【毕业学位论文】（Word原稿）拟南芥SLO基因启动子区重要顺式调控元件的鉴定植物分子生物学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 拟南芥 因启动子区重要顺式调控元件的鉴定 o. 摘 要 糖作为信号分子可以与植物激素（如乙烯、 胞分裂素）相互作用。近年来，在拟南芥糖信号突变体的遗传学和分子生物学研究中发现了糖和植物激素信号传导途径之间存在复杂的相互作用和联系，这些突变体除了对糖的应答反应发生了改变之外，其表型也与 烯信号传导突变体的 表型非常相似。 本实验室获得了一个拟南芥隐性突变体 突变体在叶片伸展、开花和衰老等不同发育阶段都表现为延迟；同时对 乙烯具有部分抗性 ，而对 糖表现超敏感。利用图位克隆法分离了 因，发现该基因编码一个功能未知的 白。多方面的研究结果显示， 因同时参与了糖、 及乙烯的信号传导。 为了解 因启动子的时空表达模式，以及鉴定该启动子区内部可能的重要顺式调控元件，本实验通过对 因的启动子进行缺失分析 (获得一系列缺失启动子，将缺失启动子与 告基因融合，通过农杆菌介导的遗传转化获得一系列转基因植株，然后用包括糖在内的不同信号分子对转基因植物进行处理，通过 色，初步确定 因启动子区一些重要顺式调控元件的位置： 糖反应调控元件位于基因上游启动子区 549 268性和定量实验表明：在暗培养条件下生长 5 天的幼苗 色主要表现在胚轴和根尖分生区部位，糖上调 表达 , 调其表达； 糖同时处理， 表达低于只用糖处理，但高于只用 理。在正常条件下生长 40 天的植株， 因在成熟花的花丝和叶柄中表达强烈，在茎中也有比较高的表达，而在叶中表达微弱，在根中未发现其表达。 上述结果表明， 因启动子区糖反应调控元件位于 启动子区 549 268糖特异诱导基因的表达起关键作用。 因的表达同时受到糖和乙烯的调控，而且乙烯可以拮抗糖对 因的诱导表达。在成熟的拟南芥中， 茎、花（成熟）和叶柄中表达 水平较高 ， 与幼苗期的表达模式明显不同， 说明 因 的表达受到植物生长发育的调控。 关键词： 因，启动子， 激素 信号传导，顺式调控元件 ，糖反应调控元件 s a on in to of BA/We in as on to to as We LO by a of LO is in To LO in we a of a ol of on S We in US CC BA US CC CC 0in of as of We 549 268bp LO LO 549 268bp of in LO is by LO US in of in LO is 录 摘 要 I 目 录 . 第一章 引言 . 1 1 糖信号感应和信号传导 .信号分子 1 物的多重糖信号感应机制 2 信号传导的遗传分析 3 2 乙烯信号传导系统 .烯信号传导途径的模型 4 烯信号信号感应和传导的可能机制 4 3 功能及信号传导 . 5 4 糖信号与激素信号间的网络机制 . 植物基因表达的转录调控 .物启动子的结构特征 7 素诱导表达启动子 8 动子的研究方法 . 因 的研究现状及意义 12 V 7 实验设计 .因 表达模式的确立 . .游表达调控元件的鉴定 .二章 因缺失启动 子的构建 16 1 材料与方法 . 16 料 . 16 法 . 16 2 结果与分析 .动子缺失分析 . 21 物 表达载体的构建 . 24 第三章 缺失启动子转基因植株的获得及鉴定 . 27 1 材料与 方法 .料 . 27 法 . 27 2 结果与分析 . .杆菌转化 . 32 南芥转化 . 33 性转基因植株的 定 34 失启动子转基因植株的 织化学染色 34 第四章 因表达模式的确立 . 36 1 材料与方法 .料 . 36 法 . 36 2 结果与分析 . 42 化子的 色 . 42 化子的 光定量 . 44 验 . 44 第五章 结果与讨论 46 参考文献 48 致 谢 56 作者简历 57 要 缩略 语 表 b: S: 1 6 4B: 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 1 第一章 引 言 植物激素是一些在植物体内合成，对其生长发育产生调控作用的微量有机物。