【毕业学位论文】（Word原稿）共轭亚油酸高转化量菌株筛选及其酶学性质研究乳品微生物与发酵工程博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 共轭亚油酸高转化 量 菌株 筛选 及 其 酶学性质 研究 on on I 摘 要 共轭亚油酸（ 含有共轭双键的亚油酸（ 种异构体的总称，由于其令人瞩目的生理功效，已成为国内外研究的焦点。 本实验 从乳制品常用发酵剂入手，探索 一条通过 菌株 筛选，亚油酸异构酶的分离纯化以及酶促工艺研究为主要线索的 物合成的途径。 本论文的主要实验结果如下： 实验采用气相色谱（ 紫外分光光度（ 结合的方法测定标准品中 含量。结果表明：两种方法测定的已知浓度 含量 符合 方程： y=1+其中 V 测定的 量， y 为 法测定的 量）。 通过对拟合方程 的 验证，结果表明 g/围内，样品经拟合方程换算的浓度与 定结果相近 。 是一种 可以快速、准确地测定发酵液中 异构体总量 的检测方法 。 P. 酵液中 主要异构体为 在 乳酸钠、 P. P. 具有生成 能力 。菌液浓度（ 1， 葵花籽油浓度 12 mg/种量 2%（ v/v），30 微氧 培养 36 h， P. 化生成 最大为 g/转化率为 微氧条件有利于 生成 与 积累 。 在三种培养基质中葵花籽油对 两株菌 的生长均有明显的抑制作用，抑制作用的强弱与 生成量成反比。 24 株 实验室保存的 乳酸 菌 中 7 株具有转化 葵花籽油中 成 能力。 经传统的分离纯化方法和 0 酸菌鉴定系统，确定具有 成能力的菌株分别 为植物乳杆菌（ 唾液乳杆菌 （ 和乳酸乳球菌乳酸亚种（ 其中 L. 化 生成 能力最强。 在 脱脂乳培养基 中 ，L. 液浓度（ 1， 葵花籽油浓度 6 mg/种量 2%（ v/v）， 37 微氧 培养12 h， L. 化生成 最大为 g/ 化率为 有氧和 微氧条件 下L. 化生成 能力相同，但微氧条件 有利于 量的 保持 。 采用盐析、 200胶过滤层析 ， 子交换层析对来源于L. P. 油酸异构酶进行提取纯化的研究 并 分别建立了 分离提取步骤 及其 酶学特性 的研究 。 P. 油酸异构酶的最适 为 适反应温度是 30 ， M， g/子量约为 56 L. 为 适反应温度是 为 50 ， M， g/子量为 通过 高效液相色谱（ 电喷雾离子化 /质谱（ 结合的方 法 得到了 L. . 油酸异构酶的 氨基酸序列 。结果表明 来源于 L. P. 油酸异构酶 （ 的全氨基酸序列不同，但两者具有 一定的 同源性。 在谱库中 检索到与 本实验得到的亚油酸异构酶 最接近的蛋白分别为 3 磷酸甘油脱氢酶和 一种 膜结合蛋白，因此本实验得到的亚油酸异构酶 不同于已经报道的异构酶 。 L. A 生成 转化率比 L. A 生成 转化率高， 在 不同 条件下 成量的顺序为 超临界 微氧条件 有氧条件。 通过 超临界状态下 对 L. 油酸异构酶催化 成 程单因素和三 因素二次通用旋转组合设计 实验 ， 得到 了 最优的酶催化法生成 条件为：反应时间 1 h，反应温 度 ，压力为 25 此条件下 量为 mg/白 ，转化率为 从本文结果可以看出， L. 有较强的转化生成 能力， 在超临界条件下在较短时间内即可得到较高的 化率，因此 L. 油酸异构酶具有广阔的研究价值和发展前景。 关键词 ： 共轭亚油酸（ ， 植物乳杆菌（ L. ， 费氏 丙酸杆菌费氏亚种（ P. ， 亚油酸异构酶 ， 超临界二氧化碳 to a of of to in by it of of is to in of LA by of as V 33 nm to V LA y=x y 33 to on LA V C. y=1+x LA V y LA C V an to LA . . to LA in to LA in of g/6 h of RS 2 mg/mL . of by a LA to At it . . in in of LA 4 to of PI LA LA g/by . in mg/LA in in of . . 