【毕业学位论文】（Word原稿）褐飞虱体内类酵母共生菌的营养功能及其分子基础的研究农业昆虫与害虫防治博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 褐飞虱体内类酵母共生菌的营养功能 及其分子基础的研究 I 摘 要 本文主要是针对褐飞虱 其体内类酵母共生菌营养相互关系研究中存在的若干问题进行研究，进一步详尽解读二者的共生关系。 利用本实验室研制出的稻飞虱全纯人工饲料饲喂技术，研究和建立缺菌稻飞虱的获 取与保持技术；在此基础上，采用人工饲料生测技术、现代仪器分析技术和蛋白质（酶）等研究手段，比较缺菌褐飞虱与正常褐飞虱的不同，初步分析与类酵母共生菌关系密切的营养物质相关代谢酶的基因，探讨类酵母共生菌与褐飞虱在氨基酸方面的营养供求关系。同时对类酵母共生菌在褐飞虱卵期的分布和其体外培养进行了研究，其 主要结果如下： 1. 褐飞虱类酵母共生菌从母体进入卵后的发展情况 褐飞虱卵期的石蜡切片结果可知：在卵的初期（ 1）类酵母共生菌主要以菌胞的形式存在，而且随着胚动过程由卵的后端移至前端，再移回卵后端，此过程中菌胞大小变化 不大；随着卵的发育，菌胞开始逐渐变大，到 5 天时已经开始向左右延伸，不再是规则的圆球状，菌的数量开始有明显的增多，到 时菌胞在虫体的上腹部已经明显分为左右两部分，共生菌在虫体腹部逐渐散开；到初孵 1 龄若虫时，共生菌几乎遍布虫体的整个腹部腹面，腹部背面也可见少数菌体。 2 龄初期可清晰的看到共生菌在腹部的每个腹节中又聚集呈一个个小菌胞。 每个类酵母共生菌个体都有明显的细胞壁包被，细胞壁的外围又有明显的界限使之与外界隔开，并且菌群周围和菌体之间多以一种小泡状细胞包围。同时，在电镜下发现一种棒状物，总是与 密 相邻，并发生部分交叉，周围也多以小泡状细胞围绕，推测二者之间可能存在某种紧密联系。另外，并不是所有的 聚集在一起，少数菌体游离在 群之外单独存在，表明褐飞虱体内 群没有蚜虫体内含菌体外层的完整被膜保护层。 2. 褐飞虱减菌技术 通过对同龄试虫的不同高温处理和对不同龄期试虫的相同高温处理得出：要想得到理想的高温减菌试虫，需要综合考虑处理温度，处理时间，试虫虫龄，实验季节等多种因素。适合本地区（浙江杭州）的处理方法为：选用 35 温对低龄若虫连续处理 3 天。同时发现，试虫体内的共生菌数量多少与 褐飞虱能否羽化密切相关，根据试验数据推测出试虫羽化所需最低共生菌数量要 5000 /重。 人工饲料中添加一定剂量的一种或两种抗生素的减菌效果虽不是很理想，但抗生素在一定程度上有利于保持高温处理试虫的缺菌特性 。 3. 类酵母共生菌与氨基酸营养的关系 利用全纯人工饲料饲喂技术，研究了各种氨基酸对缺菌褐飞虱生长和共生菌数的影响以及虫体氨基酸分析和主要转氨酶的活性变化等几个方面： （ 1） 缺失不同氨基酸对高温 (35C)处理后的缺菌褐飞虱相对生长率、体内共生菌数量有不同 度的影响，其中 10 种必需氨基酸对缺菌褐飞虱生 长的影响明显大于 10 种非必需氨基酸， 饲料中必需氨基酸的缺少对褐飞虱（特别是高温处理褐飞虱）体内共生菌数量有一定的刺激作用。 （ 2） 分析了缺菌试虫体内氨基酸组成的变化，发现在摄取氨基酸营养相同的条件下（用全纯饲料 养），高温处理试虫体内蛋白质氨基酸组成无明显变化，而游离氨基酸总量明显上升，且必需氨基酸所占比例显著下降， 其中组氨酸（ 异亮氨酸（ 亮氨酸（ 赖氨酸（ 蛋氨酸（ 苯丙氨酸（ 摩尔百分含量均显著下降，表明必需氨基酸的相对缺乏可能是体内蛋白质合成受阻的一个 重要原因，推测这可能是由于试虫体内共生菌数减少致使所合成的必需氨基酸减少而引起 。 同时，人工饲料中 缺失试验中试虫的氨基酸分析进一步表明多数必需氨基酸与共生菌存在紧密联系。 （ 3） 处理试虫体内谷氨酰胺合成酶（ 谷丙转氨酶（ 性明显提高，谷草转氨酶 (性显著降低，结合谷氨酰胺（ 著上升，推测类酵母共生菌可能利用谷氨酰胺为“原料”进行氨基酸的合成。 （ 4） 采用简并 法从类酵母共生菌基因组中扩增出与 成代谢过程中的关键酶 异丙基苹果酸合成酶和 成过程中的起始酶 成酶高度相关的基因片断，初步判断类酵母共生菌的基因组中含有这两个代谢酶的相关基因序列。 4. 类酵母共生菌的体外培养 通过正交试验设计，参考多种真菌培养基的组成成分和浓度配制了三批培养基对褐飞虱类酵母共生菌进行体外培养。结果得到一种形态与褐飞虱体内的 其相近的酵母样菌，但通过18分片断的相似性比较得出，二者的相似率小于 95。 根据微生物分类上的一般标准，初步判断：所培养出的酵母样菌体不是来自于褐飞虱体内的类酵母共生菌。 关键词： 褐飞虱，类酵母共生菌，高温，氨基酸，体外培养 t in It is to On of be as to PH on LS be so it to to LS PH be on At LS in PH LS in as 1. LS in of LS LS in of to of go to LS in to in LS .5 to of in PH LS of to to in of LS an a of or LS of LS LS LS LS a LS 2. of of PH be by to 5 36 by of LS in LS in LS PH in it to or in to It LS on It 000mg PH to of or in to LS PH so as it to IV by 3. LS of to PH of PH on 1) PH by 35C) on 0 of of PH of PH LS in on 2) in PH on no on in of of of of of an on of PH on eu he 3) of LS as to 4) by CR LS it LS of 4. LS in 0 of to LS in a LS of 8LS 5%, LS in V 目 录 摘 要 . I . 一章 文献综述：同翅目昆虫体内共生菌的研究进展 . 1 生菌的基本特性 . 1 虫体内共生菌的基本特征 . 1 飞虱体内类酵母共生菌的基本特征 . 3 虫与共生菌营养关系的研究途径 . 6 养生物学途径 . 6 子生物学途径 . 6 生菌对宿主昆虫的营养作用 . 6 素营养的合成 . 6 与脂类物质的合成 . 9 生素的合成 . 10 供能源 . 11 主对共生菌的调控 . 11 主蚜虫对共生菌控制的机制 . 11 主稻飞虱对共生菌控制的机制 . 12 束语 . 12 第二章 论 文研究目的、意义和技术路线 . 14 研究的目的和意义 . 14 技术路线 . 15 第三章 类酵母共生菌在褐飞虱卵期 的分布 . 16 料与方法 . 16 试材料 . 16 验方法 . 16 果与分析 . 17 论 . 23 第四章 褐飞虱高温减菌技术的研究 . 24 料与方法 . 24 料 . 24 法 . 24 果与分析 . 25 同温度处理下试虫及其体内共生菌数的变化 . 25 35高温对不同龄期试虫及其体内共生菌数的影响 . 27 温处理对不同季节试虫共生菌影响的差异 . 29 003 年 7份田间温度变化及各代褐飞虱初羽化成虫体内共生菌数的变化 . 30 论 . 32 第五章 褐飞虱类酵母共生菌的抗生素减菌技术 . 34 料与方法 . 34 试昆虫及饲养方法 . 34 同抗生素对褐飞虱体内共生菌数及宿主昆虫的影响 . 34 生素对经高温处理后试虫的影响 . 34 据分析 . 35 果与分析 . 35 生素对试虫及其体内类酵母共生菌数的影响 . 35 抗生素对高温处理试虫的减菌效果 . 38 论 . 39 第六章 人工饲料中氨基酸缺失对褐飞虱及体内共生菌的影响 . 40 料与方法 . 40 试昆虫及其处理 . 40 飞虱相对生长速度的测定 . 40 飞虱体内共生菌的观察 . 40 据分析 . 40 果与分析 . 41 工饲料饲养试虫体内共生菌的数量变化动态 . 41 虫相对生长速度的变化 . 42 虫体内类酵母共生菌数量的变化 . 45 论 . 47 第七章 高温处理对褐飞虱体内氨基酸组成及氨基代谢酶的影响 . 