【毕业学位论文】（Word原稿）利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象-化学

北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 化学学院 2000 级 目录 第一章 绪论 、 背景知识 、 关于 1 第二章 试验内容及方法 .、 表达 、 分离与纯化 、 度的测定 、丙稀酰胺对 荧光淬灭 .三章 结果讨论 . 致谢 15 参考文献 16 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 1 第一章 绪论 一 、 背景知识 热休克蛋白 是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。 当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为及小分子热休克蛋白 et 1998)。 小分子热休克蛋白分子量为 12的分布极为广泛，从细菌到人的基因组里都有小分子热休克蛋白的基因。 与其他大分子 的热休克蛋白不同的是，小分子热休克蛋白似乎对于细胞的功能并不是必不可少的。但是， 有多种功能，包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，作为分子伴侣以防止蛋白聚集，对坑正常的细胞死亡，从而调节细胞的生存和死亡的平衡。能避免底物变性的 少量与底物和热休克蛋白都有关 (et 1998)。 许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达，显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。现已发现，除了热刺激之外还有许多物理、化学刺激可以激活小分子热休克蛋白的表达，例如紫 外线、射线、机械损伤、酸、氧化剂等等。可见，小分子热休克蛋白是抵御外界不良刺激的重要物质。 二、关于 蛋白的结构 来自 一种甲烷球菌属古细菌 ） 的热休克蛋白 对分子量 16500 167 个氨基酸残基， 是第一个有晶体结构数据的小热休克蛋白。它的序列中存在一段长 90 个残基的 基 46 至 135），此结构域与人的 相似性，与水稻的 相似性 (et 1998)。 图 1. 单体结构 结构已经解出。它是一个中空的球状的 24 聚体，分子量约 16500合体的外径约 120，内径约 65。球的内部是空的，并没有明显的电荷密度。 它具有非常规则的结构，对称性包括 12 个二重轴， 3 个三重轴， 3 个四重轴， 8 个三重轴窗口， 6北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 2 个四重轴窗口，边长分别为 30 和 17 。 聚合体中的每一个折叠单位是由组成两个 片的结构、两个短的 310中一个结构来自相邻的折叠单位 。蛋白 氨基酸残基高度无序的。从第 33 个残基开始，是蛋白的 在蛋白的 2 个残基的短小结构 (. et 2000)。每个蛋白的折叠单位大小为 25 28 75，最长的方向与折叠片的长轴平行。 24聚体中的每一个单位都与其他单位有很强的联系。对应于复合体中二重、三重、四重对称轴，一共存在三种折叠单位间的相互作用。最强的相互作用存在于二重轴周围：一个单位的 2单位间的折叠片，同时强烈的疏水相互作用和静电力也使该结构得到北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 3 稳定。在四重轴周围，由于氢键、静电力和疏水相互作用，四个分子互相接触。而在三重轴周围，单位间的作用力最弱，只有离子间作用力是三个单位组成的三角形顶角处稳定( et 1998)。 2 细胞和蛋白的热保护 实验表明，在表达了 大肠杆菌提取物中， 75%的蛋白在 80 高温下因为被保护而没有聚集沉淀，而提纯得到的 大肠杆菌提取物有相同的作用，说明对大肠杆菌的热保护主要是由 成的。另外，对于变性温度为 80 的单链应乐果甜蛋白（ 样可以阻止其在变性温度下发生聚集 (et 1998)。 一种可能机制是， 可能在体内，在这个过程中，蛋白或对细胞重要的 球状体的空腔或表面。另一种可能性是， 聚体与他的功能和活性无关，而是一种蛋白的储存状态：当蛋白受到外界压力的时候，多聚体就会迅速分解。 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 4 第二章 实验内容及方法 一、 表达 1. 原理 蛋白质表达是为获得大量的目标蛋白质而进行的有目的性的蛋白质合成。