植物激素几乎参与了植物生长发育过程中所有的生理过程 ： 从细胞的生长、分裂和分化，到种子休眠、果实发育、性别分化和衰老及抗逆性等。 植物的生长和发育调控是一个错综复杂的网络，不同信号途径对激素、新陈代谢和外界因素胁迫刺激的应答 具有 高度协调 性 。 大量的生理学和遗传学证据表明，在植物应答和不同信号刺激之间存在相互影响，某一个基因突变可以同时影响植物对一种以上激素的应答。 糖 也是一种信号分子，可以与植物激素（如：乙烯 、 细胞分裂素）相互作用。近年来，在拟南芥糖信号突变体遗传 学 和分子生物学研究中 出人意料地 发现，糖和植物激素信号间存在 对话(一 些突变体除对糖的应答发生改变之外，其表型与 烯生物合成途径或信号传导途径突变体的表型也非常相似。例如， 拟南芥 ） 突变体中子叶 和胚的发育 对 葡萄糖 不敏感 ， 这与野生型植物被乙烯前体 理后的表型或者组成型乙烯突变 )表型相一致， 然而，乙烯不敏感突变体 )却 表现为葡萄糖超敏感性。种子特异的 应转录因子 ）的葡萄糖诱导 表达 在葡萄糖不敏感的突变体 ） 中被消除，表明 能与葡萄糖和种子特异的 号传导都有关。 表达 都受 到 包括葡萄糖 、 渗透压 、内的多种 信号的 调控 （ J. et 2001） 。 1 糖信号感应和信号传导 糖是植物生长发育和基因表达的重要调节因子，它不仅是能量来源和结构物质，而且在信号传导中具有类似激素的初级信使作用 (et 2001)。糖信号感应 和糖信号传导在植物的整个生命周期中调控其生长和发育。在种子萌发和幼苗 发育早期，糖可抑制营养成分的转运 、下胚轴伸长、子叶变绿和子叶伸展（ 2000; et 2000）。糖可调控植物的开花 周期 ， 且对 花 形态建成等方面 具有 不同程度的影响 ，这依赖 于糖的浓度、植物的营养生长阶段和遗传背景（ et 1998; et 1998; et 1999; et 2001）。此外，糖信号还可调控叶片的衰老及植株的防御反应（ et 2001; et 2002）。 信号分子 以往认为，糖对代谢、生长、发育、胁迫和基因表达的调节是糖代谢的结果。然而，用 不能代谢或部分代谢的己糖或己糖和蔗糖类似物来研究糖对基因表达的调控 作用发现，特异的信号感应和传导不需要通过糖的分解代谢来 实 现 (et 1994; 1994; et 2001)，也就是说，糖 分子本身 在植物的生长、发育、成熟和衰老等许多过程中具有调控作用(1996; et 2000)。 从理论上讲，任何一种中性糖分子或糖酵解的中间代谢物都具有信号功能 (et 2000)，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 2 然而事实并非如此。蔗糖是植物体碳水化合物运输的主要形式，并且常被用来研究糖对植物生 长发育和基因表达的调控作用 (1996)，但是在大多数情况下，蔗糖的这种作用可完全被己糖（例如果糖和葡萄糖）所替代。例如，蔗糖对光合基因表达的抑制作用可通过低浓度的己糖实现 (1994; et 1997)；在玉米原生质体中，葡萄糖和果糖比蔗糖作为信号分子能更有效地抑制光合相关基因 的 表达 (1996)。由此说明，许多情况下蔗糖并不是直接的信号分子。故一些作者认为，葡萄糖和果糖可能是直接的信号分子，而蔗糖在行使信号功能前已经转化成己糖 (1994; 1997)。 物的多重糖信号感应机制 为了激活信号传导途径，糖首先要作为 信号 分子被植物细胞识别和 感应，然而，糖作为营养成分和信号分子的双重功能使得相关研究变得非常困难。大量事实证明，植物存在多重糖信号感应机制 ，在植物细胞中存在多个糖信号感应位点 （图 1 1） (1997;1997; et 1999; et 1999; 2000; 2000; 2001; et 2002)。 图 1 1 植物细胞中可能的糖信号感应位点 （ . et 2002, 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 3 糖信号感应和己糖激酶 (作用 己糖激酶 (糖酵解中的一个关键酶，其功能是催化己糖磷酸化。