48 料与方法 . 48 试昆虫及其处理 . 48 飞虱体内氨基酸含量的测定 . 48 生素对试虫体内游离氨基酸组成的影响 . 49 飞虱体内主要氨基转移酶活性测定 . 49 据分析 . 49 果与分析 . 49 组分饲料上褐飞虱试虫体内氨基酸含量的比较 . 49 失 工饲料上试虫体内氨基酸的变化 . 54 失 工饲料上试虫体内游离氨基酸的变化 . 57 抗生素处理试虫体内游离氨基酸的变化 . 60 飞虱体内 氨酶活性的变化 . 62 论 . 63 第八章 氨基酸代谢过程中相关酶的基因片断克隆 . 66 料与方法 . 67 酵母共生菌的分离和基因组提取 . 67 成酶基因片断的引物设计 . 68 断扩增 . 68 物回收 . 68 收产物 载体连接 . 69 化大肠杆菌 . 69 粒 小量提取（碱裂解法） . 69 源片段插入的检测 . 70 列测定 . 70 果与分析 . 70 成过程中关键酶的 果 . 70 成过程中起始酶的 果 . 71 论 . 73 第九章 类酵母共生菌体外培养的初步研究 . 74 料与方法 . 74 种来源 . 74 养基配制 . 74 外培养物的鉴定 . 76 果与分析 . 76 论 . 78 第十章 结 论 . 82 参考文献 . 86 附录 . 97 致 谢 . 102 作者简历 . 103 中国农业科学院博士论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述：同翅目昆虫体内共生菌的研究进展 同翅目昆虫体内普遍存在共生菌。由于此类昆虫以吸食植物的汁液为食，而植物汁液的营养很不均衡，一般认为昆虫体内的共生菌与昆虫的营养需求有密切关系，主要是为宿主昆虫提供必需氨基酸、维生素，以及固醇类物质（ 1980； ， 1984； 1985； 1999； 傅强等， 2001c； ， 2003） 。人为地减少虫体内共生菌的数量，会导致宿主昆虫生长发育延迟、存活率和羽化率降低、羽化后成虫体重减轻、产卵量下降等不良反应（ 1979； ， 1981b；戴华国等， 1997；傅强等， 2001；吕仲贤等，2001）。 鉴于此类昆虫在农业上的重要性，昆虫体内共生物的研究具有很大的理论意义和潜在的利用价值。深入研究共生菌与宿主昆虫的共生关系，可以阐明 昆虫生息繁衍的本质，揭示昆虫与共生菌的协同进化机制， 同时有望通过人为调控共生菌与宿主昆虫的共生关系或对 内共生菌进行基因改造， 开拓害虫防治的新途径。 目前，有关同翅目昆虫体内共生菌的研究 主要集中 在蚜虫和飞虱，下面就两种昆虫体内共生菌的基本特性和营养功能等方面进行介绍。 生菌的基本 特性 昆虫体内的共生菌主要分为三类：细菌、立克次氏体和酵母（ 1949）。已知蚜虫和飞虱体内与营养有关的共生菌类型不同，蚜虫体内共生菌属于细菌类，而飞虱共生菌属于真菌类。下文将对两种共生菌的基本特征分别进行介绍。 虫体内共生菌的基本特征 态特征及胞内共生现象 蚜虫体内的菌胞共 生细菌 蚜虫体内的主要共生菌：菌体球形或卵球形、平均直径 米（ ， 2002）、细胞壁 ， 1995）、缢裂生殖（ ， 1980）。 昆虫胞内共生现象的主要特征为： 1）微生物生活在寄主细胞内，且被局限在一个细胞的细胞质内，该细胞称为含菌细胞（ 简称菌胞。 2）微生物一般通过 二均裂的方式进行繁殖， 并通过昆虫母系传递在昆虫代间垂直传递（ 1980）。 3）这种共生关系对昆虫及其微生物伙伴都是必不可少的（ 1988）。 在位置 同翅目昆虫的共生菌，除了在短期的卵巢感染阶段外，很少在含菌细胞以外发现（ 980） 。少量进入血腔的细菌会被吞噬细胞吞噬或破坏（ ， 1973； 1971） 。在所有蚜虫体内， 在于蚜虫血腔的含菌细胞中，含菌细胞在蚜虫体腔中的两叶状结构被称中国农业科学院博士论文 第一章 文献综述 2 为含菌体（ ， 1987， 1988， 1989）。若蚜体内的含菌体被一薄层扁平的细胞形成的保护套保护，进入大龄若虫或成蚜后，保护层破裂，菌胞分散在整个腹腔（ ， 1987； 1990