【毕业学位论文】（Word原稿）马铃薯Rubisco活化酶基因组织特异性启动子的克隆及功能鉴定生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 马铃薯 能 鉴定 I 摘 要 绿色植物光合碳同化的关键酶。近年来的研究发现， 化酶 (以调节 活性，它能使 植株体内条件下达到最大活化程度。 化酶不仅具有活化 功能，而且具有 解酶活性。研究表明，在 解过程中， 化酶促使各种磷酸糖抑制物从 解离下来，恢复 性。 化酶基因的表达受光的诱导，且具有绿色组织表达特异性。本研究以马铃薯为试材，分别克隆 化酶基因及其上游调控序列，进行了 达检测和上游序列启动功能分析，研究结果如下： （ 1）马铃薯 因的克隆与基因序列分析。 以马铃薯 (种“大西洋”为试材，利用 术克隆了 化酶基因的 列。该基因 长 1630 开放阅读框（ 1614 括起始密码子 终止密码子 码 537 个氨基酸。核酸和氨基酸序列分析表明：马铃薯同拟南芥、菠菜、番茄等植物 因具有较高的同源性，与菠菜和拟南芥的同源性达 75%，与茄科作物番茄的同源性可达 98%；其氨基酸序列与菠菜同源性达 76%，与拟南芥的同源性达79%，而番茄的同源性高达 96%。 （ 2） 因组织特异、光诱导性表达检测 不同光照时间处理的马铃薯叶片样 品的 测表明，本研究克隆的马铃薯 因的表达具有光诱导特性。在其他培养条件相同的情况下，其表达水平与光照处理时间成正相关。随着光照时间的增加 因的表达量也随之增加，处于黑暗培养下的 因不表达， 8h/d 连续光照下表达量极少，而 24h/d 连续光照下，其表达量最高；此外，在同等光照条件下， 达量在不同组织中也是有一定的差异， 因在茎中的表达量要远小于叶。 （ 3）马铃薯 因上游序列的克隆与启动功能鉴定 在已知 列的基础上，经染色体步移技术获得了 分 5 上游序列，经 析结果表明：此序列中含有 G 启动元件。转基因烟草的 织化学染色确定了本段序列的启动功能。 关键词 ：马铃薯 ( 因；组织特异性：光诱导；启动子 5is an to of In a is it in a is of of It is of in a of is In of by 1. of he as a to CR 630bp 614a 37 of we is of to 5% 98% to of of of CA 6%, 79% 6%, 2. of in o of NA of As a of in a It a in of h, 16h 4h of of 4h h 6h, no in On of in is in a 3 of On of of by of in to of of 录 摘 要 . I . 文缩略表 . 一章 文献综述 . 1 第一部分 化酶结构特征及其调节机制 . 1 1. 体内外机制的矛盾与酶的发现 . 1 2 化酶的分子特性 . 2 3 化酶对 活化作用 . 3 4环境因素对 化酶调节 影响 . 4 第二部分 启动子研究概述 . 5 1. 启动子简述 . 5 动子的一般特征 . 5 式作用因子 . 6 物启动子的分类 . 6 成型启动子 . 6 动子 . 7 动子 . 7 向启动子和可变启动子 . 7 织特异性启动子 . 8 导表达启动子 . 8 诱导表达启动子 . 8 原诱导表达启动子 . 8 素诱导表达启动子 . 8 落酸（ 导启动子 . 8 长素诱导启动子 . 9 烯诱导启动子 . 9 霉素诱导启动子 . 9 2. 组织特异性启动子的研究 . 10 营养器官中表达的组织特异性启动子 . 10 片特异表达启动子（ . 10 皮部特异表达启动子（ . 10 管束特异表达启动 子（ . 11 块茎专一表达启动子（ . 11 特异表达启动子（ . 12 生殖器官中表达的组织特异性启动子 . 12 粉组织特异性启动子（ . 12 器官特异表达启动子（ . 13 实特异表达启动子（ . 13 子特异表达启动子（ . 14 3本研究的目的和意义及技术路线 . 15 第二章 材料与方法 . 17 料 . 17 法 . 17 粒 提取 . 