近来有证据表明 ， 使细胞间糖信号被感应，从而触发糖信号传递。 具催化功能和调节功能，且这两种功能是非偶联的 (999; et 2000;et 2001)。 支持这一观点的证据主要来自两方面的实验结果：一是用糖类似物（非生理性糖）所做的实验，二是 et 2001)。用糖类似物所做的实验表明 , 只有可作为 如甘露糖和 2被 抑制光合基因的表达，而 6能被 糖酵解的中间代谢物均无此效果 (1994)。而通过电渗法将 6明启动糖信号的是己糖磷酸化的过程而非磷酸化的糖本身 (et 2001)。同时， 1994)。 应用转基因的方法为 前，已从拟南芥中克隆出了两个 酵母 然该酶的催化活性有显著提高。由此说明， et 1997)。目前已在酵母中分离得到 et 1999; 2001)。 植物不仅存在依赖 存在不依赖 1997; 1998; et 1999)。 2000)系统研究了 为植物体内存在 3种不同的葡萄糖信号传导途径：依赖 赖糖酵解的途径和不依赖 液泡中表达转化酶基因的转基因烟草的系统获得抗性的诱导和光合基因表达的抑制实验表明：己糖信号感应可能包括一些未知途径 (1999)。 糖信号感应 由于植物中的蔗糖易水解成葡萄糖和果糖，所以对蔗糖特异的信号传导途径的解 析较困难(2001)。然而，最近的实验表明，因植物存在蔗糖特异的信号传导途径从而影响基因的转录和翻译。例如，蔗糖能够特异性地诱导 2000)。1998)首次证明，蔗糖能特异地对蔗糖同向转运体（ 转录和翻译进行调节，而己糖等其他糖则不具备此调节作用。不仅如此，蔗糖还特异性地抑制拟南芥 et 1998)。又如马铃薯细胞中蔗糖合成酶 基因的表达只能被蔗糖诱导，而不能被葡萄糖诱导 (Fu 1995)，且这种诱导需要 活性，因为反义 et 1998)。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 4 蔗糖在植物体中也具有信号功能。目前已在植物中发现特异的蔗糖感受器 et 1999; et 2000)，但也有报道认为， et 2000)。因此，需要更多的 令 人信服的证据来阐明植物蔗糖信号感应的本质。 使用非生理性的二碳糖在大麦上的实验表明，植物存在独特的二碳糖信号感应机制 (et 2000)。除蔗糖外，另外一些二碳糖（例如乳糖等）均可抑制 们的信号感应机制不同于葡萄糖，主要是影响 态和生理分析发现，它们在大麦胚胎中不能参加代谢，因此否定了其代谢的下游成分参与信号感应的可能性 (et 2000; 2001)。 信号传导的遗传分析 对模式植物拟南芥进行遗传分析，为植物糖信号感应和糖信号传导的研究提供了独特的分析方法。根据种子萌发和幼苗形成期糖调控的基因表达模式，以及对糖敏感性的不同，已经从拟南芥中分离出许多糖信号传导突变体，如糖不敏感突变体和糖敏感突变体 (et 2000; et 2001; et 2001; 2002)。拟南芥葡萄糖不敏感突变体 )的分离为 的直接联系提供了遗传证据。同时，通过对该突变体的表型及遗传分析揭示了糖信号和激素信号间的相互作用（ et 1995）。 许多独立分离的糖不敏感突变体都属于等位基因，说明植物糖响应具有保守性 (et 2002)。例如，葡萄糖不敏感突变体 ） 和 )为等位基因， )、 )和 et 1999; 2000; 2000; et 2001)。 总之，迄今关于植物糖信号传导的遗传分析主要集中在对模式植物拟南芥糖响应突变体的筛选和分离上。主要方法是通过培养基中添加高浓度或低浓度的糖进行处理，观察种子在该培养基上萌发及成苗状况，以此筛选出对糖敏感或不敏感的植株（ 2003），该方法的局限性在于，只有在这一阶段表达相关基因的植株才能 被筛选，而其他在种子形成期或萌发早期的糖响应突变体则不容易从野生型植株中筛选出来，由此推断一些重要的糖响应突变体可能未被发现。而且，到目前为止，除 )突变体外 (et 1998)，许多对葡萄糖或蔗糖高度敏感的突变体还没有详细研究。对拟南芥糖不敏感和高度敏感突变体进一步的表型分析及相关基因的分子克隆有望揭示新的糖调控机制。 