【毕业学位论文】（Word原稿）用原位杂交技术对BHK-21细胞和牛组织中的FMDV RNA检测和定位预防兽医学硕士论文

- - 级： 机密 论文编号 : 中国农业科学院 硕士学位论文 用原位杂交技术对 胞和牛组织 中的 测和定位 NA n - NA n 要 本研究借助于新兴的原位杂交技术，对 宿主细胞，实验动物以及本体动物体内的增殖与分布情况进行 了检测和定位研究。首先以 因组中的保守区域设计并合成了 4 条寡核苷酸探针和 1 对引物，并利用尾段标记技术以地高辛 分子 标记了探针。然后用 ，收集不同时间段的细胞培养物，用细胞涂片法和爬片法，以特异性的探针进行杂交，在显微镜下观察 细胞内的分布情况，结果显示， 4h，细胞质中有少量的蓝染颗粒出现，呈现较弱的阳性信号；在接种病毒后6h，细胞开始有明显的阳性信号出现，细胞质中有蓝染颗粒出现，表明细胞质是 主要增殖场所；细胞感染病毒 810h 后细胞内有强烈阳性信号出现，细胞质中有大量的蓝染颗粒，表明 复制处于旺盛期，为了便于结果的判断与分析，我们设置了阴性对照，均没有相应的阳性信号出现，表明本研究所建立的原位杂交技术具有较高的敏感性和特异性。同时，本 试 验还采用原位 术对感染 细胞进行了原位扩增，结果表明，细胞内存在 增片段与预期大小一致，原位 用一条探针的杂交可以达到与原位杂交中使用多相探针相同的结果。 为检测 宿主体内的增殖与感染部位 ,我们用 原位杂交技术对感染 乳鼠组织样品和牛组织样品进行了检测 ,结果显示，在接毒后 25h 和 26h 的乳鼠骨骼肌的肌纤维细胞中有较多的蓝染颗粒出现 ,表明 该组织中大量存在 ,提示肌纤维细胞可能也是 制和增殖的部位； 同时我们对攻毒牛组织进行了检测和定位 ,在接毒后 728d 的牛舌上皮组织中成功检测出了 且发现病毒主要分布在上皮基底层，在颗粒层和棘层也有少量的在接毒后 38 d 牛舌上皮没有检测到有病毒 核酸 存在。在接毒后 712d 牛的喉咽部有少量的细胞有阳性染 色，大部分细胞没有阳性蓝染颗粒；在接毒后 738d 牛的蹄叉、淋巴结、扁桃体等组织中均没有检测出 在。该研究结果不仅从分子水平上对 宿主体内的分布情况进行了精确定位 ,而且 也表明本研究所建立的原位杂交检测方法和原位 测方法具有高度的敏感性和特异性 ,这将为我们 以后 进一步研究 分子致病机理和持续性感- - 机制提供有力的检测工具和理论依据。 关键词 ： 原位杂交 ， 原位 胞 ，乳鼠，牛- - of (in In D NA a of In NA 07 , 4, 6, 8 0 In in in a in of of 0 No in of of NA by in CR in a in of In SH in AN in NA in by in In in of 5 6 on of SH in In SH NA of , 12, 17 8 No in 8 of of of In in a in of NA SH 2 no in No in NA of of SH In is a NA in So we SH to MD in in in V 目 录 第一章 绪论 1 究的目的和意义 1 内外研究进展 2 究内容和方法 4 第二章 用原位杂交对 5 料 5 法 5 果 7 论 10 第三章 用原位 12 料 12 法 12 果 14 论 15第四章 用原位杂交对组织中的 测和 定位 16 料 16 法 16 果 17 论 21 第五章 结果与讨论 22 论 22 论 22 文献综述 23 参考文献 3 3 谢 3 7 附录 3 8 作者简历 4 3 表 2使用的寡核苷酸探针 6 图 2原位杂交和检测系统示意图 7 图 2果 8 图 2培养细胞原位杂交结果 8 图 2细胞爬片原位杂交结果 9 图 2细胞爬片原位杂交结果 10 图 3培养细胞原位 原位杂交结果 14 图 3细胞原位 泳结果 15 图 4乳鼠组织原位杂交结果 18 图 4乳鼠组织免疫组化结果 18 图 4牛舌上皮组织原位杂交结果 19 表 4牛的所有组织的原位杂交结果 20 图 4牛舌上皮组织 果 20 - - 略词表 类成髓细胞性白血病病毒 性磷酸酶 43仓鼠肾细胞 基对 of 化簇 补 胞病变（效应） d 碳酸二乙酯 高辛 氧核糖核苷酸 联免疫吸附实验 蹄疫 蹄疫病毒 h 时 型肝炎病毒 型肝炎病毒 类免疫缺陷病毒 纯疱疹病毒 辣根过氧化物酶 纯疱疹病毒 干扰素 n 位杂交 n 位聚合酶联反应 要组织相溶性复合物 钟 使 基四氮唑蓝 酸缓冲盐液 糖核苷酸 抑制剂 转录聚合酶联反应 霉亲和素 准柠檬酸盐 生嗜热菌 T 细胞受体 解温度 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 - - 1 第一章 绪 论 究的目的和意义 口蹄疫（ 由口蹄疫病毒（ 起的牛、猪、羊等偶蹄动物的一种烈性传染病。