【毕业学位论文】（Word原稿）棉花恢复系幼蕾cDNA文库构建及发育相关基因的克隆生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 棉花 恢复系 幼蕾 库构建及 发育 相关基因的克隆 of of 摘 要 棉花是我国重要的经济作物，如何高效地利用棉花杂种优势成为当今世界棉花育种关注的焦点之一，三系是培育棉花杂交种 、利用杂种优势非常有效的途径，能够 产生巨大的经济效益和社会效益 。 但是由于恢复系资源狭窄，强优势三系组合较少， 如果 能够通过基因 克隆 技术 得到使棉花 具有恢复能力 的相关基因，进一步 获得工程恢复系，对扩大恢复系资源、扩大三系杂交种的应用具有非常重要的意义。 本研究以高产抗虫三系杂交棉恢复系为材料，该恢复系 聚合了来源于哈克尼西棉的恢复基因和来源于陆地棉的恢复加强基因， 构建其幼蕾 筛选可育系和不育系差异表达基因，获得如下结果： 1. 以棉花恢复系 3 5 天幼蕾为材料， 改进 热硼酸 /蛋白酶 K 法 沉淀 用量，选用 和改进的热硼酸 /蛋白酶 K 法提取总 过比较表明热硼酸 /蛋白酶 K 法是提取棉花幼蕾 适宜方法，该法提取的棉花幼蕾总 整性较好，纯度较高， 观没有任何颜色，棉酚褐化现象得到很好的抑制。 2. 从棉花恢复系幼蕾总 纯化出 构建棉花恢复系幼蕾 库， 最终获得的未扩增文库约含克隆子 106，重组率约为 92%，平均插入片段大小为 文库扩增后，获得的文库滴度为 109 满足基因表达和克隆研究的要求。 3. 根据三系杂种 和不育系抑制差减获得的大小为 380其两端设计引物，初步筛选棉花恢复系幼蕾 库，获得了 1 个阳性克隆。对该阳性克隆子进行分析，发现： （ 1） 该基因外源插入片 段 长为 1462 源序列比较分析发现，该片段序列与陆地棉纤维 库中得到的 8%。与杂交稻中得到的 9%。在开花期一天的纤维中、三周的陆地棉组织及拟南芥中得到的 是这些 （ 2） 该基因序列中 135 1343 区域为一个 完整的编码序列，在序列开始有起始密码子（ 于末端有终止密码子 (全长 1209编码 402个氨基酸。 （ 3） 氨基酸序列比较分析发现，该基因编码的蛋白序列与番茄中的转座酶（ 有 98%的同源性。因此，暂命名为： 综合以上结果及文献推测，本实验分离到的基因可能与棉花幼蕾发育以及可能因转座行为引起的育性相关 。 关键词 ：棉花幼蕾，基因， 库 is an in to of s is an to of of by is it is to of In to be is of of as 1. 5 s as by NA by 2. of 06of 2% of of 09 be to 3. 2 SH an ST A of to A by CR of as (1) of 426by ST 8% to SH 9% to it s 3 of t (2) An RF is 351343bp 209an a GA a 02 (3) of by is 8% We a of to to 目 录 第一章 文献综述 . 1 . 1 通 库 . 1 长 库 . 4 何从微量样品中构建 . 6 高 库构建效率的新方法 . 6 建 库的载体系统 . 7 . 8 . 8 . 11 . 13 物生殖发育相关基因表达的研究进展 . 14 胞核雄性不育 (因 . 14 胞质雄性不育 (因 . 15 物细胞质雄性不育恢复基因的研究进展 . 18 花细胞质雄性不育的研究进展 . 20 花 幼蕾发育相关基因的克隆策略 . 21 建基因表达的 . 22 制差减杂交 . 22 第二章 棉花恢 复系幼蕾 . 25 . 25 . 25 仪器及药品处理 . 26 法 . 26 果与分析 . 40 花恢复系幼蕾总 . 40 . 42 入片段的初步检测和重组率的测定 . 43 部文库的扩增 . 44 结 . 46 第三章 棉花恢复系幼蕾发育相关序列的初步筛选 . 47 料与方法 . 47 料 . 47 法 . 47 . 49 花恢复系幼蕾发育相关 . 49 切鉴定阳性克隆 . 49 花幼蕾中特异性表达基因序列分析 . 