2 乙烯信号传导系统 气态激素乙烯在植物的生理过程中起着重要作用，包括种子萌发、器官衰老、 器官脱落、果实成熟和形态建成的应答也包括对生物逆境的反应。 乙烯是所有植物激素中结构最简单的一种，它对植物的代谢调节可贯串其整个生活周期。作为信号物质，它的生物合成主要由 成酶和化酶调控。通过对拟南芥中一系列乙烯反应突变体的分析，人们掌握了很多在乙烯信号转导中发挥作用的基因。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 5 烯信号传导途径的模型 烯 信号感应和传导的可能机制 烯与 白的相互作用 已有充分的证据说明 植物中的一个乙烯受体。遗传分析 提供的证据表明 ， 用于对乙烯信号传导有影响的其它基因位点的上游。 发现 ， 变体植株 的饱和结合乙烯的能力只有 野生型的 1/5。 细菌中感应蛋白的类似性说明 作为乙烯信号感应蛋白 ， 但是 其氨基酸序列并没有显示出任何可与乙烯结合的明显 特征。为确定 否直接与乙烯作用 ，科学家 在酵母中表达 了 白， 并使酵母细胞获得了 乙烯 高亲和性 结合位点。对 白的突变体分析表明， 变消除了转基因酵母 细胞 的乙烯结合 能 力，这与 合乙烯能力 的 下降是一致的， 从而解释了 突变 体 植株为什么对乙烯不敏感。 烯受体向下游组分传导信号的可能机制 尽管目前尚未有直接的生物化学证据表明， 白的激酶区域传导乙烯信号采用细菌两组分系统同样的机制，但 这些系统的序列同源性完全表明了采用同样机制的可能性。按图 1 2 基因表达调控中的乙烯应答途径模型 in of (et 2004在分离拟南芥突变体过程中获得的两 类乙烯突变体 ，既 乙烯不敏感型和乙烯诱导的组成表达型 ， 它们都对 植物生命周期中大范围的乙烯作用 具有 影响 。表明 ， 这些乙烯作用拥有一个共同的初始 信号传导途径。在这条途径中有证据表明 ， 因编码一个乙烯受体 ， 作为乙烯信号传导途径中的最初受体。这个受体是一个膜结合蛋白 ， 与细菌的两组分调节因子 酶具有同源性。另外 ， 因位点的突变体对乙烯完全不敏感。双突变体分析表明 ， 一个下游基因是 码一个与酶同源的蛋白质 ， 点的突变导致乙烯调节的途径组成型激活 ，乙烯信号传导途径的负调节因子 ，其 下游基因是 因位点的突变体亦对乙烯完全不敏感。 最近，乙烯信号传导途径中的一些新成员也已经发 现 ， 基于上述这些发现 ， (2004)提出了 如下 乙烯信号传导途径的新 模型 (图 1 2)： 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 6 照细菌的乙烯信号传导系统推测，我们应当能发现一种应答调节蛋白作为 酶的基质。但是拟南芥信号传导的基因分析表明，在 已鉴定出的下游相邻组分 间未发现这样的应答调节蛋白。可能是进行突变体基因筛选过程中遗失了 这种蛋白 ;也可能根本不存在这种蛋白，乙烯受体通过其它机制传导其信号。 3 功能及信号传导 脱落酸 (是调节植物生长发育的一种激素，起初人们认为 一种生长抑制物质，现在发现它参与植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟以及逆境胁迫等许多方面，其作用机制也逐渐被认识。 在种子发育过程中 ， 责贮存蛋白的积累与种子脱水期组织的存活。在种子发育期及成熟后， 责种子萌发的调节作用，既可阻止种子萌发，也可诱导种子休眠。在种子自身萌发过程中 ， 抵消赤霉素（ 导水解酶的作用。在种子 发育过程中， 诱导种子分化，促进胚的发育。在种子成熟过程中， 作用与胁迫反应（如对脱水作用的保护）相关。除了对这种内源胁迫反应中的作用外， 参与植物对外源胁迫（如干旱或水胁迫、低温胁迫及盐胁迫）中的反应。此外， 促进叶、花、果的脱落，诱导芽和块茎的休眠，调节气孔的关闭以阻止过量水分损失，也可诱导几个参与保护脱水损害（如醛糖还原酶因的表达。 拟南芥 敏感突变体 ） 、 ） 和 ）的 种子休眠程度 均 显著 降低，其中 响种子发育过程，但不影响蒸腾过程；而 了降低种子休眠程度外，并不影响种子发育， 但能够 加强叶片蒸腾，导致植物萎蔫。