该病的发生与流行不仅严重影响了畜牧业生产及其产品的正常贸易并造成巨大的经济损失，而且影响了人民正常的生活秩序，甚至会影响一个国家 或地区的政治稳定，故该病又有 政治经济病 之称。 于小 毒科（ 蹄疫病毒属（ 迄今为止，已发现 7 个血清型（ A、 O、 C、 各血清型之间无交叉免疫现象，即使同一血清型不同毒株之间也仅有部分交叉保护。 然是一种烈性传染病，但是由于其病原是一种 毒，其基因组以 准种 形式存在，因而 有抗原漂移的特性，在免疫选择性压力的影响下， 可能逃避宿主的免疫监控系统而在宿主体内呈 持续性感染状态，从而给 防制与净化带来困难。 发展到现在已逾百年，从全球 疫情分布情况来看，大多数国家都有该病的发生与流行，只有少数国家幸免。尤其是最近几年， 流行态势更为严峻，几乎每年世界各地都有 发与再暴发的报道。如 1999 年我国台湾的流行几乎波及整个亚洲， 2001 年英国暴发的 乎席卷整个欧洲，不仅给本国造成了重大的经济损失，而且也给本地区甚至世界的经济造成了不良影响。 2001 年 暴发使英国扑杀 400 多万头家畜，估计造成的经济损失高达 90 多亿英镑。使得本病的重 要性得到充分的证明，疫情不仅使得欧盟各国重新关注 且也受到世界各国的普遍重视。 我国几乎每年都有 域性散发流行的报告，尤其是 1999 年以来在世界范围内形成一次大流行，其中我国大陆 1999 年全国 31 个省市区全面大暴发，牛、羊、猪发病总数为 53 万头，流行血清型以 O 型为主。 2000 年 15 月， 除 天 津外全国各省市区均有流行，发病牛，羊总数相对较大幅度下降为 10 万 余 头。最近几年我国部分地区 发流行可以说是星星点点，接连不断， 防制形式依然严峻。 有 证据表明 持续感染 动物可能成为 急性 流行 的潜在传染源（ et 1986; et 1994）。国外研究结果发现， 行后约有 50%的动物成为持续感染者，而且未接种疫苗的动物比接种疫苗的高（ et 994）。兰州兽医研究所曾多次对我国部分地区的健康牛通过流行病学调查以了解我国牛、 羊 和猪等易感动物 续感染情况，结果表明未接种疫苗的健康牛的持续感染率为 56%（ 30d） ,接种疫苗牛为 48%（ 30d），随着时间延长有所下降，但是 60d 两组的持续感染率还是较高为 28%（常惠芸等， 2003）。这给 制增加了难度，因此，解决 续感染问题刻不容缓。那么怎样才能解决 持续感染问题不仅是世界研究的热点课题，而且是一个难点问题。 随着分子生物学和基因工程技术的不断发展， 分子生物学研究也取得了一系列的研究成果，如 因组序列的测定及功能研究、 子遗传发生树的建立、病毒与宿主细胞间的相互作用，以及 反向遗传学研究等领域都有重大突破。但是所有这些体外操中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 - - 2 作并不能完全明确病毒与机体相互作用的精确机制以及病毒在宿主体内的持续感染机理，而解决这些问题用传统的实 验方法或技术如病毒组织培养技术、 清学试验，甚至新兴的 世纪 60 年代末出现的原位杂交技术 (In 是生命科学研究领域中的一次技术性革命，该技术使得人们对生命科学的研究不再仅仅局限于对机体器官、组织和细胞的研究，而是扩展到分子水平上来研究机体的生命现象和本质之间的联系(et 1969)。例如在细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学等研究方面， 原位杂交技术 发挥了巨大作用，人们也因此 取得了丰硕的研究成果 (et 2002; et 1999; 李西启等， 2001; et 1995； et 1990)，为基因定位，病原体基因的检测等提供了理论依据和技术支持。 