【毕业学位论文】（Word原稿）小麦（Triticum aestivum L.）耐盐相关基因的克隆及特性分析生物化学与分子生物学博士论文

i 密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦（ .）耐盐相关基因的克隆及特性分析 .) h. D. .) 中国农业科学院博士学位论文 摘要 i 摘要 盐渍化是作物生产中常遇到的自然逆境之一，在沿海地区和干旱、半干旱地区尤为突出，盐胁迫严重限制了植物生长，致使植物枯黄、萎蔫，严重时可导致死亡，作物颗粒无收。 培育耐盐碱的作物品种是改良和利用盐碱地资源比较经济、有效的措施之一，其前提是对耐盐机制的深刻了解和耐盐相关基因的克隆及其功能研究。 以耐盐性受主效基因控制 的小麦品系 98材料，利用 术 研究了 98迫时间分别为 0, 15261224 72用约200 对 P/M 引物组合，共得到 500 多条差异片段，从中随机选取 233 个进行二次扩增，成功扩增并克隆、测序的有 112 个。 它们分别与丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶、锌指蛋白、抗病相关蛋白、液泡膜 亚基、泛素羧基末端水解酶、泛素相关蛋白以及受体激酶等有较高的同源性。 对结果表明，与已知基因有同源性的 片段有 73 条，约占测序数的 编码未知功能蛋白的基因有 25 条，约占 另有 14 条片段与已知基因或序列无任何同源性，可能是尚未发现的新基因。 采用 法，首次克隆了小麦 个乙烯信号传导途径中的负调节因子。该基因全长 2635码 759 个氨基酸，在基因的 3端有一个非常保守的丝氨酸 /苏氨酸结构域。在此结构域中有一个与 合位点和一个钙调素结合位点 。 析表明， 表达受盐、干旱和低温的诱导，其表达还受 制，解除 迫后，该基因的表达又逐渐 恢复。 交结果表明，该基因在小麦中以基因家族形式存在。 以 基础载体，成功构建了 植物表达载体，并进行了烟草转化。 测结果表明 对照中均未检测到该基因的表达。 过量表达 00培养基上叶片黄化，耐盐性下降，说明 能在小麦盐胁迫信号传导中起负调控作用。 通过电子克隆结合 方法，成功克隆了小麦的泛素相关蛋白的全长 长 2894码 870 个氨基酸，在基因的 3端有一个非常保守的泛素相关蛋白结构域，在基因的中部有一个锌指结构域。第 544 到 565 位氨基酸组成一个 22 个氨基酸的外向型跨膜结构域。 果显示，在叶片中，该基因在盐胁迫的早期表达量降低，在 24小时以后又增强。而在根中，该基因的表达受盐的抑制。 表达还受干旱和低温的诱导 。 它的表达没有明显影响。 果显示，该基因在普通小麦中 可能为单拷贝 基因 。以 基础载体，构建了 植物表达载体。 通过电子克隆 结合 方法，我们克隆了小麦液泡膜 亚基的全长 长 1369码 380 个氨基酸，在基因的 5端有一个非常保守的 亚基结构域。在盐胁迫的早期，该基因的表达基本稳定，随后表达降低，以后又升高，说明该基因与盐胁迫的适应有关。干旱胁迫对该基因的表达模式与盐胁迫一致。但低温对其表达有明显的抑制作用。 其表达没有影响。该基因在 A、 D 三个基因组中各有一个拷贝，但在 因组杂交信号明显加强。在普通小麦（六倍体）中也只有 一个拷贝。用缺四体对该基因进行定位发现该基因 可能 位于 1B 或 7B 染色体上。以 基础载体，构建了 植物表达载体。 利用 功克隆了一个小麦 该基因全长 1761国农业科学院博士学位论文 摘要 码 400 个氨基酸。在该基因的 N 端，有一个约 50 个氨基酸组成的 构域。第 247 到 266 氨基酸组成一个 20 个氨基酸的内向型跨膜结构域，第 248 到 266 位氨基酸组成一个 19个氨基酸的外向型跨膜结构域。 