因此认为， 因产物主要在种子发育阶段发挥作用，而 营养生长阶段发挥作用。 因已通过图位克隆法得到分离，编码种子特异性的 介导 应 的转录因子 。 在植物中， 冻、盐胁迫等环境胁迫能导致一系列高度保守的 些基因产物的积 累能保护植物免受胁迫伤害。其中一些基因也在胚胎形成和种子发育过程中表达，也可能与种子脱水和休眠有关。已发现了几个控制这些胁迫诱导基因 的顺式反应元件和反式作用因子，但控制胁迫信号传导的分子机制仍未阐 明。据推测， 启动子和绿色荧光蛋白 (合，构建成融合基因 (用电激法将带有该基因的质粒 种 赖蛋白质激酶 (代替胁迫信号 ，激活 导绿色荧光蛋白的表达。 成型的活化蛋白磷酸化酶 2能抑制激素 当受到逆境胁迫时，植物组织大量产生应激激素 导 此 4 糖信号与激素信号间的网络机制 植物糖信号传导途径并不是独立存在的，而是植物复杂的信号网络中的一部分 (国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 7 2000)。不同的信号传导系统间，尤其是糖信号和激素信号间存在广泛而直接的相互作用 （图 1 2） 。 用乙烯合成前体 型， 高浓度的葡萄糖对子叶和胚发育的抑制作用可通过外源添 加 明乙烯拮抗葡萄糖对幼苗 早期发育的 抑制作用 (et 1998)。乙烯组成型 “三重反应 ”突变体 )和乙烯过量产生突变体 )的子叶和胚 的 形成对高浓度葡萄糖的抑制不敏感，而乙烯抗性突变体 )则表现对葡萄糖的高度敏感 (et 1998;et 2001)。由此说明，乙烯浓度的增加可降低幼 苗 对葡萄糖的敏感性。然而，葡萄糖不敏感突变体 在黑暗中不表现乙烯的 “三重反应 ”(et 1995)，说明 三重反应 ”偶联。许多乙烯不敏感突变体（ 括 突变 体 实验表明，葡萄糖不敏感蛋白 et 1998)。 时与 子萌发和幼苗发育中有类似的或相互拮抗的作用 (001)，遗传分析进一步揭示 了 它们的相互作用关系。近来发现 ， ）为等位基 因 (et 2000; et 2001)； )为等位基因，同时 ， 研究发现葡萄糖可调控 号传导及乙烯信号传导有关的基因表达； 糖诱导的 et 2000)。 图 1 3糖、 烯信号传导的相互关系（ . et 2002） 3 . et 2002) （ . et 2002, 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 8 糖、 图 1 3)：高浓度的葡萄糖或蔗糖通过提高 乙烯通过 降低 而拮抗葡萄糖对幼苗形成的抑制作用 (et 2000)。糖信号除与 时与 究发现，赤霉素（ 导的大麦胚中 且这种抑制作用并非是葡萄糖抑制了赤霉素的生物合成所致，由此说明糖信号和 et 1997）。 因在大豆中的表达具有拮抗作用（ et 1994）。另有报道拟南芥葡萄糖不敏感突变体 对 et 2003）。 5 植物基因表达的转录调控 基因表达的程序、时间和位置在不同层次上受不同的调节因素控制，这种控制机制不仅决定基因表达的水平 ， 也决定基因表达的时空顺序。 物启动子的结构特征 植物启动子区域存在 一些共同的 特征元件，决定同 合酶 别、结合及引发转录过程。 其他生物一样，植物启动子区域 常保守，这是 合酶 是一些反式作用因子与 同基因的 有些基因缺乏物启动子的 2 7 保守序列为 列的变化反映了受到了不同调节因子的作用。 没有 过程中可能存在着某些替代机制，涉及到某种蛋白质因子与启动子中的某些 制转座作用是通过与起始点上游100 180 1996)。 侧翼序列同时控制组织特异性和发育特异性的表达。 守序列 早发现它在番茄核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因 (的上游受光调控 (， 1996)，是 广泛存在于植物中的一类 光 信号 反应 顺式作用元件，也是至今研究 得 最清楚的植物转录元件，在植物和动物中具高度保守核心序列 - 2国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 9 1C+ 0G+ 1T