就原位杂交在 究中的应用而言，国外已经对细胞和组织中的 行了检测和定位，并取得了一系列的成就。而我国在 因在宿主细胞中的定位研究方面尚属空白。为此，在国家 973项目基金的资助下，我们利用原位杂交技术对 因在细胞和组织中的分布进行了检测和定位研究，以期从分子水平上来阐明 宿主体内的持续感染的病理和机理，也为制订有效的 制措施提供理论依据，因而该项研究具有重要意义。 内外研究进展 为了对 致病机理有更深入的了解和做出详明的阐述。在 究的早期，许多研究者应用病毒分离方法和荧光抗体技术等手段研究了病毒在宿主体内的分布情况，尽管结果认为喉咽部是 性感染和持续感染期的主要复制位点。但是，由于受到当时现有研究手段和方法的限制，他们的研究结果不能确证病毒感染的靶细胞 类型（ et 994; et 993; et 999）。 1969 年美国耶鲁大学 率先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中 (et 1969)。与此同时， 利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。起初原位杂交都是对组织细胞中内源性基因的检测和定位。 1970 首先将原位杂交技术用于组织中感染性外源基因定位，他们用 3H 标记的 兔乳头状瘤病毒 针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交 对 细胞中病毒 基因进行了定位 ，这使原位杂交技术的应用范围进一步的扩大。但当时原位杂交使用的是放射性探针，由于放射性探针的缺点使其应用受限。 20 世纪80 年代初生物素和地高辛 分子 等非放射性标记 物 的出现和使用促进了原位杂交的 进一步 发展，使其的应用领域更为广泛。特别是 70 年代末到 80 年代初，分子克隆、质粒和噬菌体 构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现使得原位杂交 的应用 得到了前所未有 的发展， 从感染性外源基因的检测和定位 (et 2002; et 1999; 李西启等， 2001; et 1995； )、内源基因的检测、细胞因子的检测和定位、染色体定位、基因工程到基因表达的研究等方面 都得到了广泛的应用 (et 1988; et 1992)。 与此同时，兽医病理学家也开展了用原位杂交对 理的研究，首先将这一技术应用于 是 ，他们用生物素标记的 针对 人工感染的培养的猪肾细胞中的 行了检测和定位 (et 989)。结果指出，在感染细胞内有明显的强阳性染色中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 - - 3 颗粒，在检测水平上 针比 针更敏感。此后，许多刊物陆续刊登了用原位杂交对细胞和组织中 位的许多研究报告。 1991 年 用生物素标记的 针，采用原位杂交技术对人工攻毒后 豚鼠体内的分布情况进行了实时动态观察。发现攻毒后 4h，在其他 3 个未接毒的爪垫，肺泡巨噬细胞和脾脏的动脉血管壁内发现有强阳性染色，而舌上皮较弱，发展到 24h 时最强； 随时间的延长，肺部的阳性染色向肺泡膈扩散， 10h 后脾脏的动脉血管壁内的强阳性染色消失。这说明上皮组织和内脏组织是 期感染组织和器官 (et 991)。同时，他们认为原位杂交在组织中病毒的检测上优于病毒分离技术。次年他们又用同样的方法研究牛感染 病毒在自然宿主体内随时间的分布状况，结果同前一样上皮组织和肺泡巨噬细胞是 et 992)。在对 然宿主的研究中 (1999)用地高辛 分子 标记 D区 针对感 染了 517果指出，病毒存在于软鄂、扁桃体和咽部 ,但是其没有鉴定出细胞类型 (et 999)， 而且由于长探针引起高背景影响细胞定位。为了克服这一问题， 2000 年 采用多相寡核苷酸并对检测信号用酪胺放大，结果不仅提高了寡核苷酸探针的敏感性，而且克服了高背景现象。次年他们又用同一方法对人工感染牛组织中的 行定位，从感染 82d 牛的喉咽部上皮组织中检测出 多分布在上皮的基底层细胞的胞浆中 (et 2001)。 