17 受态细胞的制备 . 18 肠杆菌感受态的制备 . 18 癌农杆菌 受态的制备 . 18 肠杆菌及农杆菌的转化 . 19 肠杆菌的热击转化 . 19 组质粒 融法转入农杆菌 . 19 击转化 . 19 的片段的回收 . 20 铃薯基因组 提取方法 . 20 铃薯总 取方法 . 21 因全长的获得 . 21 一链的 成 . 21 因中间目的片段的获得 . 21 因 3末端的获得 . 22 因 5末端的获得 . 23 一链的 成 . 23 分解 . 24 接反应（单链 环化或形成首尾连接物） . 24 应 . 24 长的获得 . 25 因 5上游序列的获得 . 25 限制酶酶切反应 . 25 接反应 . 26 V 增 . 26 物表达载 体的构建 . 27 增 因 5末端上游部分序列 . 27 建植物表达载体（ . 27 杆菌介导的遗传转化 . 29 照诱导 因表达试验 . 29 . 29 织化学染色 . 31 第三章 结果与分析 . 32 3.1 因全长序列的获得 . 32 铃薯总 提取 . 32 计简并引物 . 32 因中间目的片段的获得 . 33 因 3末端的获得 . 34 因 5末端的获得 . 35 因全长序列的获得 . 36 3.2 因组织特异性和光诱导性的 测 . 39 3.3 因 5上游序列的获得 . 39 3.4 物表达载体的构建 . 40 杆菌介导法转化烟草 . 41 基因烟草的 测 . 41 织化学染色检测 动子的启动功能 . 42 论 . 43 第四章 结论及创新点 . 45 参考文献 . 46 致 谢 . 55 作者简介 . 56 附 录 . 57 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 放阅读框 ,5加氧酶 ,5加氧酶 活化酶 椰菜花叶病毒 脂碱合酶 鱼碱合酶 脱落酸 合酶链式反应 5,52- 25,53丙氨酸氨裂合酶 游启动子成分 皮储藏蛋白 HR 敏性坏死反应 统获得性抗性 稻东格鲁杆状病毒 节 花黄斑驳病毒 子腐叶病毒 粉粒结合淀粉合成酶 录起始位点 量子通量密度 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 第一部分 构特征及其调节机制 1， 5加氧酶（ 5称所有光合生物进行光合碳同化的关键酶，它参与了光合作用和光呼吸作用过程，调节两者之间的关系。人们对此酶的催化机理、结构特点、装配及其分子生物学特性等方面已作过大量研究，但在酶活化机制的研究中仍存在很多疑难和矛盾。环境因子（光强、温度、湿度、 、植物体内生理因子（ 、 浓度、 值）各种抑制物都会影响 内的 性调节一直是人们关注的焦点。直至 化酶的发现，才为化 过程中的许多问题提供了较为合理的解释。 化酶的发现是近年光合作用研究中取得的重要进展之一。 1. 体内外机制的矛盾与酶的发现 化 羧化和加氧反应，并调节二者之间的关系，这两个反应的比值决定了植物的碳同化效率。已有研究表明，虽然 量约占叶片可溶性蛋白的一半，但它的效率却很低（ et 1983、 1988、 1999； et 1999）。因为加氧反应除了消耗能量，还损失了羧化反应中固定的 25的有机碳（ 1996）；同时，植物 体内高浓度的底物 E）结合形成“ 阻止了 化过程的进行（ et 1983； et 1999）；此外，叶绿体内许多代谢产物如 25 2- et 1993）、 35- 均可使 之结合形成 化合物，使 化，且活化态 于脱氨甲酰化而失活，这些因素使 为光合速率的限制因子，因而也成为提高作物光合效率的研究目标（ et 1987）。长期以来，人们希望通过基因改造和转基因技术来提高作物中化 成高光效作物品种，然而这些努力迄今尚未得到理想的结果（ et 1999）。究其原因，与 性调节的复杂性（ 1992、 1995； et 1996）有关。 近年来的研究证明， 以多种形式存在，但要完成催化反应必须处于活化状态（ 1981），钝化态的 须经过另一种酶的活化才能表现出其羧化 /加氧活性，这种酶就是 化酶（ 写为 一种可以调节 性的酶，它能使 植株体内条件下达到最大活化程度。