50 结 . 56 第四章 讨论 . 57 高 . 57 格防止 染，并设法抑制其活性 . 57 证 . 57 . 57 长 . 59 粒体的质粒样 . 59 第五章 结论 . 61 创新点 . 62 参考文献 . 63 致谢 . 68 作者简历 . 69 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 那霉素 苄青霉素 碳酸二乙酯 二醇双 (2四乙酸 乙烯吡咯烷酮 二烷基磺酸钠 二胺四乙酸 血清白蛋白 硫苏糖醇 EB 化乙锭 合酶链式反应 胞核雄性不育 胞质雄性不 育 达序列 家生物信息中心 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 从 20 世纪 70 年代开始，由于限制性内切酶的发现以及质粒等载体的应用，推动了 外重组技术的发展， 库构建是基因克隆的重要方法之一。 于克隆和大量表达，它不 像 基因组 有内含子而难以表达，因此可以从 库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达 （ 1993） 。它是发现新基因和研究基因功能的基础工具。 从 1976 年 功的构建了第一个 库以来，构建 库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期 库，由于当时技术条件的限制，选用质粒载体存在着合成效率低、难以扩增和保存等缺点，而 组 载体为表达型 库构建和保存提供了质的飞跃。 对提高 库的效价作出了贡献。近年来， 库构建的新方法、新技术虽多种多样、层出不穷，但其共同目的是使得 库构建 更加迅速、简便、高效、高质量、满足研究的需要。 库是指某生物某发育时期所转录的全部 反转录形成的 段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 库构建的基 本 原理是用 逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括 ： 提取 （ 例如热硼酸 /蛋白酶 K 法，异硫氰酸胍法，盐酸胍 酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定 )，要构建一个高质量的 库，获得高质量的 至关重要的， 所以处理 品时必须仔细小心。由于 存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸等这样的物理环境，因此建立一个无 的环境对于制备优质 很重要。在获得高质量的 ，用反转录酶 引导下合成 一链， 酶 H 和大肠杆菌 合酶 I，同时包括使用 菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 接酶进行的修复反应），合成接头的加入，将双链 隆到载体中去，分析入片 段 ，扩增 库、对建立的 文库进行鉴定。 1.1 库构建方法及其研究 将某一特定类型细胞表达的 转录形成与之互补的 将其和载体 组，并转化到宿主细胞里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。每个克隆只含一种 信息，足够数目克隆的总和则包含细胞全部 信息，这样的克隆群体叫 库。 像基因组 有内含子很难表达。所以在基因工程研究中，真核细胞的 库往往比基因组文库更为有用。 通 库 备 品 来源 品纯度对构 建出的 库的质量至关重要，从细胞总 分离纯化出中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 所占比例为 1%2%的 要利用绝大多数真核， 3末端都具有长度为 20250个腺 苷 酸组成的 A)尾巴这一结构特征 。 通过与偶联在惰性固相介质 （ 如磁珠、纤维素、琼脂糖及乳胶颗粒 ） 的 核 苷 酸退火，总 的 分通过其 3端 A)尾与 补杂交固定在固相介质上，从而能与总 其它成分分离，再采用优化的洗涤、洗脱条件处理，就可将结合在固相介质上的 离下来，制备 出符合 库构建要求的纯化 品。 