常用方法是将编码所需产物的基因插入质粒或其他载体，然后将该载体导入活细胞，进行大量合成。 大多数克隆载体都以大肠杆菌作为宿主。因为大肠杆菌具有两个特征：操作简易和能在廉价的培养基上迅速的生长。 在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（一般是质粒）。载体应具有的几种元件有： 选择标志的编码序列，它可供筛选以确定载体是否进入了细胞； 可控转录启 动子，经诱导后从克隆化基因产生大量的 转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子 一个多限制酶位点接头，便于外源基因以正确方向插入载体中。 含有待表达基因的载体构建好后，经转化导入大肠杆菌某一合适菌株中。 编码 基因（ 经从古细菌 得到克隆，利用 术扩增，并插入带有氨苄（ 抗性的载体 粒（ 。将此载体转化进入宿主 宿主体内含有质粒 质粒含有可以编码 有密码子（精氨酸密码子 异亮氨酸密码子并带有壮观霉素 (性。我们用含 和 的 养基来筛选出可以表达 菌株。得到的菌株在适当条件下大量培养，即得到表达出所需蛋白的细胞。 2 仪器和试剂 仪器 a) 蒸汽消毒器：山东新华医疗仪器厂； b) 式 圆 形 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ： 张 家 港 市 华 菱 医 疗 设 备 制造有限公司； c) 级数显恒温器：重庆四达实验仪器厂； d) 518 台式恒温培养摇床： e) C 22 分光光度计：上海棱光技术有限公司； . f) C 5C 冻离心机： 其他常规仪器：电子分析天平；漩涡混合器；一次性培养皿；烧杯；锥形瓶；接种环；酒精灯；微量 移液器；离心管（ 50050一次性小离心管（ 滴管；玻璃棒。 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 5 试剂 a) 体培养基： 每 1001g 1g 加水至 100用 7 b) 体培养基： 每 100体培养基中加入 脂 (c) 50mg/ 10500mg 10ml d) 50mg/ 10500mg 10ml e) 1M 5f) 液 每 100 100 注：配制 无菌环境中将配好的溶液过一次性滤器装入无菌细口瓶，于 4 冰箱中保存。 3 实验步骤 转化质粒 a) 配制 000 b) 待培养基冷却而固体培养基未凝固时加入 50mg/和 各 50 l，摇匀，倒平板。向一瓶液体培养基中加入 和 各 50 l；另一瓶液体培养基中加入 50 l。 c) 在含 的液体培养基中加入 10 l 恒温摇床上 37 ，150养 6 小时，至 右。 d) 取 1液，离心，弃上清液。 e) 加入 100 l 悬菌体沉淀，加入 3 l 粒，振荡均匀。冰浴北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 6 30 分钟左右，保持细菌处于感受态。 f) 于 42 恒温水浴下热休克 45 秒 （时间要精确） 。 g) 冰浴 1 2 分钟。 h) 取 50 l 菌种于含 和 的固体培养基中，涂布均匀。在恒温摇床上于37 ， 150培养 16 小 时左右。出现分布均匀的单菌落证明转化成功。 菌种保藏 a) 单菌落接入含 和 的培养基内，恒温摇床上 37 ， 150培养 8小时左右，至 。 b) 取 1液于 离心管中，加入 80无菌甘油至终浓度 8%于 20冰箱中保存。 大量培养： 取菌种 200 l 于 1L 已灭菌的 养液 (含 50 g/ 30 g/中，37 ， 150摇床培养 8 小时左右，至菌 体 600为 诱导： 加入 00 l（终浓度为 继续在 37150培养 2 小时左右。诱导过程中，菌不再生长。 注：以上所有操作均在无菌条件下进行。 收获菌体： 将菌液于 4 ， 5000g 下离心 10去上清液，用 液重悬菌体，再于 4 ， 5000g 下离心 10淀的菌体于 20 下保存。 二、 分离与纯化： 1. 原理： 为了提高蛋白纯度，我们借鉴文献的纯化方法（ im et 1998），摸索出了一套纯化方法。使用分离纯化生物大分子最高效液相色谱分离技术，连续使用三种色谱法：离子交换色谱，疏水作用色谱，凝胶过滤色谱。 子交换色谱 氨基酸是一种兼性离子，在生理条件下，羧基带负电，氨基带正电。由于不同的氨基酸侧链不同，使其具有不同的酸碱性，从而在生理条件下又带上了额外的电荷。自然，有大量氨基酸组合而成的蛋白质，也有可能是带电体。 离子交换色谱，是利用被分离物质带电性质不同而达到 分离效果的一类液相色谱。