交结果显示，该基因在小麦中可能为单拷贝 基因。以 基础载体，构建了 植物表达载体。 通过电子克隆结合 法，克隆了小麦泛素羧基末端水解酶基因 基因全长3161码 932 氨基酸，在中部和 C 末端各有一个非常保守的 构域。 交结果显示，该基因在小麦中可能为多拷贝基因。 关键词：小麦，耐盐，基因克隆，表达中国农业科学院博士学位论文 is a of its in in of to is to to is to of of 98is a 8, 15261224 200 00 P/M 233 to be of 12 of 3 of 25 2.3 of 4 or be is a in of 635 59 a at TP a in by is a of a An on in no in is a of in an in 894 70 is a at a in An 44 65 in in at of 4 by 国农业科学院博士学位论文 iv no on be a in An on of a 369 a 80. is a at at of it in it be to of on no on a , SS S a in B B An on in 761 a 00. at An 47 66 an 4866 to is a in An on An in 161 32 a in is a in 目录 v 目录 第一章 文献综述 1 第一节 植物耐盐的分子机制 1 成渗透调节物质 1 节 体内的分布 2 累 白 4 第二节 转录因子在植物耐盐中的重要作用 4 第三节 植物盐胁迫的信号传导途径 6 号传导途径 6 号传导途径 7 它蛋白激酶参与的信号传导途径 8 第四节 白在植物生长发育中的功能 10 白的结构 11 植物生长发育及细胞信号传导中的功能 11 合体的调控 14 第五节 研究目的和实验设计 15 究目的和意义 15 术路线 16 第二章 利用 术分离与小麦苗期耐盐性相关的 段 17 料和方法 17 料和试剂 17 法 17 结果与分析 24 麦根总 取 24 链 合成 24 24 异片段的二次扩增 25 异片段的克隆 26 异表达片段的序列分析和 对 26 论 26 子转运蛋白与小麦的耐盐 性有关 27 麦耐盐性的信号传导途径 28 素在小麦耐盐性信号传导中的可能作用 28 胁迫信号传导途径与其它信号传导途径的交叉 29 中国农业科学院博士学位论文 目录 三章 小麦 因的克隆及表达 30 料和方法 30 料和试剂 30 法 30 果 41 因 3 5 段的扩增 41 因 全长 获得 42 生物信息学分析 42 因的 析 47 因的表达分析 47 因植物表达载体的构建 48 基因植株的 测 49 基因植株的 表达分析 50 基因植株的 耐盐性检测 50 论 51 第四章 小麦 因的克隆和表达 53 料和方法 53 料和试剂 53 法 53 果 56 长 克隆 56 因的生物信息学分析 56 因的 交分析 61 因的 交分析 61 因植物表达载体的构建 62 论 63 第五章 小麦 克隆和表达 65 料和方法 65 料和试剂 65 法 65 果 67 长 克隆 67 因的生物信息学分析 68 因的 交分析 71 因的 交分析 72 因植物表达载体的构建 72 论 73 第六章 小麦 因的克隆和特性分析 76 中国农业科学院博士学位论文 目录 料和方法 76 料和试剂 76 法 76 果 78 子延伸 78 3段的克隆 78 长 克隆 78 生物信息学分析 79 交结果 84 论 84 第七章 小麦 因的克隆和特性分析 86 料和方法 86 料和试剂 86 法 86 果 88 3段的克隆 88 长 克隆 89 因的生物信息学分析 89 交结果 93 论 95 结论 98 参考文献 99 主要试剂的配制 I V 致谢 者简历 国农业科学院博士学位论文 文献综述 1 第一章 文献综述 植物耐盐性研究具有十分重要的意义。