成 一链 合成 定 了前 已 述及的模板 质量外便是反转录酶和引物。反转录酶有禽源反转录酶 (鼠源反转录酶 (种。鉴于 活性低，常是拷贝较长 子的更好选择，但 反转录效率高，故用得更普遍。近年来 司开发的基因工程 去了其 C 末端的 180 个氨基酸，不含 活性，更能保证 一链的全长和高产。反转录的引物常用 随机六聚体核 苷 酸。 （ 1） 导 成法 由 1220 个 成的人工合成寡核 苷 酸片段，与 末端的 A)尾退火后，即可用作引物，引导反转录酶以 模板合成互补 种方法基本被限定以 模板，当制备的 品混有少量 ，不会对构建出的库质量造成严重影响。但其只能从模板 端起始引发 合成，对于那些分子量较大而又有较 长 3端非编码区的 说，通常会丢失模板 端的重要序列信息。为了减少用 引物反转录合成过多的无意义的 A)尾，一种有效的变通方法是使用锚定 的 物 :5-( 11 M 为 的任一种， N 则为 4 种 脱氧核 苷 酸的任一种。因此合成出的是一个 3端随机的混合引物群体，在反转录过程中，通过 机残基的 锚定 作用，将引物的引发位点锁定在表达基因真正的 3末端，从而减少了无义的 A)尾部序列的反转录。 （ 2） 随机引物引导 成 随机引物是人工合成的由 4 种核 苷 酸残基随机组合而成的长度为 610 个核 苷 酸的寡核 苷 酸片段混合物，利用这一混合引物引导 成时，一条模板可能会同时杂交上多个引物序列，并在模板多处位点上同时引发 转录合成。因此，反转录反应的引发效率高，在同一模板上，可以合成出多条相互重叠的 段，能更高效地反映出表达 长的序列信息，从而提高了文库质量，常用于产生表达文库，加富长转录子的 5末端，或解决 到 级结构产生的麻烦， 但它不能保证一个拷贝中含有全长 列，特别是 3端序列区。另外，使用随机引物合成 需注意的一点是，这些引物不仅能以 模板进行反转录，也能以任何种类的 子为模板，因此，对来源 品的纯度要求更为苛刻。 链 转换合成 （ l） 自身引导合成法 反转录酶催化的反转录反应结束后，通常会使新合成出的单链 末端反转形成具有部分双链结构的发夹环形式。利用这一特点，在完成 一链合成并与模板 离后，就可以利用发夹环中的双链部分继续作为 引物，引导 合酶以 成出互补的第二链 应结束后，用 酸酶降解去除发夹环的单链部分，即可得到双链形式的 段。这一方法的主要缺点是在用 酸酶去除发夹环时的反应条中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 件要求极为苛刻，难以 控 制，目前己极少采用。 （ 2） 链置换法 首先利用 将杂交双链中的 板链在内部发生随机降解，形成多段短的仍与 一链保持互补杂交的 段。这些互补的 段可被 合酶用作引物，引导合成出与 一链互补的第二链 种合成反应在第一 链 板上多处同时引发，随着合成产物的延伸，除了 5末 端的 物外，所有作为引物的 段均被新合成的互补链所置换。通过 接酶作用，将模板上分段合成的互补链连接成一条完整的 ，最后通过分离去除残存的 5末端 段，并用 合酶削平 3端突出的单链形式的 可得到一个双链形式的 段。这种方法可直接利用第一链反应产物， 避 免了中间处理和纯化过程所造成的时间消耗和 失，并且无损于 5端。 （ 3） 同聚物引导法 即在第一链的 3端用末端转移酶加上一段同 聚 G，然后以 引物合成第二链。该法最大的缺点是获得的 端上游有一段 dG: 基，可能会抑制表达过程中 转录，并且会给双脱氧链终止法测序带来困难。 但 该法在最佳条件下可高效克隆 端序列。 链 克隆 克隆就是将合成出的双链 隆在载体上，并导入相应宿主细胞中。 （ 1） 修饰 修饰方法的选择主要依据连接方案而定。为了提高文库 段与载体的连接效率，早期使用的同聚物加尾法已被目前广泛使用的衔接头法代替。通常的做 法是给平端的双链 段添加衔接头。所谓衔接头是人工合成含有某种限制酶酶切位点的短的双链段，或者是一端为某种限制酶 黏 性末端的双链 段。