色谱柱的固定相上带有可解离的阳（阴）离子，当带有同种电荷的物质流入柱内，会将该种离子置换出来，从而停留在柱内。逐渐加大洗脱液的离子强度，或者改变体系北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 7 的 ，都可能使新的离子取代被提纯物质的位置，从而是物质被洗脱下来。电荷性质不同的物质，与固定相间的作用力不同，洗脱时间不同，从而达到分离提纯的效果。 水层析 疏水层析是基于溶质，极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。它利用分离的物质的疏水性质不同，而达到分离效果的。与疏水作用相对的是静电作用力。在很高离子浓度 时，被分离物质因为与柱内固定相间的疏水相互作用而被停留在柱内。根据相似相容原理，降低洗脱液的离子强度，增加了流动相与被分离物质间的疏水作用，加大了物质离开固定相的趋势，直至被洗脱下来。 胶过滤色谱 凝胶过滤色谱是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液以及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质以及一些蛋白质复合物被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比小分子量蛋白更早的被洗脱下来。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小；中等 的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。 2. 仪器和试剂 仪器 a) 速（蛋白，多肽，核酸）液相层析仪 ： b) 阴离子交换柱 5 柱： c) 疏水柱 F d) 凝胶过滤柱为 200 e) C 5C 冻离心机： f) 声细胞粉碎机：上海新芝生物技术研究所； g) 环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司； h) 米一次性无菌滤器。 其他常规仪器： 电子分析天平；电磁搅拌器；烧杯；微量移液器； 50心管；一次性使用无菌注射器滴管；玻璃棒。 试剂 a) 50 10095 至 ，室温保存； b) 100剧毒 )： 每 15261京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 8 异丙醇： 15解后分装 750 l/管， 20存； c) 1M 储液）： 每 10010 20存； d) 200冲液（ 5 倍储液） 1L 00 00 e) ： 40冲液 将储液 d）稀释 5 倍； m 滤膜过滤； f) ： 每 1L 储液 d）： 200 1M）； 配至总体积为 1L； m 滤膜过滤； g) ： 每 1L 储液 d）： 200 ( 配至总体积 1L； m 滤膜过滤； h) ： 每 1L 储液 d） 200 配至总体积 1L； m 滤膜过滤； i) 蔗糖；固体，分析纯； j) (体，分析纯； 3实验步骤 破壁（机械 法）： 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 9 1） 配制破壁用缓冲液： 每 3g 菌 5015 100150 l； 蔗糖： 3g； 1M 60 l； 2）破壁： 将收获的菌体用破壁缓冲液重悬，冰水浴中，以 3 秒脉冲（ 3 秒开， 3 秒关）超声破壁 120 次，超声功率为 400W，至混合液呈半透明。 注：破壁后的溶液要马上进行下一步提纯，因为破壁后的溶液里含有蛋白酶会降解蛋白。 3）离心： 将破壁后的液体于 4 ， 24000g 下离心 20清液 膜过滤。 谱法分离 （均以 1L 培养液所得约 3g 菌体为例）： 1） 离子交换色谱： a） 将蛋白样品用 m 滤膜过滤； b） 以 为 A 泵溶液， 为 B 泵溶液，采用 5 柱，取蛋白溶液每次 5行分离。用 A 泵上样，用 冲平。洗脱为 30%，在 30% 收集。收集样品后加入 ( 2） 疏水层析 疏水柱 F，依次以 1M ， 充分 平衡；上一步样品 m 滤膜过滤后用 B 泵上样，在用 冲平。洗脱为 100%，在 60% 收集，洗脱峰约为 47%C。收集溶液超滤浓缩小于 2 3） 凝胶过滤色谱 凝胶过滤柱为 200。用 2ml 次上样 2集方式为峰收集，50停止收集。一次收集 后收集的样品应舍弃第一管。 保存 用 5 超滤管浓缩， 1： 1 加入已经灭菌的 80%甘油， 存。 三、 度的测定 1. 原理 蛋白质通常在波长 280，有最大吸收峰，因此可以利用紫外可见分光光度计，测出一定浓度蛋白溶液在该波长下的吸收。