随着原位杂交技术的发展，该技术也用于确定免疫球蛋白和各种细胞因子的合成部位以及其它各种免疫分子 ( 1988; et 989; et 1987)，如补体，主要组织相容性复合体（ T 细胞受体（ 分化簇（ 原等。 2000 年 用 染性克隆株和无前导链编码区的 染牛，用原位杂交对牛体内的 1 型干扰素基因的表达情况进行检测和定位，结果指出， 染牛在肺单核细胞和肺淋巴结有大量的达，而 则只有 肺支气管上皮细胞内表达 (et 000)。 1990 年 把原位杂交和 合起来，对细胞内单拷贝和低拷贝基因进行检测和定位并获得了成功，首次开创了原位 术 （ in (et 990)，使得原位杂交的敏感性和特异性又有很大提高。目前，原位 术已广泛应用于病毒等外源性基因的检测和定位，如 (et 2002; et 1999; 李西启等，2001)。 1995 年 用原位 术对 行了研究获得了重大发现（ et 1995)。他们一致认为，原位 术在原位检测细胞内低拷贝基因方面具有更高的灵敏性和特异性，是原位检测和研究低拷贝基因的良好手段。 在病理范围内，原位杂交除用于病毒性疾病的诊断外，还广泛用于肿瘤研究 (李西启等， 2001; 董跃兰等， 2003; et 1992)。对癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的 表达及其变化的检测，如在肿瘤发病的分子机理研究方面，已发现在多种肿瘤中有抑癌基因 突变或缺失。同时，发现许多病毒的感染与肿瘤的发生有关 (et 1999; 李西启等，2001)。研究结果对加深理解肿瘤的发生机理、判断预后和治疗反应等都有一定的意义。 在发育生物学的研究中，原位杂交将有助于人们从基因水平来揭示生物体发育的奥秘(et 1990)。现已证明，不论是形体发育、细胞分化，还是图式形成过程，都涉及到基因的时空调控。只有准确的基因表达的时空调节，才 能保证发育过程按照严格的时空秩序进行。 在遗传学研究中，原位杂交被遗传学家用于基因的定位和绘制基因图谱 (et 1990; 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 - - 4 et 1992)。同时，在植物遗传育种上用于异源染色质及多种染色体畸变检测、植物基因工程及基因表达的研究及对遗传连锁关系进行细胞遗传学鉴定。 究内容和方法 为了弄清楚 细胞和宿主体内的复制和贮存部位，我们利用原位杂交和原位 1） 首先建立 原位杂交 检测方法，用该方 法对感染 胞进行了检测和定位，确定 因组在 染细胞中的复制和增殖部位。同时，鉴定该方法的敏感性和特异性。为用该方法对 染组织中的 测和定位提供试验资料。 2） 建立原位 测方法，并应用该技术对感染 行检测和定位研究，同时与用 原位杂交 检测方法做比较，以判断原位 检测感染细胞中 可行性。 3） 用所建立的 原位杂交 对 乳鼠和牛体内的感染与分布情况进行定位研究，初步判定 主要感染部位和持续性存在部位。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 用原位杂交对 胞中的 位 - - 5 第二章 用 原位杂交 对 胞中的 位 摘要： 用地高辛 分子 标记的寡核苷酸探针对感染 的病毒 行检测和定位，同时也对探针的特异性和敏感性进行验证。结果表明本实验所设计的寡核苷酸探针不仅具有较高的敏感性，同时也具有很好的特异性，能准确地对感染 胞的病毒 行定位，从分子水平上证明 要在细胞质中进行复制和繁殖。 关键词： 原位杂交， 针 ， 料 株 ： 试验用毒株 O/8 是本 实验 室保存毒株。 胞 ： 本试验使用的 胞系是本 实验 室常用细胞系。 要试剂： 敏感加强型原位杂交检测试剂盒 （碱性磷酸酶）（武汉博士德生物工程有限公司）、多聚甲醛（ 多聚赖氨酸（ 715 万）（ s 液（ 100）、硫酸葡聚糖钠（ 去离子甲酰胺（ 吐温 20（ 、 性树胶、胎牛血清（ 蛋白酶等。 法 病毒的复壮 当 胞长成单层时用 O/8 接种，观察病毒的致细胞病变情况待 80%左右的细胞出现病变时，收获细胞培养物，冻融 3 次后，再接种 胞，直至病毒的 应稳定典型为止，收获病毒 冻存备用。 胞的培养 涂片细胞按细胞常规培养方法培养。