用前一种衔接头连接后，需要经相应的限制酶酶切处理，才能使 段产生 黏 性末端，与相应限制酶酶切处理的载体 了避免限制酶对 段内部可能出现的酶切位点的切割，在添加衔接头之前，文库经甲基化酶处理，以保护内部可能出现的酶切位点。而添加后一类型的衔接头时，则不必对文库 行修饰处理。 采用普通添加衔接头的方式，文库 段与载体连接时的插入方向是随机的。这种克隆结果对非表达型 库的筛选并无影响，但对于表达 库的筛选，只有 1/6 的插入片段具有正常表达的可能性，无形中极大地降低了文库的可筛选容量。克服这一问题的途径是采用库定向克隆策略。一种做法是引导 一链合成的寡核 苷 酸引物的 5端预先设计一种限制酶酶切位点，在双链 成完毕后，再添加另一种限制酶酶切位点的衔接头。采用这两种酶进行双酶切后，就可使 段的两端产生两种不同的 黏 性末端，从而使文库 段能定向插入到克隆载体上。 另外，通过设计特定序列的衔接头，也能达到定向 插 入的目的。如用 引物合成的双链 3 端序列 ， 添加 衔接头，则在 创造出一个 酶切位点 (行双酶切，则可使双链 段的两端产生出两种内切酶的 黏 性末端，与相应双酶切的载体连接，就能定向插入到载体上。通过定向克隆构建的表达 库中，有 1/3 的插入片段具有正确表达的可能性。在定向克隆时，还可分别使用包含三种可能阅读框架的衔接头。用同一来源的 段 ，构建出三个相应的表达文库，就能使所有的 段获得表达筛选的可能性。 （ 2） 克隆 将制备的 隆到载体中去需考虑的关键问题是 载体的比例。必须寻找一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串联 子或产生过高的非重中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 组背景。为提高连接反应效率，可在连接混合物中加适量 成的 库一般应进行效价测定并扩增，以利多次筛选并长期保存。 长 库 构建全长 库，能够使人们通过一次阳性筛选，就可获得基因的全长序列，从而大大缩短了获取基因 的全长信息所需花费的时间。传统的 成方法通常都是利用 端的 A)尾巴，以 引物，通过反转录酶反转录合成 第一链。由于传统的反转录酶 常常不能反转录出全长 列，因此往往会造成 5 端的缺失，尤其是在 长或者具有复杂二级结构的情况下。为了更加有效地克隆新的基因，如何克服仅由 A)尾合成 术路线的局限性，以及由逆转录酶作用特点导致的局限性，建立富含全长 文库就显得非常有意义。 (1) 的帽子结构的利用 人利用 5 帽的结构特点，用细菌碱性磷酸酶(除无 5 端 护的部分降解的不完整 端的游离磷酸基因，再用烟草酸性磷酸酶 (除 5 的 成一段 ，继而利用修饰的 逆转录，并进行 应，称为 后克隆到载体建库。这种方法由于利用帽的位置及结构的特殊性，理论上在建库的克隆产物中即含有大量的全长 列，利用极其少量的组织或 库。其缺点是理论上会产生由于 化 增条件后尽可能减少了文库的代表性和冗余性。 报道一种称为 方法，能够非常有效地建立全长的 库。利用“帽结合蛋白”专门结合 帽结构，含有完整帽子结构的 富集。逆转录后用 作用于 合子，未被 合蛋白结合的“部分降解”的不完整 虽结合了“帽子结合蛋白”但 不完整的 被降 解，仅完整 有全长 一链结合保护的那些 保护，进一步纯化富集后建库，获得的克隆全长比例很高，但每次需极其大量的 100g )，另外，被帽结合蛋白结合的 端约 1050 丢失。 (2001)最近报道 方法，其原理是用过碘酸盐标记 5 的末端甲基化的后用免疫磁珠法分离并富集逆转录后全长的 行建库。标记的方法有其特殊性，即根据 5 末端帽结构上的 糖基团上有 2,3 邻位两个 团，可被生物素酰 肼作用并标记上生物素，而进一步被富集分离，作几次连接及扩增即可克隆入载体。结果可以得到相当长度的 95%为全长，得率和产量较前增加 1050 倍，并且由于不作 应，可减少理论上的偏移和冗余性。但该方法中 板在化学试剂及酶反应体系暴露时间较长，造成效率的降低，目前已有一些改进的方法。另外用 闭吸附用的柱子，也可能造成一些非特异的污染。 