0% 200, an 6. a IV 5 . pH . .0 0 . m of M g/pH . .5 0 . m of M g/. . S S of . to . . . of of In to LA a LA mg/mg h, 5 L. to LA . we A LA a . be to L. P. V 目 录 英文缩略表 . 一章 绪论 . 1 构与功能 . 1 构 . 1 天然分布 . 2 生成机理 . 2 影响 量的因素 . 4 生理功能 . 7 代谢与安全 . 8 化学合成方法 . 9 异构化法 . 9 蓖麻醇酸甲酯脱水作用 . 11 溴化 /脱溴化氢法 . 11 物合成法生产 . 12 物合成法生成 反应机制 . 12 胃微生物生成 研究 . 13 酸杆菌生成 研究 . 13 酸菌生成 研究 . 14 油酸异构酶的研究现状 . 15 的制备技术及酶促反应研究 . 17 检测方法 . 17 紫外分光光度法 . 18 气相色谱法 . 18 银离子高效液相色谱法 . 18 气 . 19 在的问题及对策 . 19 验内容和设计 . 20 第二章 测方法的确立 . 22 言 . 22 料与方法 . 22 主要仪器和试剂 . 22 准液的制备 . 23 脂肪酸甲酯的制备 . 23 气相色谱检测条件 . 23 紫外可见分光光度法检测条件 . 23 样品的准备、脂肪酸的提取与分析 . 23 数据分析 . 24 果与讨论 . 24 对 测定 . 24 对 测定 . 25 线性与非线性拟合曲线的建立 . 26 拟合方程的验证 . 27 论 . 29 第三章 转化量丙酸杆菌的筛选及反应条件研究 . 30 言 . 30 料与方法 . 30 主要仪器和试剂 . 30 菌种 . 31 培养基的制备 . 31 发酵方法 . 31 脂肪酸的提取及测定方法 . 31 菌液生物量的测定方法 . 31 计算方法 . 31 数据分析 . 32 果与讨论 . 32 发酵液中 组成 . 32 不同培养基质中葵花籽油浓度对 成的影响 . 33 不同基质中培养时间对 成的影响 . 35 不同基质中葵花籽油浓度对费氏丙酸杆菌生长的影 响 . 37 氧气对 成的影响 . 39 论 . 40 第四章 转化量乳酸菌的筛选鉴定及反应条件研究 . 42 言 . 42 料与方法 . 43 主要仪器和试剂 . 43 菌种 . 43 培养基的制备 . 43 菌株的纯化培养 . 43 测定方法 . 44 具有 化能力的乳酸菌的筛选 . 44 乳酸菌的鉴定及其生化特征的观察 . 44 数据分析 . 44 果与讨论 . 44 具有 化能力乳酸菌的筛选 . 44 具有 化能力乳酸菌的鉴定 . 45 酵液中 组成 . 48 花籽油对 成的影响 . 49 养时间对 成的影响 . 50 气对 成的影响 . 51 论 . 52 第五章 亚油酸异构酶的分离纯化 . 53 言 . 53 蛋白质分离纯化方法 . 53 亚油酸异构酶分离纯化方法 . 54 料与方法 . 54 菌种 . 54 主要仪器与试剂 . 54 菌体细胞的培养与收集 . 55 菌体细胞的破碎 . 55 菌体细胞 破碎效果观察 . 55 硫酸铵分级沉淀 . 56 盐析及浓缩处理 . 56 F 离子交换层析 . 56 胶过滤层析 . 56 酶活的测定 . 56 蛋白质含量的测定 . 57 定酶纯度 . 57 果与讨论 . 57 菌体细胞破碎方法 . 57 硫酸铵分级沉淀 . 59 离子交换