 （ 1998） 以 细胞 模型研究甲状腺素 （ 对 调节，结果表明， 可 代谢葡萄糖存在条件下，可以在转录和翻译两个水平增加 达，在非代谢葡萄糖（如 在条件下，不发生此现象。此外，葡萄糖吸收具有特有的昼夜规律，其在 下午最高，晚上最低，葡萄糖吸收的昼夜周期变化同时伴随着 蛋白含量的昼夜周期变化，表明葡萄糖吸收的昼夜规律是在转录和翻译水平上调节的 （ ，1998） 。 节肠上皮细胞顶 膜 细 胞内 的转移 近来也有较多研究显示， 导的葡萄糖吸收的调节，较多是发生在翻译后水平，是位于上皮细胞内小室上的 刷状缘膜上 间转移的结果。在 1996 年 人用爪蛙卵母细胞研究 达调节时发现蛋白激酶引起的卵母细胞葡萄糖吸收改变伴随着刷状缘膜上 量和刷状缘膜面积的相应改变，据此他们得出结论，蛋白激酶引起的 导的葡萄糖吸收的调节主要是由于胞吞和胞吐作用引起的，即由胞内小室 刷状缘膜间的转移所引起。 997)研究 性调节的结果表明 顶膜转移有关，当用布雷菲得菌素（一种特异的阻断蛋白跨高尔基体向膜上转移的抑制剂）作用于小肠后， 葡萄糖吸收增加的作用消失。而 (2004)发现 于上皮细胞内内 涵体上，用蜂毒肽（一种增强顶膜胞吞作用的药物）作用于 胞发现其促使大量刷状缘膜上 胞内内涵体上转移，钠依赖的甲基葡萄糖的吸收与对照组相比减少了 60。这些结果均表明刷状缘膜 胞内 的转移在导的葡萄糖吸收调节过程中发挥了重要的作用。 节肠上皮细胞基底膜 顶膜 上 转移 有研究显示，高 浓度 葡萄糖可以刺激肠上皮细胞基底膜上的 顶膜转移，参与葡萄糖吸收转运。 体的 8底物浓度达到 30， 基本被饱和，与之相比易化载体 使在葡萄糖浓度达到 100未显示被饱和。而餐后尽管肠道内含物葡萄糖平均浓度在 16高 48， 1990)，刷状缘附近葡萄糖浓度则高达 3001993） ，有研究显示，