全世界 约有 4 亿多公顷盐渍化土壤，仅我国就有 7000多万公顷（次生盐渍化土壤除外） ，且主要分布在粮食主产区，对农业生产构成了严重威胁（ 000）。 在 20 世纪 90 年代，世界人口的增长速度要远远超过粮食产量的增长速度 (999)。如果作物育种学家不能培育出更多更好的高产、优质、多抗的粮食作物新品种而使这种趋势发展下去的话， 在 21 世纪 的今天 ，我们会面临更加严峻的粮食短缺问题。 随着分子生物学、遗传 学及各种相关技术的发展，人们对植物耐盐性的研究已逐渐从传统的生理学水平上升到今天的分子水平。利用化学诱变、 入、转座子标签等技术得到的各种突变体使我们可以更加准确的研究基因的表达和功能，利用各种生化及细胞生物学技术可以研究基因的时空表达和蛋白 物信息学是我们进行分子生物学研究的有力工具。在此基础上，越来越多的盐胁迫相关基因及信号传导组分基因被分离和鉴定，从而为我们了解植物耐盐性及其信号传导提供了越来越多的证据，为利用基因工程提高植物的耐盐性奠定了坚实的基础。 第一节 植物耐盐的 分子机制 盐胁迫严重限制了植物生长，致使植物枯黄、萎蔫，严重时可导致死亡，颗粒无收。 盐胁迫对植物的伤害主要有两个方面，一是离子胁迫。由于离子胁迫的毒害作用，植物体内的活性氧自由基增加，过氧化作用加剧，造成膜脂或膜蛋白损伤，质膜透性增加，胞内可溶性物质外渗（ et 2002） ；二是渗透胁迫。盐分使土壤中的水势降低，使植物因吸水困难而产生生理干旱。 与此相适应，植物在长期的进化过程中形成了自己的适应机制，主要通过合成各种渗透调节物质缓解由盐胁迫带来的渗透胁迫，通过调节 其它离子在 体内的分布来缓解离子胁迫。此外，植物还通过积累一些胁迫诱导蛋白，参与植物的防御代谢（王忠华等， 2002）。 成渗透调节物质 植物在受到盐胁迫时会合成和积累一些有机溶质，使细胞免受渗透胁迫。这些可溶性溶质的共同特点是：易溶于水，高浓度时不干扰代谢，可保护植物在受到盐胁迫时酶的活性而对电荷平衡没什么影响。这些有机溶质包括糖类（海藻糖和蔗糖）、糖醇（甘油、甘露醇、山梨醇）、氨基酸及其衍生物（脯氨酸、甘氨酸甜菜碱）等。渗透调节剂的合成途径一般都与生物体内的基础代谢相关联。将这种分支途径引入缺乏有效渗 透调节剂合成植物的基因工程已初见成效，一般都可或多或少的改善转基因植物的耐盐性。 甜菜碱是一类广泛存在于生物体内的渗透保护剂。在细菌中，甜菜碱由胆碱经胆碱氧化酶（ 步催化合成。目前，已在水稻和拟南芥中克隆了 因（ et 997）。将入水稻，转基因植株高度耐盐（ et 2002）。在高等植物中，甜菜碱由胆碱经两步催化反应合成，这两个酶分别为胆碱加单氧酶（ 甜菜碱醛脱氢酶（ 其中，中国农业科学院博士学位论文 文献综述 2 第一步是甜菜碱生物合成的限速反应。用菠菜 探针，沈义国等（ 2001）克隆了山菠菜的 因。将 动子连接后转化烟草，获得了耐盐性提高的转基因植株。刘凤华等（ 2001）将克隆的山菠菜 因经农杆菌介导导入草莓和烟草，转基因植株的耐盐性明显高于对照。将 动子连接，郭北海等人（ 2000）用基因枪法将其转入小麦，得到了抗盐性提高的小麦植株。 脯氨酸是一种非常重要的有机溶质，除可调节渗透压以外，脯氨酸还具有稳定蛋白质结构，防止酶变性失活和保持氮含量的作用（ et 1987） 。高等植物中，脯氨酸的合成主要有两条途径：谷氨酸途径和鸟氨酸途径，它们的主要区别在于初始底物不同，分别为谷氨酸和鸟氨酸。一般认为，在渗透胁迫下，谷氨酸合成途径是脯氨酸合成的主要途径（ et 1993）。在谷氨酸合成途径中