再根据蛋白浓度和吸收强度成正比的定理，利用该蛋白的吸光系数，求出溶液中蛋白的浓度。 据文献报道 280的吸光系数为 mg/1用光程 1可利用公式计算蛋白浓度。 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 10 蛋白浓度 =280紫外吸收值 /（吸光系数 光程长） =280紫外吸收值 / . 仪器和试剂 仪器 a) 5 b) 微量光吸收池（光程 1品量 50 l）： 试剂 视情况而定，应与蛋白溶液除去蛋白后的组成完全相同 3. 实验步骤： a) 将两吸收池洗净吹干，分别用作样品池和参比池，在 280长下自动调零； b) 估计蛋白溶液浓度，取少量将其用 吸光度约 c) 取蛋白溶液 100 l 于样品池， 00 l 于参比池，测定蛋白溶液在 280 d) 计算蛋白浓度。 四、丙稀酰胺对 荧光淬灭 1 原理 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。能引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。一种研究蛋白构象非常有用的试验方法是将淬灭剂加入溶剂中。有三种常用的 淬灭剂：丙稀酰胺，s+。其中丙稀酰胺是中性分子，而后两种分别带负电和正电。淬灭剂的浓度变化从 于蛋白来讲，丙稀酰胺被广泛的应用到确定 基的暴露度。此 试验是在每一温度下用丙稀酰胺进行滴定，记录荧光信号以获得淬灭数据。 这一过程可以描述如下： M(+ Q M(+ Q (1) 无淬灭剂时， 00 kk (2) 其中0有淬灭剂存在时， Q k ) 所以， 000 (4) 因为无淬灭时单重态寿命为 )/(10s 所以， (4)式可以简化为： 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 11 10 （ 5） 以上就是著名的 式。 令 基在溶剂中的暴露程度，高的的 2 仪器和试剂 ： a) 色谱纯丙稀酰胺溶液（ 5M）； b) 纯化后的小热休克蛋白溶液； c) 1 3 步骤与方法 ： a) 白溶液样品，使其浓度大约为紫外吸收在 X 。 b) 记录蛋白和空白的荧光光 谱：荧光的激发波长为 295录发射光谱从310 450 c) 分别加入丙稀酰胺溶液 5， 5， 10， 20， 20， 20， 20， 20， 40， 40 l 使最后丙稀酰胺的浓度大约在 d) 按照上述步骤测量空白的荧光光谱。 e) 重复上述步骤，控制温度从 25到 95，每隔 5测量一次。 4. 数据处理 ： 将 b）中测得的荧光强度减掉相应的 c）中的空白值，初始荧光强度为 荧光淬灭剂浓度 Q时荧光强度为 F。 对 Q作图，数据用 性拟合，拟合直线强制过（ 0,1）点，获得不同温度下获得的 a) 各个温度下 式的线性拟合： 25 30 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 12 35 40 45 50 55 60 65 70 80 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 13 85 90 95 T/ 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 0 5 0 5 释：以上图中纵坐标 ()横坐标为丙稀酰胺浓度 Qb) 将 作图，得到如下结果： 第三章 结果讨论 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 14 从以上图形可以看出，度变化有较为明显的上升趋势，由于基在溶剂中的暴露程度，所以基随温度的上升，其在溶剂中暴露的越多。 致谢 感谢来鲁华老师和曹敖能老师在一年多的时间里给予我的指导和关心。从他们身上，我不仅学到了生物化学领域的知识，更重要的是作为一个科学工作者的研究方法和治学态度。这些注定将让我受用终身。 感谢蔡利峰博士和王铮研究生给予我的帮助，是他们一开始将我领进这个我相对陌生的领域 。 感谢范可强、魏平两位师兄平时对我学习上的帮助和支持。 感谢徐菲、杨铭两位同学平时对我生活上的照顾与帮助。 最后，感谢我的家人在我实验和学习期间给予我的支持和理解！ 谢谢大家！ 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 15 参考文献： 分子克隆试验指南（第二版） 美 科学出版社（ 1996） 生物化学（第三版） 王静岩、朱圣庚、徐长法主编 高等教育出版社（ 2002） 仪器分析教程 北京大学化学系 仪器分析教学组 北京大学出版社（ 1997） 变性条件及