目前，也有些研究人员根据逆转录后的 大小进行分级，即通过凝胶电泳，只回收分子量较大的片段，这样，虽然建库的 量减少了，但可大 大提高所建文库中的较大插入片段的比例，有利于对较大基因进行克隆。 以上方法 逆转录都是在 37进行的，此温度不能解开 能形成的二中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 级结构，使逆转录酶不能通过二级结构区段，而得不到全长的 一链，这也是制约大基因全长 库的一个“瓶颈”。 (1998)报道，一种二糖海藻糖可以提高某些酶，如转录酶和 等的热稳定性 (热稳定效应 )，可提高耐热温度 5对某些酶还可在适当高温下增加酶的活性 (热激活效应 )。这可以减少逆转录过程中的二级 结构，增加全长其对较大基因 )第一链的合成比例。 ( 2 ) 导 二链合成法 在第一链 转录合成反应完成后，可利用核苷酸末端转移酶在 杂交体的 3 末端添加上多个 基，产生出一段列。通过碱性蔗糖密度梯度离心，使 交双链分离，并回收单链 入过量的 引物，通过 一链 3 端的 列退火杂交，从而引导合成出完 整的 二链。 (3)载体引导 合成法 首先用平端限制酶使克隆载体线性化，利用核苷酸末端转移酶在载体两条链的 3 端分别加上一段 列。处理后的载体与 体上的 A)尾互补，作为反转录酶的引物，引导合成出 一链，并通过末端转移酶在 端添加上一段 列。降解去除模板 碱性蔗糖密度梯度离心分离回收质粒两条链。这两条链的 3 末端都连上了一条新合成出 一链。分别用这两 条链 分子数绝对过量的， 3 端加有 列，并经变性处理的同一载体 过载体间的互补链及 交，形成一种环状的，带有大段缺口 (相对应于 一链部分 )的双链 于。最后用 将缺口填补的同时，合成出 成完整的环状的双链重组载体，可直接转化大肠杆菌，构建 库。 (4)置换合成法 首先用双酶切使载体线性化，其中的一种限制酶产生平末端。用末端转移酶在平末端的 3 上 与 合退火。以载体上的 引物，合成一链。再用末端转移酶在合成出的 末端加上 然后加入人工设计合成的一端带有 另一端则带有与载体上的粘性末端互补的接头，经 接酶处理，就形成一种含有 交体的杂合双链环状分子。再采用缺口平移反应，合成出 成含有全长 入片段的环状重组载体，直接转化大肠杆菌。用这一方法得到的是一个定向克隆的 库。 (5)模板链转换法 在反转录 反应过程中，当反转录酶催化 成到达 板的 5末端时，能够不依赖模板，继续在新合成的 末端添加数个脱氧核糖核苷酸残基 ( 1992; 1994 )。不同来源的反转录酶对添加核苷酸残基的性质有不同的偏爱性。缺失 活性的 I 重组反转录酶，则专一性地在新合成出的添加 3 基，利用这一特性。在 一链合成的反转录反应体系中加入一种人工合成的 3 端 为 寡核苷酸引物 (称为转换链引物， ，当I 反转录酶反转录合成 达模板 末端时，在 3 末端加上的 可与转换链引物中的 补，继续引导反转录酶以转换链引物为模板，延伸合成出一段与引物互补的序列。在 二链合成时，就可利用形成互补的转换链引物，通过 介导的链置换反应，置换 板，合成出与 一链完全互补的 二链，从而得到全长的双链 目前所报道的对全长 库的构建一般按 司 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 法或 剂盒 (用说明进行。判断一个 库中的列是否是全长基因的 要方法有以下几种。 5端：如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因 5末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第 1 个 次，判断是否有转 录起始点，一般加在 5帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是 序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的 5端是完整的。 3端：同样可以用其它生物已知的对应基因 3末端进行比较来判断，或编码框架的下游有