细胞爬片用直径为 60平皿（放置多聚赖氨酸处理的飞片） 37 5% 养箱 培养细胞，使用含有 10% 养液（加 10 万单位 微克 /毫升的青、链霉素）。待细胞长成单层时接种上述病变稳定的 （ 107 。 引物设计与合成 根据 O/8 的基因组序列，用生物学软件设计并合成了引物， +） 5- -） 53，由宝生物（大连）有限公司合成。 寡核苷酸探针的设计与 合成 通过 列分析软件比较 C 型、 O/8、 、 7五株序列 （ 序列均来自 的 3D 区，选择 D 区最保守的序列作为探针（序中国农业科学院硕士学位论文 第二章 用原位杂交对 胞中的 位 - - 6 列比对见附录 1）。采用尾段标记技术，在 3尾段标记非放射性标记物地高辛分子， 合成与 标记工作由武汉博士德生物工程有限公司完成（表 2 表 2用的寡核苷酸探针 称 探针序列（ 5 长度（ 22 5529 28 30 细胞涂片的制备 培养细胞直接涂片 将 胞培养在 100胞瓶中 （ 37 ） ，所使用的培养液是含有 10% 胎牛血清（ 10 万单位 微克 /毫升的青、链霉素）。当细胞生长成单层时接种上述病变稳定的 （ 107 接毒细胞 4h 已出现明显的细胞病变，同时设立 阴性 对照。弃掉培养液，并用培养液洗涤 1 次，弃掉洗液。用 胰蛋白酶消化细胞，把消化后的细胞移入 量离心管， 1600g 离心 5 涤细胞，1600g 离心 5 释细胞为 2106 后取 10L 细胞悬液滴在多聚赖氨酸处理的载玻片上（ 室温无尘条件下自然 干燥，然后用 4%多聚甲醛（ 配制的 温固定 30涤 5复一次， 洗 5馏水充分洗涤，自然干燥后 冻 存备用。 细胞爬片的制备 将多聚赖氨酸处理的无菌载玻片放置于直径为 60皿内，进行 胞培养，所使用的培养液是含有 10%（ V/V） 胎牛血清的 10 万单位 微克 /毫升的青、链霉素），平皿置于 37 5% 养箱。当细胞生长成单层后，接毒 （ 107收集接毒后 2h、 4h、 6h、 8h 和 10h 的盖玻片，用 5涤 2 次 ； 4多聚甲醛室温固定 30用 涤 5涤 2 次， 洗 570% 酒精中 4保存，或自然干燥后 冻存备用。 交 从所使用的细胞毒中提取 生物公司）进行 应体系为： 5 L； 0L ； L； L； L； L；L； L， 0L，无 水 15L）。扩增程序： 50 ， 3094 ，594 ， 256 ， 72 ， 30 循环， 72 ， 10扩增产物 电泳 后的 转膜 、 杂交程序参考分子克隆第三版。 感染细胞 原位杂交 1) 暴露靶核酸：上述准备好的细胞涂片滴 加用 3%柠檬酸新鲜配制的胃蛋白酶， 37 消化中国农业科学院硕士学位论文 第二章 用原位杂交对 胞中的 位 - - 7 5120涤 3 次 5理蒸馏水洗 1 次。 2) 预杂交：将细胞切片放置在湿盒里，每张切片加 1020L 预杂交液，盖上原位杂交专用盖玻片在 42 恒温箱预杂交 24h。揭去盖玻片，吸取多余预杂交液，不洗。 3) 杂交：每张切片加 1020L 含探针的杂交液（ 2g/温箱 42 杂交过夜。 4) 杂交后洗涤：揭掉盖玻片， 37 的 2涤 5 次； 5 次； 5 次。 5) 滴加封闭液： 37 30去多余液体，不洗。 6) 滴加生物素化鼠抗地高辛： 37 60 室温 120涤 5 次。 7) 滴加 37 30涤 5 次。 8) 显色： 20）按 1： 20 的比例用 释，混匀。显色液加至标本上。 37 避光显色 3060时镜下观察当出现背景染色时及时终止，蒸馏水充分洗涤。核固红复染 515洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。 结果 果 如图 2示，只有 标条带的区域有清晰的杂交条带，而 没有条带出现，杂交 链霉亲和素 酶底物 性磷酸酶 生物素化鼠抗地高辛抗 体 地高辛标记寡核苷酸探 针 病毒 序列 图 2原位杂交和检测系统示意图，主要成分包括地高辛分子标记的寡核苷酸探针、生物素化鼠抗地高辛抗体、链霉亲和素、碱性磷酸酶和底物 of in 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 用原位杂交对 胞中的 位 - - 8 杂交条带 2 3 M 图 21